法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2016-03-16
授权
授权
2014-04-09
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N15/02 申请日:20080416
实质审查的生效
2014-03-12
公开
公开
此案是申请日为2008年04月16日、中国申请号为200880020525.4、 发明名称为“使粒子在微通道中聚集的系统和方法”的发明申请的分案申请。
相关申请
本申请要求2007年4月16日提交的名称为“Methods and Devices for Separating and Focusing Particles”的美国临时申请60/923,609、2007年4月 17日提交的名称为“Methods and Devices for Separating and Focusing Particles”的美国临时申请60/923,837、2007年10月16日提交的名称为 “Methods and Devices for Separating and Focusing Particles”的美国临时申请 的优先权，在此引入所述三个申请的全部内容作为参考。
发明背景
工业、医学领域的大量技术方案以及研究当中应用了粒子分离和过滤。 工业应用包括化学加工和发酵过滤、微电子行业的水净化、以及废水处理。 生物医学应用集中于统计、分选和过滤血液的各种成分以及安全制备分级的 微泡超声造影剂(micro-bubble ultrasound contrast agent)。基础研究和应用研 究方面的应用包括浓缩胶态溶液、纯化胶态反应产物、以及纯化和浓缩环境 样品。
已开发出多种用于这些应用的宏观粒子分离技术。在目前的工业应用中 基于离心和过滤的技术由于可处理大量物质而最为常用，但这些系统体积庞 大、价格昂贵且可能包含复杂的活动部件。近来，已开发出用于各种应用的 基于场流分离(field-flow fractionation)(FFF)构思的技术。在这些技术中，粒 子分离基于在外加力场下在通道内平衡位置的不同或传输速度的不同。实际 当中应用了各种外源场，包括重力场、电场、磁场和离心场，从而得以成功 地实现血液成分、乳液和各种胶体的分离。一种密切相关的技术——流动色 层分析法(hydrodynamic chromatography)也广泛用于分析分离(analytical seperation)，该方法基于粒子进入低阻流动区域的能力不同，这种不同与尺 寸相关。在大多数情况下，通过这些系统的最大流量有限，因为作用力需要 足够的时间与粒子相互作用或者粒子需要足够的时间对流场进行取样。与其 它技术相比，流式细胞测定器常常用于分选应用并能够基于不同的参数(例 如蛋白质含量、粒度)实现分选，然而流式细胞测定器的复杂性高于大多数 分选系统。
微观技术提供的优势在于：尺度减小使得能够利用独特的流体动力学效 应并增强电磁分离力。已利用了介电电泳力基于尺寸或某种介电标记区分粒 子。其它连续分离技术依赖于层流分布(laminar flow profile)和对准壁面的不 同尺寸粒子不同的交叉流动截面。其它微观技术采用基于尺寸使粒子方向分 岔的精密设计的过滤器或后阵列(post array)。这些技术可基于粒子的尺寸或 介电性能形成非常精确的分离。例如，对于不对称排列的障碍物造成的决定 性的偏移，据记载对于直径为～1μm的粒子分辨率小于20nm。另外，在这 些系统中复杂性能够降低。
目前的微观分离技术的缺点在于尺度(scaling)通常会限制这些技术的处 理量。在大多数情况下，使粒子的体积分数良好地保持在1%以下，因为粒 子与粒子的相互作用可显著地影响性能。另外，小的体积流速可造成微通道 中大的平均流体速度，进而导致分离力作用于粒子的时间不足。这些系统的 流速通常为1至50μL/min，这对于许多制备应用而言是不足的(例如大量血 液中稀有细胞的聚集、超声造影剂的过滤、或大量胶体/乳液的制备)。在这 些应用中，有利的是在数分钟内处理3-20mL的体积。例如，常常注入2-6mL 的微泡造影剂用于超声成像(ultrasound imaging)。
因而，需要连续粒子分选、分离、计数或分离系统，该系统可应用微观 物理但具有与宏观系统相当的处理量。
发明内容
本发明包括引起并利用粒子的自有序化(self-ordering)的多种系统、装 置、设备和方法，所述粒子悬浮于移动通过微流体通道的流体。第一方面， 提供使悬浮于移动流体的粒子聚集在一条或多条局域化流动线路(localized stream line)中的系统。该系统包括基底和设置于基底上具有入口和出口的至 少一条通道。该系统还包括包含悬浮粒子以层流方式沿通道移动的流体和驱 动流体层流流动的泵送元件。流体、通道和泵送元件经布置以使惯性力作用 于粒子并使粒子聚集在一条或多条流动线路中。
另一方面，提供使移动流体中的粒子聚集的方法，该方法包括：向通道 提供悬浮于移动流体的粒子，在使得作用于粒子的惯性力在通道中引起粒子 流局域化的条件下，使流体流动通过通道。
又一方面，提供使悬浮于移动流体中具有预定尺寸的粒子聚集在一条或 多条局域化流动线路中的设备。该设备包括基底和设置于基底上具有入口和 出口的至少一条通道，其中包含预定尺寸的粒子的流体悬浮液以层流方式从 入口移动至出口使得所述预定尺寸的粒子聚集在一条或多条局域化流动线 路中。
再一方面，提供从悬浮于流体的粒子群中分选粒子的系统，该系统包括 标记系统，所述标记系统用于标记待从粒子群中分选出的粒子。该系统还包 括基底，所述基底上设置有具有入口和出口的至少一条通道。包含粒子的流 体悬浮液以层流方式从入口移至出口使得粒子聚集在一条或多条局域化流 动线路中，所述粒子中的至少一部分已被标记。出口可具有至少两条输出分 支，第一条输出分支用于分离待分选的粒子，第二条输出分支用于输出未分 离的剩余粒子。该系统还可包括与通道操作连接的分选系统，所述分选系统 用于将粒子选择性地分流至第一输出分支。
最后一方面，提供从粒子群中分离目标粒子的方法，该方法可包括：向 流体悬浮液提供包括目标粒子的粒子群，在使得至少一部分粒子在通道中形 成局域化粒子流的条件下使流体悬浮液流动通过至少一条通道。该方法还可 包括将通道的输出分为第一输出分支和第二输出分支，其中所述输出分支经 布置，以使第二输出分支接收富集目标粒子的液流，而使第一输出分支接收 目标离子减少的液流。
所述任意方面的具体实施方案可包括：移动流体悬浮液能够使粒子聚集 在四条局域流、两条局域流和/或一条局域流中。通道可具有水力直径 (hydraulic diameter)，且聚集粒子的尺寸与水力直径之比大于或等于约0.07。 粒径与水力直径之比可小于或等于约0.5。在一些实施方案中，聚集过程中 流体流动的雷诺准数可大于或等于约1且小于或等于约250。在一些实施方 案中，移动通过通道的流体悬浮液的粒子雷诺准数大于或等于约0.2。一条 或多条聚集流动线路的宽度小于或等于聚集粒子尺寸的约5倍、4倍、3倍、 2倍和/或1.05倍。该系统的实施方案可提高溶液中粒子的浓度。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，在通道的出口部分可形 成至少第一和第二出口分支，第一和第二出口分支中的至少一个可位于基底 上以接收来自聚集流动线路和/或单条局域流的粒子。在一些实施方案中， 通道可具有矩形截面。在其它实施方案中，矩形通道的宽度可小于或等于约 1000微米、650微米、100微米、80微米、65微米、50微米、20微米和/ 或10微米。
在任意方面中，实施方案可包括粒子为细胞的实施方案，包括哺乳动物 细胞、血细胞、肿瘤细胞和/或细菌细胞。另外，矩形截面的宽高比可致使 粒子聚集在两条流动线路中。粒子聚集在一条或多条局域化流动线路中可使 粒子在纵向上基本均匀地间隔。在一些实施方案中，第一矩形尺寸与第二矩 形尺寸的宽高比可为约0.3至0.8。在其它实施方案中，所述宽高比可为约1 至2。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，所述系统可包括至少一 条通道，该通道成曲形并且是对称的且为反曲形。在其它实施方案中，通道 可以是不对称的且为反曲形。聚集流在通道中的位置可取决于作用于粒子的 惯性力和狄恩阻力。所述位置还可取决于作用于粒子的离心力。流动通过通 道的狄恩准数可小于或等于约20。在该系统的一些实施方案中，曲率半径 可以是变化的和/或可在曲形的各拐点之后改变。通道的截面尺寸可以是变 化的并可在曲形的各拐点之后改变。在一种实施方案中，通道可形成螺旋。
在其它实施方案中，可在基底上设置多条通道并可布置所述通道中的至 少一部分以允许串行流动。可在基底上设置多条通道，第一通道可具有分别 通向第二通道和第三通道的第一输出分支和第二输出分支。可布置至少两条 通道以聚集具有不同预定直径的粒子。该系统可包括探测器，该探测器用于 对一条或多条聚集流动线路中的粒子进行探测和计数并用于对单条局域流 中的粒子进行探测和计数。该系统还可包括标记系统，所述标记系统利用探 测器可探测到的标记对所选粒子进行标记，进而探测器对所选粒子进行探测 和计数。在任意和所有方面中，实施方案可包括由惯性力单独引起聚集的系 统。其它实施方案可包括由惯性力和其它力引起聚集的系统。
在任意方面中，其它实施方案可包括聚集粒子的方法，其中通过通道的 流体流动为层流流动且其中所述流体流动的雷诺准数为约1至250。聚集可 形成局域化粒子流，该局域化粒子流富集基于粒径的第一粒子。第一粒径除 以通道的水力直径可大于或等于约0.07且可小于或等于约0.5。在一些实施 方案中，通道具有矩形截面、高度和宽度，水力直径等于2×高度×宽度/(宽 度+高度)，且矩形截面具有约0.3至0.8和/或约1至2的宽高比。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，聚集粒子的方法可包括 向粒子施加不对称的力以形成1至3条局域化粒子流。不对称的力可包括但 不限于离心力、流体动力阻力、电力、磁力、热力、声波力、光学力或介电 电泳力。在一些实施方案中，不对称的力可包括等于或大于约0.5nN的狄恩 阻力。粒子可包括但不限于细胞、珠体、病毒、细胞器、纳米粒子和分子络 合物。细胞可包括但不限于细菌细胞、血细胞、癌细胞、肿瘤细胞、哺乳动 物细胞、真核单细胞、植物细胞和真菌细胞。
在任意方面，实施方案还可包括聚集粒子的方法，其中通道成曲形并且 其中移动流体的狄恩准数小于或等于约20。曲形通道可以是反曲形和/或螺 旋状。在其它实施方案中，曲形通道可以是反曲形且不对称，曲率半径从反 曲形的一个拐点至反曲形的下一个拐点可以是变化的。在一些实施方案中， 第一半径的曲形之后可以是更大半径的曲形。第一半径的曲形所施加的狄恩 阻力可以是更大半径的曲形所施加的狄恩阻力的约8倍。在其它实施方案 中，通道可具有矩形截面形状且矩形截面形状的至少一个尺寸在反曲形的拐 点之间可以是变化的。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，聚集粒子的方法可包括 将移动流体从通道送入至少两个输出分支，其中设置一个输出分支以便接收 富集给定尺寸的第一粒子的局域化粒子流。接收局域流可因而提高溶液中第 一粒子的浓度。在一些实施方案中，该方法可包括将移动流体从通道送入至 少两个输出分支，其中设置一个输出分支以便接收富集给定尺寸的第一粒子 的局域化粒子流。可使用探测器以对通道内在局域化粒子流中迁移的粒子进 行计数。该方法还可包括标记系统，所述标记系统用可通过探测器探测的标 记对选定的粒子进行标记，进而探测器对选定的粒子进行探测和计数。在任 意和所有方面中，该方法可包括由惯性力单独引起聚集的系统。其它方法实 施方案可包括由惯性力和其它力引起聚集的系统。
在任意方面，实施方案可包括通道的截面形状和面积从入口至出口保持 一致的设备。在其它实施方案中，通道的截面形状和面积从入口至出口可以 是变化的。一条或多条局域化流动线路的宽度小于或等于预定粒径的5倍、 4倍、3倍、2倍和/或1.05倍。含有预定尺寸的粒子的流体悬浮液从入口移 至出口使得所述预定尺寸的粒子聚集在四条局域流、两条局域流和/或单条 局域流中。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，该设备还可包括在通道 的出口部分形成的至少第一和第二出口分支，所述第一和第二出口分支中的 至少一个位于基底上以便从单条局域流接收预定尺寸的粒子。在一些实施方 案中，矩形截面的宽高比使得粒子聚集在两条流动线路中。此外，粒子聚集 在一条或两条局域化流动线路中可使粒子在纵向上基本均匀地间隔。在其它 实施方案中，聚集流的位置取决于作用于粒子的惯性力和狄恩阻力。所述位 置还可取决于作用于粒子的离心力。
在任意方面中，实施方案可包括通道的截面尺寸变化的设备。在一些实 施方案中，通道的截面尺寸在曲形的各拐点之后改变。可将多条通道设置在 基底上并可布置所述多条通道以允许并行流动。在其它实施方案中，可将多 条通道设置在基底上，并可布置所述通道中的至少一部分通道以允许串行流 动。可将多条通道设置在基底上，第一通道可具有分别通向第二通道和第三 通道的第一输出分支和第二输出分支。可布置所述通道中的至少两条通道以 聚集具有不同预定直径的粒子。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，该系统还可包括标记系 统，所述标记系统可以是无源分选系统(passive sorting system)。所述标记系 统可将标记施用于待分离的粒子，所述标记具有可通过分选系统脱离聚集粒 子流的特性。标记可增大粒子尺寸，分选系统可包括基于尺寸将粒子分流到 第一输出分支和第二输出分支中的通道几何结构。在一些实施方案中，标记 可具有磁性，分选系统可包括偏磁元件(magnetic biasing element)，该偏磁元 件向标记粒子施加力，使得标记粒子从第二输出分支转向第一输出分支。在 其它实施方案中，标记可具有电性能，分选系统可包括施加于标记粒子的电 泳力，该电泳力使得标记粒子从第二输出分支转向第一输出分支。分选系统 可包括亲和层析柱(affinity column)，该亲和层析柱使得标记粒子从第二输出 分支转向第一输出分支。
在任意方面中，实施方案可包括分选系统，所述分选系统为有源分选系 统且还可包括选择性地使标记粒子从第二输出分支转向第一输出分支的控 制器。分选系统还可包括探测标记粒子的探测器，该探测器与控制器操作连 接以向控制器发出存在标记粒子的信号以进行转向。探测器可以是荧光探测 器，标记可以是荧光标记。
在任意方面中，分选系统的一些实施方案还可包括通道阻力驱动器 (channel resistance actuator)，通道阻力驱动器由控制器选择性地驱动以使标 记粒子从第二输出分支转向第一输出分支。通道阻力驱动器可与第一输出分 支连接以降低第一输出分支的流体阻力，从而使标记粒子从第二输出分支转 向第一输出分支。在一些实施方案中，通道阻力驱动器可与第二输出分支连 接以提高第一输出分支的流体阻力，从而使标记粒子从第二输出分支转向第 一输出分支。通道阻力驱动器可以是微型阀(microvalve)，该微型阀部分地开 放或闭合以改变输出分支的流体阻力。在其它实施方案中，通道阻力驱动器 可拉伸或压缩通道的尺寸以改变输出分支的流体阻力。在任意方面中，粒子 可以是细胞，可基于细胞的特性对细胞进行分选。在一些实施方案中，待分 选细胞的特性是存在至少一个癌症标识(indicator)。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，可提供从粒子群中分离 目标粒子的方法，其中分离以无源方式进行。目标粒子可具有与粒子群中其 它粒子不同的尺寸，且目标粒子可在通道内的预定位置形成局域流。在一些 实施方案中，可设置第一输出分支的入口以便包括局域化目标粒子流在通道 内的预定位置。该方法的实施方案还可包括通过与通道操作连接的分离系统 用标记选择性地标记粒子。标记可增大选择性标记粒子的尺寸，且标记可以 是磁性标记。
在任意方面，实施方案还可包括分离系统利用磁场使目标粒子朝向第一 输出分支并使其它粒子朝向第二输出分支的方法。该方法可包括通过分离系 统探测标记或标记粒子，通过分离系统使标记粒子分流到选定的第一输出分 支或第二输出分支中。分离系统可包括与通道操作连接的探测器、与第一输 出分支和第二输出分支中的至少一个操作连接的流体变阻元件(fluid resistance varying element)、与探测器和流体变阻元件连通的控制器。在一些 实施方案中，分离通道的输出可包括：通过探测器探测标记粒子，将探测器 的探测信息输送至控制器，控制器向流体变阻元件发出信号以改变第一输出 分支和第二输出分支中至少一个的流体阻力，从而使标记粒子流入选定的输 出分支之一。
在所列举的方面中或在它们的任意实施方案中，粒子群可包括但不限于 细胞、珠体、病毒、细胞器、纳米粒子和分子络合物。在一些实施方案中， 目标粒子可以是细胞，通道可以成曲形。在其它实施方案中，通道的第一半 径的曲形所施加的狄恩阻力可为更大半径的曲形所施加的狄恩阻力的约8 倍。通道可具有矩形截面形状，且矩形截面形状的至少一个尺寸在反曲形的 拐点之间是变化的。
本发明涉及
1.一种使悬浮在移动流体中的粒子聚集在一条或多条局域化流动线路 中的系统，包括：
基底；
设置在所述基底上的至少一条通道，所述至少一条通道具有入口和出 口；
以层流方式沿所述至少一条通道移动并且包含悬浮粒子的流体；
驱动所述流体层流流动的泵送元件；
其中所述流体、通道和泵送元件经配置以使惯性力作用于所述粒子并使 所述粒子聚集在一条或多条流动线路中。
2.项1的系统，其中移动所述流体悬浮液使所述粒子聚集在四条局域 化流动线路中。
3.项1的系统，其中移动所述流体悬浮液使所述粒子聚集在两条局域 化流动线路中。
4.项1的系统，其中移动所述流体悬浮液使所述粒子聚集在单一的局 域化流动线路中。
5.项1的系统，其中所述至少一条通道具有水力直径且聚集粒子的尺 寸与水力直径之比大于或等于约0.07。
6.项5的系统，其中粒子尺寸与水力直径之比小于或等于约0.5。
7.项1的系统，其中在聚集过程中流体流动的雷诺准数大于或等于约1 且小于或等于约250。
8.项1的系统，其中所述一条或多条聚集流动线路的宽度小于或等于 所述聚集粒子的尺寸的约5倍。
9.项1的系统，其中所述一条或多条聚集流动线路的宽度小于或等于 所述聚集粒子的尺寸的约4倍。
10.项1的系统，其中所述一条或多条聚集流动线路的宽度小于或等于 所述聚集粒子的尺寸的约3倍。
11.项1的系统，其中所述一条或多条聚集流动线路的宽度小于或等于 所述聚集粒子的尺寸的约2倍。
12.项1的系统，其中所述一条或多条聚集流动线路的宽度小于或等于 所述聚集粒子的尺寸的约1.05倍。
13.项1的系统，其中在所述至少一条通道的出口部分形成至少第一出 口分支和第二出口分支，所述第一出口分支和第二出口分支中的至少一个位 于所述基底上，以接收来自聚集流动线路的粒子。
14.项13的系统，其中所述系统提高溶液中粒子的浓度。
15.项4的系统，其中在所述至少一条通道的出口部分形成至少第一出 口分支和第二出口分支，所述第一出口分支和第二出口分支中的至少一个位 于所述基底上，以接收来自所述单一的局域化流动线路的粒子。
16.项15的系统，其中所述系统提高溶液中粒子的浓度。
17.项1的系统，其中所述至少一条通道具有矩形截面。
18.项17的系统，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 1000微米。
19.项17的系统，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约650 微米。
20.项17的系统，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约100 微米。
21.项17的系统，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约80 微米。
22.项17的系统，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约65 微米。
23.项17的系统，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约50 微米。
24.项17的系统，其中所述聚集粒子的尺寸小于或等于约20微米。
25.项17的系统，其中所述聚集粒子的尺寸小于或等于约10微米。
26.项17的系统，其中所述粒子为细胞。
27.项26的系统，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
28.项27的系统，其中所述细胞为血细胞。
29.项27的系统，其中所述细胞为肿瘤细胞。
30.项26的系统，其中所述细胞为细菌细胞。
31.项17的系统，其中所述矩形截面的宽高比使得粒子聚集在两条流 动线路中。
32.项31的系统，其中粒子聚集在一条或多条局域化流动线路中使所 述粒子在纵向上基本均匀地间隔。
33.项31的系统，其中第一矩形尺寸与第二矩形尺寸的宽高比为约0.3 至0.8。
34.项33的系统，其中所述宽高比为约1至2。
35.项32的系统，其中流体悬浮液移动通过所述通道的粒子雷诺准数 大于或等于约0.2。
36.项17的系统，其中所述至少一条通道成曲形。
37.项36的系统，其中至少一条聚集流动线路的位置取决于作用于所 述粒子的惯性力和狄恩阻力。
38.项37的系统，其中所述位置还取决于作用于所述粒子的离心力。
39.项36的系统，其中流动通过所述通道的狄恩准数小于或等于约20。
40.项36的系统，其中所述曲形为对称的且为反曲形。
41.项36的系统，其中所述曲形为不对称的且为反曲形。
42.项41的系统，其中曲率半径是变化的。
43.项42的系统，其中所述曲率半径在所述曲形的各拐点之后改变。
44.项43的系统，其中所述通道的截面尺寸是变化的。
45.项44的系统，其中所述通道的截面尺寸在所述曲形的各拐点之后 改变。
46.项42的系统，其中所述通道形成螺旋。
47.项1的系统，其中多条通道设置在所述基底上并且经配置以允许并 行流动。
48.项1的系统，其中多条通道设置在所述基底上，并且所述多条通道 中的至少一部分通道经配置以允许串行流动。
49.项1的系统，其中多条通道设置在所述基底上，并且第一通道具有 分别通向第二通道和第三通道的第一输出分支和第二输出分支。
50.项49的系统，其中所述通道中的至少两条通道经配置以聚集具有 不同预定直径的粒子。
51.项1的系统，还包括对所述一条或多条聚集流动线路中的粒子进行 探测和计数的探测器。
52.项4的系统，还包括对所述单一的局域化流动线路中的粒子进行探 测和计数的探测器。
53.项51的系统，还包括用所述探测器可探测到的标记对选定的粒子 进行标记的标记系统，从而所述探测器对所述选定的粒子进行探测和计数。
54.项1的系统，其中所述聚集由惯性力单独引起。
55.项1的系统，其中所述聚集由惯性力和其它力引起。
56.一种使移动流体中的粒子聚集的方法，包括：
向通道提供悬浮在移动流体中的粒子；
在使得作用于粒子的惯性力在通道中引起粒子流局域化的条件下使流 体流动通过通道。
57.项56的方法，其中通过所述通道的流体流动为层流流动。
58.项57的方法，其中所述流体流动的雷诺准数为约1至250。
59.项56的方法，其中聚集形成局域化粒子流，所述局域化粒子流富 集基于粒径的第一粒子。
60.项59的方法，其中所述第一粒子的直径除以所述通道的水力直径 大于或等于约0.07。
61.项60的方法，其中所述第一粒子的直径除以所述通道的水力直径 大于或等于约0.5。
62.项61的方法，其中所述通道具有矩形截面、高度、宽度，并且水 力直径等于2×高度×宽度/(宽度+高度)。
63.项62的方法，其中所述矩形截面具有约0.3至0.8的宽高比。
64.项63的方法，其中所述矩形截面具有约1至2的宽高比。
65.项56的方法，还包括向所述粒子施加不对称的力以形成一至三条 局域化粒子流。
66.项65的方法，其中施加所述不对称的力以形成一条局域化粒子流。
67.项66的方法，其中所述不对称的力包括选自下列中的至少一种： 离心力、流体动力阻力、电力、磁力、热力、声波力、光学力或介电电泳力。
68.项65的方法，其中所述不对称的力包括等于或大于约0.5nN的狄 恩阻力。
69.项56的方法，其中所述粒子包括选自下列中的至少一种：细胞、 珠体、病毒、细胞器、纳米粒子和分子络合物。
70.项56的方法，其中所述粒子为细胞。
71.项70的方法，其中所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、真核 单细胞、植物细胞和真菌细胞。
72.项70的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
73.项72的方法，其中所述细胞为血细胞。
74.项72的方法，其中所述细胞为癌细胞。
75.项72的方法，其中所述细胞包括肿瘤细胞。
76.项56的方法，其中所述通道成曲形。
77.项76的方法，其中所述移动流体的狄恩准数小于或等于约20。
78.项76的方法，其中所述曲形通道为反曲形。
79.项76的方法，其中所述曲形通道为螺旋状。
80.项76的方法，其中所述曲形通道为反曲形且不对称。
81.项80的方法，其中曲率半径从反曲曲形的一个拐点至反曲曲形的 下一个拐点是变化的。
82.项81的方法，其中第一半径的曲形之后是更大半径的曲形。
83.项82的方法，其中所述第一半径的曲形施加的狄恩阻力是所述更 大半径的曲形施加的狄恩阻力的约8倍。
84.项80的方法，其中所述通道具有矩形截面，并且所述矩形截面的 至少一个尺寸在反曲曲形的拐点之间是变化的。
85.项56的方法，还包括使所述移动流体从所述通道进入至少两个输 出分支，其中设置所述输出分支中的一个以接收富集给定尺寸的第一粒子的 局域化粒子流。
86.项85的方法，其中接收所述局域化粒子流使得溶液中第一粒子的 浓度提高。
87.项65的方法，还包括使所述移动流体从所述通道进入至少两个输 出分支，其中设置所述输出分支中的一个以接收富集给定尺寸的第一粒子的 局域化粒子流。
88.项56的方法，还包括应用探测器，以对所述通道内在局域化粒子 流中迁移的粒子进行计数。
89.项65的方法，还包括应用探测器，以对所述通道内在局域化粒子 流中迁移的粒子进行计数。
90.项87的方法，还包括应用标记系统，以用探测器可探测到的标记 对选定的粒子进行标记，从而所述探测器对所述选定的粒子进行探测和计 数。
91.项56的方法，其中所述聚集由惯性力单独引起。
92.项56的方法，其中所述聚集由惯性力和其它力引起。
93.一种使悬浮在移动流体中的预定尺寸的粒子聚集在一条或多条局 域化流动线路中的设备，包括：
基底；
设置在所述基底上的至少一条通道，所述至少一条通道具有入口和出 口；
其中包含预定尺寸的粒子的流体悬浮液以层流方式从所述入口移至所 述出口使得所述预定尺寸的粒子聚集在一条或多条局域化流动线路中。
94.项93的设备，其中所述至少一条通道具有水力直径，并且所述粒 子的预定尺寸与所述水力直径之比大于或等于约0.07。
95.项94的设备，其中所述粒子的预定尺寸与所述水力直径之比小于 或等于约0.5。
96.项93的设备，其中所述通道的截面形状和面积从所述入口至所述 出口是一致的。
97.项93的设备，其中所述通道的截面形状和面积从所述入口至所述 出口是变化的。
98.项93的设备，其中聚集过程中所述流体悬浮液流动的雷诺准数大 于或等于约1并且小于或等于约250。
99.项93的设备，其中所述一条或多条局域化流动线路的宽度小于或 等于所述粒子的预定尺寸的约5倍。
100.项93的设备，其中所述一条或多条局域化流动线路的宽度小于或 等于所述粒子的预定尺寸的约4倍。
101.项93的设备，其中所述一条或多条局域化流动线路的宽度小于或 等于所述粒子的预定尺寸的约3倍。
102.项93的设备，其中所述一条或多条局域化流动线路的宽度小于或 等于所述粒子的预定尺寸的约2倍。
103.项93的设备，其中所述一条或多条局域化流动线路的宽度小于或 等于所述粒子的预定尺寸的约1.05倍。
104.项93的设备，其中包含预定尺寸的粒子的流体悬浮液从所述入口 移至所述出口使得所述预定尺寸的粒子聚集在四条局域化流动线路中。
105.项93的设备，其中包含预定尺寸的粒子的流体悬浮液从所述入口 移至所述出口使得所述预定尺寸的粒子聚集在两条局域化流动线路中。
106.项93的设备，其中包含预定尺寸的粒子的流体悬浮液从所述入口 移至所述出口使得所述预定尺寸的粒子聚集在单一的局域化流动线路中。
107.项106的设备，其中在所述至少一条通道的出口部分形成至少第 一出口分支和第二出口分支，所述第一出口分支和所述第二出口分支中的至 少一个位于所述基底上，以接收来自所述单一的局域化流动线路的预定尺寸 的粒子。
108.项93的设备，其中所述至少一条通道具有矩形截面。
109.项108的设备，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 1000微米。
110.项108的设备，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 650微米。
111.项108的设备，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 100微米。
112.项108的设备，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 80微米。
113.项108的设备，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 65微米。
114.项108的设备，其中所述至少一条矩形通道的宽度小于或等于约 50微米。
115.项108的设备，其中所述粒子的预定尺寸小于或等于约20微米。
116.项108的设备，其中所述粒子的预定尺寸小于或等于约10微米。
117.项108的设备，其中所述预定尺寸的粒子为细胞。
118.项117的设备，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
119.项118的设备，其中所述细胞为血细胞。
120.项118的设备，其中所述细胞为癌细胞。
121.项117的设备，其中所述细胞为细菌细胞。
122.项108的设备，其中所述矩形截面的宽高比使得粒子聚集在两条 流动线路中。
123.项122的设备，其中粒子聚集在一条或多条局域化流动线路中使 所述粒子在纵向上基本均匀地间隔。
124.项122的设备，其中所述宽高比为约0.3至0.8。
125.项123的设备，其中所述流体悬浮液移动通过所述通道的粒子雷 诺准数大于或等于约0.2。
126.项108的设备，其中所述至少一条通道成曲形。
127.项126的设备，其中所述至少一条聚集流动线路的位置取决于作 用于所述粒子的惯性力和狄恩阻力。
128.项127的设备，其中所述位置还取决于作用于所述粒子的离心力。
129.项126的设备，其中流体通过所述通道的狄恩准数小于或等于约 20。
130.项126的设备，其中所述曲形为对称的且为反曲形。
131.项126的设备，其中所述曲形为不对称的且为反曲形。
132.项131的设备，其中曲率半径是变化的。
133.项132的设备，其中曲率半径在所述曲形的各拐点之后改变。
134.项133的设备，其中所述通道的截面尺寸是变化的。
135.项134的设备，其中所述通道的截面尺寸在所述曲形的各拐点之 后改变。
136.项132的设备，其中所述通道形成螺旋。
137.项93的设备，其中多条通道设置在所述基底上并且经配置以允许 并行流动。
138.项93的设备，其中多条通道设置在所述基底上并且所述多条通道 中的至少一部分通道经配置以允许串行流动。
139.项93的设备，其中多条通道设置在所述基底上并且第一通道具有 分别通向第二通道和第三通道的第一输出分支和第二输出分支。
140.项139的设备，其中所述通道中的至少两条通道经配置以聚集具 有不同预定直径的粒子。
141.一种从悬浮在流体中粒子群中分选粒子的系统，包括：
标记系统，所述标记系统标记待从粒子群中分选的粒子；
基底，所述基底上设置有至少一条通道，所述至少一条通道具有入口和 出口，其中包含粒子的流体悬浮液以层流方式从所述入口移至所述出口使得 所述粒子聚集在一条或多条局域化流动线路中，所述粒子中的至少一部分已 被标记，所述出口具有至少两个输出分支，所述至少两个输出分支中的第一 个分离待分选的粒子，所述至少两个输出分支中的第二个输出未分离的剩余 粒子；
分选系统，所述分选系统与所述通道操作连接以使粒子选择性地转向所 述第一输出分支。
142.项141的系统，其中所述分选系统为无源分选系统。
143.项142的系统，其中所述标记系统将标记施用于待分离的粒子， 所述标记具有可通过所述分选系统脱离聚集粒子流动线路的性质。
144.项143的系统，其中所述标记增大粒子尺寸，并且所述分选系统 具有基于尺寸使粒子分流到第一输出分支和第二输出分支中的通道几何结 构。
145.项143的系统，其中所述标记具有磁性，并且所述分选系统包括 向标记粒子施加力的偏磁元件，所述力使标记粒子从第二输出分支转向第一 输出分支。
146.项143的系统，其中所述标记具有电性能，并且所述分选系统包 括向标记粒子施加的电泳力，所述电泳力使标记粒子从第二输出分支转向第 一输出分支。
147.项143的系统，其中所述分选系统包括使所述标记粒子从第二输 出分支转向第一输出分支的亲和层析柱。
148.项141的系统，其中所述分选系统为有源分选系统并且还包括选 择性地使所述标记粒子从第二输出分支转向第一输出分支的控制器。
149.项148的系统，其中所述分选系统还包括探测标记粒子的探测器， 所述探测器与所述控制器操作连接，以向所述控制器发出存在标记粒子的信 号以进行转向。
150.项149的系统，其中所述探测器为荧光探测器并且所述标记为荧 光标记。
151.项149的系统，其中所述分选系统还包括通道阻力驱动器，所述 通道阻力驱动器由所述控制器选择性地驱动以使标记粒子从第二输出分支 转向第一输出分支。
152.项151的系统，其中所述通道阻力驱动器与所述第一输出分支连 接以降低所述第一输出分支的流体阻力，从而使标记粒子从第二输出分支转 向第一输出分支。
153.项151的系统，其中所述通道阻力驱动器与所述第二输出分支连 接以增大所述第一输出分支的流体阻力，从而使标记粒子从第二输出分支转 向第一输出分支。
154.项151的系统，其中所述通道阻力驱动器为微型阀，所述微型阀 部分地打开或闭合以改变输出分支的流体阻力。
155.项151的系统，其中所述通道阻力驱动器拉伸或压缩所述通道的 尺寸以改变输出分支的流体阻力。
156.项141的系统，其中所述粒子为细胞。
157.项156的系统，其中所述细胞基于细胞的特性分类。
158.项157的系统，其中所述细胞的特性为存在至少一个癌症标识。
159.一种从粒子群中分离目标粒子的方法，包括：
向流体悬浮液提供粒子群，所述粒子群包括目标粒子；
在使所述粒子中的至少一部分在通道中形成局域化粒子流的条件下，使 所述流体悬浮液流动通过至少一条通道；
将所述通道的输出分离为第一输出分支和第二输出分支；
其中所述输出分支经配置，以使所述第二输出分支接收富集目标粒子的 液流，而第一输出分支接收目标粒子减少的液流。
160.项159的方法，其中所述分离以无源方式进行。
161.项160的方法，其中所述目标粒子具有与所述粒子群中其它粒子 不同的尺寸。
162.项161的方法，其中所述目标粒子在通道内的预定位置形成局域 化目标粒子流。
163.项162的方法，其中设置所述第一输出分支的入口以包括所述局 域化目标粒子流在通道内的预定位置。
164.项159的方法，还包括与所述通道操作连接的分离系统使用标记 选择性地标记粒子。
165.项164的方法，其中所述标记增大选择性标记粒子的尺寸。
166.项164的方法，其中所述标记为磁性标记。
167.项166的方法，其中所述分离系统利用磁场使目标粒子朝向所述 第一输出分支并使其它粒子朝向所述第二输出分支。
168.项164的方法，还包括通过所述分离系统探测标记或标记粒子， 并通过所述分离系统使标记粒子转向第一输出分支和第二输出分支中选定 的一个。
169.项168的方法，其中所述分离系统包括与所述通道操作连接的探 测器、与所述第一输出分支和第二输出分支中的至少一个操作连接的流体变 阻元件、与所述探测器和流体变阻元件连通的控制器。
170.项169的方法，其中分离所述通道的输出还包括：通过所述探测 器探测目标粒子；从所述探测器向所述控制器传送探测信息；通过所述控制 器向流体变阻元件发出信号以改变第一输出分支和第二输出分支中至少一 个的流体阻力，从而使所述目标粒子流入所述输出分支中选定的一个。
171.项170的方法，其中所述标记为荧光标记。
172.项159的方法，其中通过所述通道的流体流动为层流流动。
173.项172的方法，其中所述流体流动的雷诺准数为约1至250。
174.项173的方法，其中所述目标粒子的直径除以所述通道的水力直 径大于或等于约0.07。
175.项174的方法，其中所述目标粒子的直径除以所述通道的水力直 径小于或等于约0.5。
176.项175的方法，其中所述通道具有矩形截面、高度、宽度，水力 直径等于2×高度×宽度/(宽度+高度)。
177.项176的方法，其中所述矩形截面具有约0.3至0.8的宽高比。
178.项159的方法，还包括向所述粒子施加不对称的力以形成一至三 条局域化粒子流。
179.项178的方法，其中施加所述不对称的力以仅仅形成一条局域化 粒子流。
180.项178的方法，其中所述不对称的力包括选自下列中的至少一种： 离心力、流体动力阻力、电力、磁力、热力、声波力、光学力或介电电泳力。
181.项178的方法，其中所述不对称的力包括等于或大于约0.5nN的 狄恩阻力。
182.项159的方法，其中所述粒子群包括选自下列中的至少一种：细 胞、珠体、病毒、细胞器、纳米粒子和分子络合物。
183.项159的方法，其中所述目标粒子为细胞。
184.项183的方法，其中所述细胞选自细菌细胞、哺乳动物细胞、原 生动物、植物细胞和真菌细胞。
185.项183的方法，其中所述细胞为哺乳动物细胞。
186.项185的方法，其中所述细胞为血细胞。
187.项185的方法，其中所述细胞包括肿瘤细胞。
188.项159的方法，其中所述通道成曲形。
189.项188的方法，其中所述移动流体的狄恩准数小于或等于约20。
190.项188的方法，其中所述曲形通道为反曲形。
191.项188的方法，其中所述曲形通道为螺旋状。
192.项188的方法，其中所述曲形通道为反曲形且不对称。
193.项192的方法，其中曲率半径从所述反曲曲形的一个拐点至反曲 曲形的下一个拐点是变化的。
194.项193的方法，其中所述第一半径的曲形之后为更大半径的曲形。
195.项194的方法，其中所述第一半径的曲形施加的狄恩阻力为所述 较大半径的曲形施加的狄恩阻力的约8倍。
196.项192的方法，其中所述通道具有矩形截面，并且所述矩形截面 的至少一个尺寸在所述反曲曲形的拐点之间是变化的。
附图说明
参照附图通过以下详述将更加完全地理解本发明，其中：
图1A示出用于使粒子在微通道内分离、有序化和聚集的系统的一种实 施方案；
图1B示出图1A的一个微通道的实例；
图2A是粒子分离、有序化和聚集的直线通道的一种实施方案的侧视图；
图2B是图2A的直线通道的截面图，示出了聚集粒子流的四个平衡位 置；
图2C是示例性大宽高比直线通道的截面图，示出了聚集粒子流的两个 平衡位置；
图3A是用于粒子分离、有序化和聚集的对称曲形通道的一种实施方案 的侧视图；
图3B是图3A的对称通道的截面图，示出了聚集粒子流的两个平衡位 置；
图4A是用于粒子分离、有序化和聚集的不对称曲形通道的一种实施方 案的侧视图；
图4B是图4A的不对称通道的截面图，示出了聚集粒子流的一个平衡 位置；
图4C是扩展螺旋通道形式的不对称曲形通道的另一实施方案的透视 图；
图5A是具有矩形截面的直线通道的一种实施方案的截面图，示出了通 道内作用于粒子的力；
图5B是图5A的直线通道内作用于粒子的力的示意图；
图6A是曲形微通道内作用的狄恩阻力的抛物线形速度分布曲线；
图6B示出曲形微通道内狄恩流速与狄恩准数的关系；
图6C示出平均二次流速的大小随单通道几何结构的狄恩准数的变化；
图7是不对称曲形通道的一种实施方案的截面图，示出了狄恩流动引起 的惯性升力造成的四个稳定位置的重叠；
图8A是直线通道的一种实施方案的截面图，示出了聚集在四个横向位 置中的粒子；
图8B是图8A的直线通道的侧视图，示出了聚集在四条流动线路中的 粒子；
图8C是图8A的直线通道的侧视图和截面图，示出了聚集度随Re增大；
图9A是大宽高比直线通道的一种实施方案内聚集的示意图，显示出聚 集为两条粒子流；
图9B是图9A的直线通道内粒子有序化和间隔的示意图；
图9C是图9A的直线通道内粒子有序化和间隔的示意图；
图9D是图9A的直线通道内两种不同类型的粒子有序化和间隔的示意 图；
图10A是对称形通道的一种实施方案的侧视图，示出了粒子聚集在两 条流动线路中；
图10B是图10A的通道的侧视图，示出了粒子聚集度随着Re增大；
图11A是不对称形通道的一种实施方案的侧视图，示出了粒子聚集度 随着Re增大；
图11B是图11A的通道的侧视图，示出了单条聚集粒子流；
图11C是图11A的通道的截面图，示出了粒子在通道内聚集于单个平 衡位置；
图11D是图11A的通道的侧视图，示出了粒子沿通道的长度聚集于不 同位置；
图12是不对称形扩展螺旋通道的一种实施方案的截面图，示出了该通 道内粒子聚集的平衡位置；
图13是图12的通道的侧视图，示出了粒子在该通道内的有序化；
图14是用于粒子分离、有序化和聚集的具有不对称通道的系统的一种 实施方案的示意图；
图15A是利用磁性标记粒子进行标识将粒子无源分离为聚集流的一种 示例性系统和方法的示意图；
图15B是利用荧光识别预定类型的粒子将粒子有源分离为聚集流的一 种示例性系统和方法的示意图；
图15C是全血中稀有细胞群的出现率图；
图16A是不同密度的粒子聚集的侧视图；
图16B是取自图16A的数据图，示出了粒子密度的无关性；
图16C是示例性系统的入口和出口的侧视图，示出了粒子密度的无关 性；
图17A是惯性聚集粒子的稳定性和精确度的示意图，示出了拟合为高 斯曲线的强度分布；
图17B是取自图17A的数据图，示出了聚集粒子的FWHM和中心位置 与时间的关系；
图18A是示例性聚集系统的通道的侧视图，示出了粒子的自有序化；
图18B是取自图18A的数据图；
图18C是在示例性聚集系统的不对称曲形通道内自有序化的粒子的侧 视图；
图18D是取自图18C的数据图；
图19A是示出稀释全血中的细胞在示例性聚集系统内自有序化的侧视 图；
图19B是获自图19A的数据的峰值曲线片段的示意图，示出了聚集粒 子(in-focus particle)；
图19C是图19A的系统中粒子之间距离的矩形图；
图20A是示出示例性聚集系统的通道内红血细胞的旋转、轴向和聚集 排列的空间分布的侧视图；
图20B是盘形红血细胞在示例性聚集系统内旋转排列的侧视图和截面 图；
图21是a/Dh的聚集结果与狄恩准数的关系曲线图；
图22是示例性通道的侧视图，示出了不同a/Dh的聚集；
图23A是在示例性聚集系统内聚集不同尺寸粒子的通道的侧视图；
图23B是使用示例性聚集系统时入口处粒子随机分布和出口处粒子分 离的侧视图；
图23C是示例性多通道聚集系统的树形结构的顶视图；
图24是示出示例性聚集系统内不同Rp的粒子分离行为的侧视图；
图25包括在示例性聚集系统内对于不同的粒径入口处的粒子分布和出 口处的粒子分离的顶视图；
图26A是在示例性聚集系统内输入溶液和不同输出部分的粒子直径分 布的示意图；
图26B是图26A的示意图的一部分，示出了存在较大粒子；
图27示出从3.1μm的粒子中过滤大粒子的纯度和产率数据；
图28示出通过两个分层进行级联分离的示例性聚集系统的数据；
图29A是用于分离不同尺寸可变形硅油液滴的示例性聚集系统的示意 图；
图29B是图29A的系统的粒径分布的示意图；
图29C是在图29A的系统中流动的刚性粒子的粒径分布的示意图；
图30示出血小板与其它血液成分分离的截止尺寸；
图31是示例性通道的侧视图，示出具有不同总体积分数的溶液中的聚 集；
图32A是示例性聚集系统的扩展螺旋通道内粒子聚集的顶视图；
图32B是图32A的通道内不同粒径的纵向有序化的侧视图；
图33A是示例性聚集系统的扩展螺旋通道内粒子的横向位移的示意图；
图33B是图33A的通道内粒子的横向位移的另一示意图；
图33C是不同a/Dh的粒子横向位移的示意图；
图34A是对于不同的Rc在示例性聚集系统的扩展螺旋通道内聚集的示 意图；
图34B是示出图34A的通道内不同粒径的纵向有序化的侧视图；
图35A是示例性聚集系统的扩展螺旋通道内的相对粒径和有序化的侧 视图；
图35B是图35A的通道内10μm粒子的聚集的示意图；
图35C是图35A的通道内10μm粒子的聚集的示意图；
图35D是图35A的通道内10μm粒子的侧视图；
图35E是图35A的通道内7μm粒子的侧视图；
图35F是图35A的通道内粒子数与粒径的关系曲线图；
图36是示出示例性聚集系统内对于不同的Re粒子的聚集行为的侧视 图；
图37是示例性聚集系统内的对称曲形通道中的聚集行为的示意图；
图38是示例性通道的顶视图，示出了粒子聚集与a/Dh的关系；
图39是示出在示例性聚集系统内对于不同宽度的示例性通道的聚集行 为的侧视图；
图40是示出在示例性聚集系统内对于不同宽度的示例性通道的聚集行 为的侧视图；
图41是在示例性聚集系统内对于不同宽度的示例性通道的聚集行为的 示意图；
图42是在示例性聚集系统内对于不同宽度的示例性通道的聚集行为的 示意图；
图43是示出在示例性聚集系统内进行分离时Re与聚集的关系的侧视 图；
图44是示出示例性聚集系统内血细胞聚集的顶视图；
图45A是对于不同的Re细胞聚集的拖尾图像的侧视图；和
图45B是不对称通道内各转弯处培养细胞的强度截面图。
具体实施方式
现对一些示例性实施方案进行描述，以供完全理解本文披露的设备和方 法的结构原理、功能、制造和用途。在附图中示出了这些实施方案的一个或 多个实例。本领域技术人员应当理解的是，本文具体描述并在附图中示例的 设备和方法是非限制性的示例性实施方案，并且本发明的范围仅由权利要求 限定。参照示例性实施方案示例或描述的特征可与其它实施方案的特征组 合。这些改进和变化包括在本发明的范围内。
本发明涉及微流体学和分析分离领域。以下所述的本发明各种实施方案 基于如下构思：流体层流流动通过微流体通道可使得悬浮在流体中的粒子连 续并精确地自有序化。示出了多种特定的通道几何结构，所述通道几何结构 利用该效应形成限制在三维空间内的连续有序化粒子流。粒子在通道的x-y 面(或截面)内横向有序化并且还可沿流动方向纵向有序化。对于不对称形粒 子，还可能出现其它的旋转有序维度。
总体上，本发明的特征在于至少部分地基于惯性升力使粒子流分离并聚 集于通道流场内的平衡位置的方法和设备。在矩形通道中，例如由此可形成 与四个矩形面各自的中心隔开一定距离的四条聚集粒子流。对于特定的矩形 几何结构，可将这种四重对称性降为双重对称性，且粒子流与通道的两个相 对面均隔开。
本发明还可包括利用各种力(例如包括电磁力、磁力、离心力、流体动 力、热力、声学力、光学力和/或介电电泳力或者它们的组合)降低系统对称 性的方法和系统。尽管可利用任何力使通道流场内的特定势能最低位置偏 置，但利用曲形通道结构引起的离心力具有一定的优势。在这种情况下，力 仅仅基于微小的几何结构变化随流速的平方增大，而不需要额外的机械或电 学部件。例如，可利用流动通过S形矩形通道时所固有的惯性力降低对称性， 以形成双重对称(从四重降至双重)，并使大部分粒子以周期性方式(没有对应 于下面通道的周期)配合流动。还可利用通道的几何结构通过以周期性方式 改变曲率半径或通道宽度(从而使通道成不对称曲形)来改变对称性，从而形 成单条聚集粒子流。
本发明的实施方案的优势在于可采用单流输入且不需要活动部件或分 离压控制。本发明的实施方案还可提供这样的方法：成本低，使用需简单容 错制造并且还可小型化的设备。本发明的实施方案可连续地以高的体积流速 操作并具有级联输出。此外，本发明不需要与机械过滤器或障碍物相互配合 且需要极低的维护。
还可将有关悬浮粒子的原理应用于各种生物材料，特别是细胞。例如从 全血及其组成细胞中快速分析并获取信息的能力对于医学诊断和基础科学 方面的应用具有重要意义。血细胞本身包含大量与疾病、感染、恶性肿瘤或 变应性诊断有关的信息。本文给出了涉及惯性微流体技术(inertial microfluidic technology)的系统和原理，惯性微流体技术是处理量大并能精确 地微观控制细胞和粒子运动的技术方案。本发明的系统可理想地用于血细胞 亚类或稀有细胞的计数、分选和分析方面的应用。具体而言，识别和分析稀 有细胞要求大的样品尺寸以及大的处理量。本文给出的快速简便的微流体技 术可突破常规分选技术限制分析样品尺寸的局限。在简单的通道中对粒子进 行连续差动地高速分选、有序化、计数和分析的能力可广泛用于生物粒子连 续分离、高处理量细胞计量和大规模过滤系统方面的各种应用。
尽管用于使粒子在微流体通道内自有序化的系统存在多种可行的构造， 但在图1A和图1B中示出了系统10的一种实施方案。如图所示，系统10 通常包括入口12，该入口12可配置用于将包含悬浮粒子22的样品24引入 系统。如图1B所示，可提供微构造基片14，该微构造基片14中可形成有 至少一条微流体通道16，以接收样品24并使悬浮在样品24中的粒子22有 序化和聚集。在图1A所示的示例性基片14中形成有多条并行设置的通道 16。
基片14中形成的多条通道16可具有多种构造，以下将详细说明。然而， 通常所述多条通道16可具有特定的几何结构，所述几何结构经配置以分离、 有序化和聚集悬浮在样品24中具有预定尺寸的粒子，从而在基片14的出口 26处由每条通道16提供一条或多条聚集粒子流22。可邻近通道16的出口 26设置分析区18，以对局域化聚集粒子流22进行监测、分类、计数、成像 或其它分析。
在一种实施方案中，基片14可以是粒子计数系统或者可以是粒子计数 系统的一部分。具体地，粒子聚集并有序化所在的分析区18可经受探测器 的询问(interrogation)以对粒子进行计数。以下描述了各种探测器，例如标记 粒子以进行探测的系统，这些元件还可用于计数。
如本文所用，“样品”必须能够流动通过所述系统实施方案的微流体通 道。因而，在本文所述的系统和方法中可使用由流体悬浮液构成的任意样品 或者可转变为流体悬浮液形式的任意样品，所述样品可经受驱动通过微流体 通道。例如，可从动物、水源、食物、土壤、空气等中获取样品。如果获取 的是固体样品例如组织样品或土壤样品，则可将该固体样品液化或溶液化之 后引入系统。如果获取的是气体样品，则也可将其液化或溶液化。样品还可 包括液体来作为粒子。例如，样品可包括油或其它种类的液体的气泡，来作 为悬浮在水溶液中的粒子。
可将任意数量的样品引入粒子聚集系统并且不应限于本文所述的样品。 样品通常可包括其中布置有粒子、细胞、液滴等中至少一种的任意悬浮体、 液体和/或流体。此外，聚集可形成富集第一粒子(基于尺寸)的粒子流。在一 些实施方案中，样品可源于动物例如哺乳动物。在优选实施方案中，哺乳动 物可以是人。源于动物的示例性流体样品可包括但不限于全血，汗液，泪液， 耳液(ear flow)，痰液，骨髓悬浮液，血清，尿液，脑流体，脑脊液，唾液， 粘液，阴道流体，腹水，乳液，呼吸道、肠道和生殖泌尿道的分泌物，羊水。 在其它实施方案中，示例性样品可包括引入人体后再取出进行分析的流体， 包括所有形式的灌洗液，例如杀菌灌洗液、支气管肺泡灌洗液、洗胃液、腹 膜灌洗液、颈灌洗液、athroscopic、导管灌洗液、鼻灌洗液和耳灌洗液。示 例性粒子可包括包含在本文所述流体中的任意粒子并且既可以是刚性的也 可以是能够变形的。具体地，粒子可包括但不限于活细胞或固定细胞，例如 成体血红细胞、胎儿血红细胞、营养细胞、胚胎成纤维细胞、白血细胞、上 皮细胞、肿瘤细胞、癌细胞、造血干细胞、细菌细胞、哺乳动物细胞、真核 单细胞、植物细胞、嗜中性粒细胞、T淋巴细胞、CD4+、B淋巴细胞、单核 细胞、嗜酸性细胞、自然杀伤细胞、嗜碱细胞、树突细胞、循环内皮细胞、 抗原特异性T细胞和真菌细胞；珠体；病毒；细胞器；液滴；脂质体；纳米 粒子；和/或分子络合物。在一些实施方案中，一种或多种粒子如细胞可在 样品中粘着、群聚或丛生在一起。在这种构造下，出于本发明系统的目的， 可将粒子群或粒子簇视为“粒子”。更具体地，粒子群或粒子簇可作为并视 作本文所述的本发明通道内的单个粒子，因而可按照与单个粒子相同的方式 进行分类、有序化、分选和聚集。
非生物样品例如可包括适于进行粒子分离、有序化和聚集的任意数量的 各种工业及商业样品。可引入系统的示例性工业样品可包括但不限于乳液、 两相化学溶液(例如固-液、液-液和气-液化学处理样品)、废水、生物处理颗 粒和食品工业样品(例如果汁、果浆、种子等)。类似地，示例性商业样品可 包括但不限于被细菌/寄生虫污染的水、含有颗粒(例如咖啡渣和茶渣)的水、 化妆品、润滑剂和颜料。
在一些实施方案中，将取自动物的流体样品直接应用于本文所述的系 统，在另一些实施方案中，将样品预处理或处理之后送入本发明的系统。例 如，可用一种或多种试剂处理取自动物的流体之后送入系统，或者可将取自 动物的流体收集在预先装有试剂的容器中。示例性试剂可包括但不限于稳定 剂、防腐剂、fixant、溶血剂、稀释剂、抗细胞凋亡剂、抗凝剂、抗血栓剂 (anti-thrombotic)、磁性或电性调节剂、尺寸调节剂(size altering reagent)、缓 冲剂、重量克分子渗透压浓度调节剂、pH调节剂和/或交联剂。2004年3月 3日提交的名称为“System For Delivering a Diluted Solution”的美国公开文 件2007/0196820中描述了处理流体样品以送入分析设备的方法的实例，在 此引入所述文件的全部内容作为参考。
悬浮在样品中的粒子可具有允许其在本文所述的微流体通道内有序化 并聚集的任意尺寸。例如，粒子可具有约40微米至约0.01微米的流体动力 尺寸。更优选地，粒子可具有约20微米至约0.1微米的流体动力尺寸。更 优选地，粒子可具有约10微米至约1微米的流体动力尺寸。应当理解的是， 粒子尺寸仅受限于通道的几何结构，大于和小于上述范围的粒子可在具备层 流条件的预定通道几何结构内有序化并聚集。
在系统的另一方面中，可任选地控制或调节样品中粒子的体积比以使通 道内的质量守恒。通常，粒子的分选、有序化和聚集部分地取决于通道内的 粒子间距以及粒子尺寸与通道的流体动力尺寸之比。本文所述的各种通道几 何结构可能需要预定的待聚集粒子体积比，以获得所需的粒子间距，从而保 持粒子的有序化和聚集。具体地，可根据需要计算和调节悬浮在流体中的粒 子的体积比，以在特定的通道几何结构内实现聚集。通常，对于特定的粒子 尺寸和通道几何结构，最大粒子体积比可通过下式确定：
其中N为通道中聚集位置的数量，a为聚集粒子的直径，h为通道高度， w为通道宽度。因而，可稀释或浓缩样品以在样品引入系统之前和/或引入 系统过程中达到预定的比例。另外，一些示例性系统可能要求在样品引入通 道之后调节所述比例。
在本文所述的通道内样品中的粒子体积比可为足以使粒子有序化和聚 集的任意值。通常，粒子体积比可小于约50%。在其它实施方案中，粒子体 积比可小于约40%、30%、20%、10%、8%或6%。更具体地，在一些实施 方案中，粒子体积比可为约0.001%至约5%，可优选为约0.01%至约4%。 更优选地，所述比例可为约0.1%至约3%，最优选为约0.5%至约2%。本领 域技术人员应当理解的是，除了待聚集的粒子以外，样品中附加或外来粒子 的体积比无需考虑或调节。此外，本领域技术人员应当理解的是，任意数量 的样品在引入系统之前、引入系统过程中和/或引入系统之后可能不需要对 待聚集粒子的体积比进行任何调节。
在本文披露的实施方案中可采用各种常用的稀释或浓缩样品的技术，来 调节粒子的体积比。例如，可在引入系统之前分批地稀释或浓缩样品，使得 最终引入系统的样品在经由入口引入之前具有所需的比例。在其它实施方案 中，系统可包括两个或多个用于同时引入样品和稀释剂或浓缩剂的入口以实 现稀释或浓缩。可以这种方式调节系统内的粒子体积比，无论是在样品和稀 释剂或浓缩剂进入通道之前在腔室中进行调节还是通过在通道内混合样品 和稀释剂或浓缩剂来进行调节。在另一实施方案中，可在未经调节的样品在 通道内行进一段距离之后，根据不同应用的要求将稀释剂或浓缩剂引入通道 的中心部分、岔口或分支。本领域技术人员应当认识到可用于调节本文所述 实施方案内样品中的粒子体积比的变型。
再次参照图1A和1B，可在微构造基片14中形成一条或多条微流体通 道16，并可布置所述一条或多条微流体通道16以经由与通道16连通的一 个或多个入口12接收样品24。可进一步布置通道16以使悬浮在样品中具 有预定尺寸的粒子有序化并聚集成朝向一个或多个出口26的一条或多条局 域流或粒子流22。如图所示，可以这种方式聚集稀溶液中的粒子。如图1B 所示，局域流22可包含纵向相邻布置的三个或更多个粒子20并相隔基本恒 定的纵向距离。粒子流22中的粒子20还可相对于通道16旋转排列。
通常，“局域化”是指粒子流穿过的通道截面面积减小。在一些优选实 施方案中，粒子可局限在宽度至多为粒子宽度的1.05倍、2倍、3倍、4倍 或5倍的区域内。局域化可发生在通道内的任意位置，但优选发生在通道的 无障碍位置。例如，局域化可发生在截面积的减小低于50%、40%、30%、 20%、10%、5%、2%、1%或0.1%的通道部分。在一些实施方案中，局域化 可发生在截面积基本恒定的通道中。
可以随后详述的任意方式在基片中形成任意数量的微流体通道。在一种 示例性实施方案中，在基片上形成一条用于聚集粒子的通道。在另一示例性 实施方案中，可在基片中以各种网络构造形成多条用于聚集粒子的通道。例 如可在基片中形成2、4、6、8、10、12或更多条通道。如图1A所示，树形 构造尤其有利于多通道系统。在系统的微构造基片中还可包括任意数量的 层，各层之中形成有多条通道。
在单个基片中可包含各种通道几何结构。如图1A所示，在基片中邻近 入口形成样品引入系统时用于输送和分隔流动线路的通道直线部分。通道的 直线部分根据需要可转变为用于聚集预定尺寸粒子的任意数量的对称和/或 不对称曲形通道。进一步如图1A所示，基片还可包括位于出口区域用于分 析聚集粒子、收集聚集粒子和/或重新汇合流动线路的通道直线部分。本领 域技术人员应当理解的是，根据需要在基片中可包含任意数量的曲形或直线 部分。通道的其它曲形部分可作为聚集粒子流的“驶出坡道(off-ramp)”，以 促进其它基于与粒子结合的标识或标记的分离。根据各种应用的需要，在通 道内的任意位置可包括通道岔口或分岔，以进一步促进对聚集粒子的控制。
在单个基片内还可包括各种通道尺寸。通道尺寸可沿基片的长度减小以 促进样品的过滤或出于应用的其它具体原因。在输入区域或输出区域的通道 尺寸可较大，以能够将岔口或阀系统设置在通道内，或者能够分离多条流动 线路并使所述流动线路朝向不同的位置来进行分析或收集。还可根据需要以 类似的方式改变单个基片中各条通道的截面，以针对具体应用控制聚集粒子 的流动线路。通常，根据需要在单个基片上可包括通道几何结构、通道截面 和通道尺寸的任意组合，以分选、分离、有序化和聚集具有一种预定尺寸的 粒子或具有多种预定尺寸的粒子。
用于本文所述系统的通道可具有各种几何结构和截面，用于聚集悬浮在 流体中具有预定尺寸的粒子。例如，在图2A和2B所示的一种实施方案中， 提供具有矩形截面且宽高比基本为1:1的直线通道30。如以下更详细的描述， 在这种通道几何结构内流动的具有预定尺寸的粒子分离、有序化并聚集在四 条流动线路32a、32b、32c、32d中，所述四条流动线路相应于与四个通道 壁面各自相距一定距离的四个平衡位置或势能最低位置。在另一实施方案 中，提供具有矩形截面且宽高比基本为2:1的直线通道36。在这种通道几何 结构内流动的具有预定尺寸的粒子可分离、有序化并聚集成在两条聚集流动 线路38a、38b中，所述两条聚集流动线路相应于跨越通道宽度沿上壁和下 壁的两个平衡位置或势能最低位置。在一种实施方案中，还可采用1:2的宽 高比。
如图3A和3B所示，通道还可成曲形。例如，可提供对称曲形通道， 例如具有矩形截面的S形、正弦曲线形或反曲形通道40。在这种通道几何 结构内流动的具有预定尺寸的粒子通常聚集在两条流动线路42a、42b中， 所述两条流动线路相应于与通道的左侧面和右侧面相距一定距离的两个平 衡位置或势能最低位置。反曲形通道40的宽高比可基本为1:1和/或可沿通 道的长度变化。例如，反曲形通道的宽高比可根据所选择的构造在通道的长 度范围内在1:1至2:1之间变化。
在另一实施方案中，如图4A和4B所示提供不对称曲形通道。尽管不 对称曲形通道可根据具体应用的需要具有各种形状和构造，但在一种实施方 案中不对称通道46通常可以是具有大转弯和小转弯的波浪形，其中曲率半 径可在波浪的各拐点之后改变。大转弯和小转弯各自可具有与转弯相关的特 定通道宽度。具体地，如图4A所示，波长的一半可以是半径为R1a、R1b的 大曲形，所述半径限定宽度W1。波长的第二半可以是半径为R2a、R2b的曲 形，所述半径限定宽度W2，其中R1a和R1b可大于R2a和R2b，反之亦可(当 R1a=R2a且R1b=R2b时为如上所述的正弦曲线形对称通道)。另外，W1可大于 W2，反之亦可。具有半径为R1a、R1b的第一半和半径为R2a、R2b的第二半 的波长可根据需要重复多次，并在各拐点之后改变，以提供具有不对称曲形 的特定通道长度。不对称曲形通道46还可具有矩形截面，该矩形截面的宽 高比可根据曲形的不对称性按照需要在通道的长度范围内变化。在一种实施 方案中，宽高比可在1:1至2:1之间变化。在这种情况下，相应于通道46内 的单个平衡位置或势能最低位置，形成单条聚集粒子流48。在其它实施方 案中，如图4C所示，可提供不对称曲形通道，具体的扩展螺旋形通道50， 所述通道具有宽高比基本为2:1的矩形截面，然而宽高比也可以是变化的。 在这种情况下，粒子聚集在相应于通道内的单个平衡位置或势能最低位置与 通道内壁相距一定距离的单条流动线路中。
本文上述的所有通道(包括直线通道、对称通道和不对称通道)的宽高比 可根据不同应用的需要而改变和/或在整个通道范围内根据需要改变多次。 在图4所示的实施方案中，将宽高比示为1:1和2:1，然而本领域技术人员 应当认识到可采用各种宽高比。另外，按照确定宽高比的标准选择宽度与高 度具有一定的随机性，可将宽高比视为第一截面通道尺寸与第二截面通道尺 寸之比，对于矩形通道可以是宽度:高度或者高度:宽度。作为另一实例，如 图9A所示高度为宽度两倍的通道的宽高比，图4C的通道的宽高比可表述 为2:1或1:2。
在上述各几何结构中还可包括其它通道截面。通道截面可包括但不限于 圆形、三角形、菱形和半球形。具有预定尺寸的粒子可在这些示例性截面中 聚集，平衡位置取决于通道的几何结构。例如，在具有圆形或半球形截面的 直线通道中，可在该通道内形成聚集粒子环或弧。在具有三角形或菱形截面 的直线通道中，粒子可聚集在相应于平衡位置的流动线路中，所述平衡位置 与几何结构中的各平直壁面相距一定距离。由于对称和不对称的曲形通道具 有上述各示例性截面，因而聚集流动线路和平衡位置通常可相应于以上针对 具有矩形截面的通道所述的聚集流动线路和平衡位置。
通常，对于悬浮在样品中的粒子，在直线、对称和不对称微流体通道内 存在一些形成最佳有序化和聚集条件的参数。这些参数例如可包括通道几何 结构，与通道几何结构相关的粒子尺寸，流体通过微流体通道流动的性质， 粒子在层流条件下在微流体通道内流动所引起的力。目前认为作用于粒子的 力可称为惯性力，然而其它力也可贡献于聚集和有序化行为。示例性惯性力 可包括但不限于作用于各粒子的惯性升力(沿剪切梯度朝向离开通道壁的方 向)、狄恩阻力(粘性阻力)、源于狄恩流的压差阻力(pressure drag)和离心力。 图5A-7用于示意下述理论中与这些参数相关的构思，其中图5A-5B通常表 示与直线通道相关的参数，图6A-7表示与曲形通道相关的参数。下述理论 仅仅是说明性和示例性的，可应用这些理论预测利用这些原理设计的系统的 性能，所给出的理论不应理解为将本发明限定于与本文所述任意系统实施方 案相关的任意参数或任意具体操作理论。
通常，层流微流体系统(例如本文实施方案中所述的系统)中的惯性升力 可用于使随机分布的粒子连续并快速地聚集在单条流动线路中。可利用粒子 几何形状的相关性开发用于大处理量分离的系统。可改变通道的几何结构以 使通道内的聚集粒子从环形降至四个位置，再降至两个位置，然后降至单一 位置。具体地，沿通道长度在纵向上以及旋转方向上(对于不对称粒子)可观 察到其它两种粒子有序化程度。通常，分离、有序化和聚集主要由粒子尺寸 与通道尺寸之比以及系统的流动特性控制。有利的是，聚集与粒子密度无关。
在切变流动中粒子的横向迁移是由于惯性升力的存在，惯性升力的存在 主要归因于沿剪切梯度朝向壁面的剪切梯度诱导惯性(无界抛物线形流动中 的升力)和将粒子推离壁面的壁面诱导惯性。悬浮在流体中的粒子经受阻力 和升力的作用，所述阻力和升力独立地与系统的流体动力学参数成比例。可 限定两个无量纲的雷诺准数来描述粒子在封闭通道系统中的流动：通道雷诺 准数(Rc)，其描述无扰动通道流动；粒子雷诺准数(Rp)，其包括描述粒子和 粒子平移通过的通道两者的参数。
两个无量纲数群取决于最大通道速度Um，流体的运动粘度，ν=μ/ρ(μ 和ρ分别为流体的动力粘度和密度)，水力直径Dh(定义为2wh/(w+h)，w和 h为通道的宽度和高度)。粒子雷诺准数还取决于粒子直径a。由于Re=2/3Rc， 因而基于平均通道速度限定的雷诺准数可与Rc建立关系。
当粒子雷诺准数的数量级为1时惯性升力支配粒子的行为。通常，在 Rp<<1的情况下，微通道中的粒子流动受控于粘度作用。在这些系统中，作 用于粒子表面的流体粘性阻力使粒子加速达到局部流体速度。没有观察到中 性浮力粒子的稀悬浮液穿过流动线路迁移，进而在通道入口处、沿通道长度 以及在通道出口处观察到相同的分布。当Rp增大时，在宏观系统中出现穿 过流动线路的迁移。在柱形管中，观察到粒子迁移离开管中心和管壁形成聚 集环。这种“管状箍缩(tubular pinch)”效应的理论基础是在具有大的粒子雷 诺准数时作用于粒子的惯性升力的组合。作用于刚性粒子的占主导的力为 “壁效应(wall effect)”，其中如图5A和5B所示壁面附近不对称的粒子尾流 引起朝向离开壁面的升力60和沿剪切梯度朝向壁面的剪切梯度诱导升力 62。描述两个无穷大的板之间的抛物线流形动中升力(Fz)大小的关系式有助 于理解惯性迁移强度如何依赖于系统参数，条件是推导假设Rp<1。
其中fc(Rc,xc)可视为升力系数并且是依赖于粒子在通道截面中的位置xc和通道雷诺数两者的函数，但与粒子几何形状无关。在平衡位置处，壁效应 和剪切梯度升力达到平衡，fc=0。
作用于粒子的惯性升力引起离开通道中心的迁移。根据有关F升力的方程 式，可推出粒子迁移速度Up的表达式，假设斯托克斯阻力Fs=3πμaUp与所 述升力平衡：
对于通过平行板的流动，可使用fc～0.5的平均值，估算离开通道中心线 的横向迁移速度。在Um=1.8m/s的流动中对于10μm的粒子计算得到的值 为3.5cm/s。迁移40μm的横向距离需要在主流中向下游迁移～2mm。前述 有关Up的方程式还表明横向迁移距离强烈依赖于粒径，进而证实了基于差 异性迁移(differential migration)进行分离的可能性。
具有弧度的通道产生了作用于粒子的附加阻力。当向矩形通道引入弧度 时，流体的不均匀惯性引起垂直于流动方向的二次流(secondary flow)。在抛 物线形速度分布图中，如图6A所示的一个实例，在曲形通道中心快速移动 的流体元产生的惯性可大于通道边缘附近的流体元产生的惯性。这些流体元 可朝向通道出口外侧边缘移动，为了使质量在所有位置守恒使流体沿通道的顶部和底部循环。可记录两个无量纲准数来表征这种流动： 基于通道内最大速度的狄恩准数(De)和曲率(δ)。狄恩准数De=Rc(Dh/2r)1/2，曲 率δ=Dh/2r，其中r为通道的平均曲率半径。对于在本文所述的微流体系统 中观察到的中等大小的De<75，副旋流或狄恩流仅由两个旋流组成。狄恩流 的速度大小符合UD～ρDe2/(μDh)，因而所述二次流引起的作用于悬浮粒子的 斯托克斯阻力对于大的De十分重要。具体地，狄恩流速与狄恩准数的关系 可参见图6B。图6B示出了平均流速为1m/s时对狄恩流的模拟，相应于～10 的狄恩准数。图6B中的几何结构在较小转弯处宽度为50μm以及在较大转 弯处为80μm。主流超出页面。图6C进一步示出了对于单一几何结构平均 二次流(涡流)速度随狄恩准数的变化。对于不变的几何结构观察到De和平均 涡流速度之间为二次关系并与理论相符。
通常，狄恩流引起的阻力或狄恩阻力(FD)符合：
如图7所示可基于这两种力即狄恩阻力64和惯性升力66的平衡进行平 衡分离。具体地，图7示出了任意不对称曲形通道的截面，示出了狄恩流引 起的惯性升力造成的四个稳定位置68a、68b、68c、68d的重叠。还给出了 使单个势能最低位置偏置的可能机理。狄恩流引起的占主导的粘性阻力在通 道中线处作用强烈，进而使粒子朝向通道一侧越过另一侧(对于相反的转弯， 所述粘性阻力沿相反方向较小且没有超过惯性力)。粒子70一旦俘获在所述 最低位置即可保持俘获状态，因为两个涡流分岔位置处的粘性阻力64小于 剪切梯度诱导升力66。位于顶部和底部势能最低位置的粒子不能够保持俘 获状态，因为粘性阻力在所述位置同样作用强烈并且沿弱剪切梯度方向。
对于恒定的Rc，升力与阻力之比Rf符合Rf～δ-1(a/Dh)3。对于给定尺寸的 粒子当通道截面内Rf≥1以及对于其它尺寸的粒子Rf<1时分离是理想的。 对于Rf，将粒子推至平衡位置的升力占主导，而对于Rf<1，占主导的狄恩 阻力覆盖这些平衡位置并导致粒子混合。与粒径三次方的依赖关系表明可有 效分离尺寸差异小的粒子。Rf的关系式还表明通过改变几何结构Dh和曲率 δ可将分离调整为分离多种直径的粒子。
理论预测了平衡分离速度的极限。此前忽略了升力/阻力之比Rf与Rc的依赖关系。在考虑到这种依赖关系的情况下，据预测高于最佳值的速度将 导致离散。这是因为惯性升力与通道速度的平方(Um2)和升力系数(fc)成比例， 其中升力系数随着Um的增大而减小。因而，惯性升力以小于Um2的速度增 大。可将惯性升力与狄恩流引起的与Um2成比例的阻力相比。由此得到所述 惯性升力与狄恩阻力之比Rf，Rf随着Um2的增大而减小。
因而，可考虑三种流态：(1)在低流速时，在大部分通道截面范围内Rf可大于1，然而Fz和FD过小而不能够在通道的长度范围内形成聚集流动线 路；(2)在中等流速时，在有限的通道截面区域内Rf可大于或等于1，力的 大小足以使得聚集成一条或多条粒子流；(3)在高流速时，在整个通道截面 范围内Rf小于1，狄恩阻力占主导，进而导致粒子混合。
可利用Rf预测截止粒径，低于该截止粒径时不发生聚集。Rf的大小在 通道截面范围内是变化的，这是由于Fz和FD在该区域内变化。然而目前还 不知道这种变化的函数形式，因而难以针对给定的几何结构事先预测截止粒 径(即在整个通道截面内什么样的粒径使Rf最初小于1)。因而，经验确定的 截止值可给定Rf中的未知参数。然后可将已知的几何结构和截止值插入等 式Rf=1，以确定未知的位置依赖因数的比例。这是因为比率Rf在整个通道 截面范围内开始小于1时的粒径相应于该通道几何结构中的截止尺寸。换言 之，随着粒径减小，Rf降至小于1，进而由占主导的狄恩阻力引起粒子混合。
提供了如下定量半经验关系：首先，形成Rf(xc1)=k(rac3/Dh4)=1的条件， 其中xc1为在通道截面内最终位置的坐标(小于1)，k为比例因数。经验参数 为通道曲率半径(r)、截止尺寸(ac)和通道水力直径。求解一种或多种试验系 统的k使得能够建立可应用于未知系统和截止尺寸的关系：
这种处理假设两个系统均以恒定的Rc操作且与流场相比粒径较小，因 为假设xc1保持与粒径无关。
因而可得到简化表达式，该表达式给出在新的截止值下进行分离的新通 道的几何结构。如果保持相同的曲率半径，则Dh作为截止直径的函数的经 验关系式可记作：
如果高度为决定惯性升力的主导因素并考虑具有大宽度的通道，使得h 为狄恩流的主导尺寸，则上述关于Dh1的等式可改写为h2=h1(ac2/ac1)3/4。通常， 接近中心和外壁的粒子朝向通道外侧边缘移动并沿通道的顶部和底部循环， 直至达到平衡位置。换言之，升力沿着高度起到使粒子聚集于两个位置的作 用，一个位置位于通道对称面以上，另一个位于通道对称面以下，而狄恩力 影响横向位置。根据Rf，可通过改变粒径(a)、几何结构(Dh)和曲率(δ)简单地 控制横向平衡位置。
按照上述通常可应用于所有通道几何结构的理论，参数的不同组合将将 在具有给定几何结构的通道中引起粒子流局域化。通常，在一些实施方案中， 流动样品的雷诺准数可为约1至约250，流动样品的狄恩准数可小于约20， 和/或粒径与水力直径之比可小于约0.5。以下将讨论针对上述理论与一些通 道几何结构更具体相关的性质。
如上所述，图2A和2B示出了具有矩形截面的直线通道的一种实施方 案，示出了在该通道内作用于粒子的力矢量。现参照图8A-8C，更详细地讨 论在这些示例性直线通道内粒子的分离、有序化和聚集。通常以低流速在这 些示例性通道内流动的粒子在通道截面内均匀分布。由于Rp随着流体速度 的提高而增大，因而可观察到在层流流动中粒子分离的图案，所述图案强烈 依赖于通道大小和对称性。如图8A-8C所示，通常在矩形通道中均匀分布的 粒子穿过流动线路迁移至四个对称平衡位置82a、82b、82c、82d，所述平衡 位置位于通道各面的中心并朝向宽高比为1:1的矩形通道80的通道边缘。 在所示实施方案中，在50μm宽的正方形通道中观察到悬浮在水中直径为9 μm的粒子，条件是粒径与通道直径之比为0.18。如图8B所示，示出了入口 区域84，其中粒子最初均匀分布在流体内，但随后很快开始聚集到四个通 道面。图8C示出了聚集程度在沿通道的给定距离处随Rp提高并且还随着沿 通道迁移的距离提高。对于Rp=2.9(Rc=90)，在～1cm的距离之后观察到完 全聚集。
通常，对于给定的粒径，在与通道壁相距特定距离处发生聚集。对于 Rc=90，粒子的平衡位置位于与通道边缘相距～9μm处并与无限平面系统(Rc=100)的理论预测～8μm一致。还预测了对于给定的粒径随着Rc增大该距离 移动接近壁面。聚集发生在通道面处而不是角处，并与角的对称特征无关。 如图8A和8B所示，据推测，占主导的壁效应从两个方向作用于角内的粒 子并形成不稳定的平衡位置。仅有惯性升力允许二维聚集至矩形通道横向面 内的四个精确位置。
现参照图9A-9D，提供了直线通道的替换性矩形几何结构。在一种实施 方案中，可调节直线通道90的矩形截面以形成特定和/或最佳的聚集结果。 具体地，如图9A所示，通道90的截面宽高比可从约1:1变至约2:1。另外， 可采用大于0.3的粒径直径与通道直径之比。当以这种方式调节宽高比和粒 径与通道直径之比时，粒子聚集和有序化可变得更加稳固(即位置偏差较小)。 另外，如图9A所示有序位置从在上述1:1的矩形通道中的4个减少为在最 佳通道中的2个，观察到位于所述两个有序位置94a、94b的粒子相互作用 并穿过通道90有序化。对于从低到高的粒子浓度均出现有序化，其中仅粒 子间距离受浓度影响。重要的是，即使在高的粒子浓度(-50×106/ml)下，粒子 仍沿流动方向均匀间隔。
如图9B和9C所示，新的有序化在流动中提供较紧密的粒子横向位置 分布和改善的粒子间相互作用，进而形成沿流动方向均匀间隔的规则长粒子 链92。如图9B更清楚地示意，可证实在连续流动时对于各种粒子/细胞密度 (<5%)5-15μm大小的细胞和粒子精确有序化。如上所述，几何结构改变使 在正方形或1:1通道内观察到的四个有序位置几乎完全减少为两个有序位置 94a、94b。此外，在通道90内的所述位置处有序化的粒子同样相互作用， 从而在所述位置之间形成均匀的流体缓冲。
在具有2:1的矩形几何结构的一种示例性系统中，粒子均以13.2-13.8 cm/s的速度(平均流速为11.9cm/s)迁移，并且在所述粒子聚集到通道90的 同一侧时，相邻粒子之间显现出42-45μm的中心-中心间隔，但在存在交替 图案时沿流动方向仅相隔23-25μm。还可发现组合形式的这两种图案，一种 图案与另一种图案的具体比例主要取决于粒子的局部浓度，如图9C所示， 如果浓度低，则允许在线列中存在粒子间距。然而，随着局部浓度增大，发 现如图9B所示粒子常常位于通道90另一侧的填隙位置。在6cm通道的末 端间隔的平衡粒子通常与粒径和通道直径成直线关系。
在图9D所示的另一实施方案中，将针对图9A-C所述的条件应用于另 种不同预定类型的粒子。可经由第一输入分支(如图所示的下分支)将第一种 类型的粒子92(示为空心圆)引入通道，可经由第二分离通道分支(如图所示 的上输入分支)将第二种类型的粒子(示为实心圆)引入通道。如图所示，两种 类型的粒子从分离的输入分支移动进入单一通道，有序化并相应于位于通道 相对侧的两个平衡位置聚集在两条流动线路中。当第一种粒子和第二种粒子 为不同类型的细胞时，具有不同化学性质或化学性质特定组合的粒子使得具 有更大的机会观察和控制第一种粒子和第二种粒子之间的相互作用，所述化 学性质使粒子聚集并有序化，从而粒子沿通道迁移时通常在第一种粒子和第 二种粒子之间交替。
尽管针对图9描述的达到所述效果的示例性几何结构具有2:1的宽高 比，但还存在多种明显不是1:1的宽高比也可观察到这些效果。首先，如上 所述，无论是宽度还是高度为另一尺度的2倍，均可观察到所述效果。显然， 将出现使得聚集为两条流动线路而不是四条流动线路的矩形通道对称性降 低，从而两条较长的侧边将具有与壁面隔开并沿壁面方向居中的聚集粒子流 动线路。除了约1:2的比例以外，尺寸比为约15:50、3:5和4:5的矩形通道 也可观察到这种对称性降低。因而，对于约0.3(15/50)至约0.8(4/5)的尺度宽 高比可观察到所述效果，且无论较长的尺度是宽度还是高度均可观察到所述 效果。
还可提供反曲形通道，如前所述，图3A和3B示出了这种曲形通道的 一种实施方案。现参照图10A-10C，更详细地讨论粒子在这些示例性反曲通 道内的分离、有序化和聚集。在曲形通道系统内，粒子和流体引起的附加惯 性力可使对称性降低。这些力可与升力以叠加方式产生作用，以改变在流体 内流动的粒子的平衡位置。如以上在图3B中所示，附加惯性力通常在具有 曲形对称几何结构或反曲形几何结构的微流体通道内沿正y方向和负y方向 产生作用。这种几何结构可使两个稳定位置偏置于通道100的侧面并可减少 聚集于顶部聚集位置和底部聚集位置的粒子数。当力足以使方向偏离时，如 图10A和10B所示仅出现两条聚集粒子线路102a、102b。如图10B所示， 在入口104处粒子在通道100内随机分布。随着Rc在0.5至5的范围内增大， 可出现聚集成两条流动线路102a、102b。随着Rc增大，再次观察到混合流 动线路，这与狄恩阻力的贡献增大一致。
不对称曲形几何结构(例如此前在图4A中所示的几何结构)可使得粒子 聚集的对称性进一步降低。现参照图11A-11D，描述具有不对称构造的示例 性通道110。在不对称形通道中，净力(net force)通常沿一个方向产生作用， 进而使初始分布的单个稳定位置偏置并形成如图11A-11D所示的单条聚集 粒子流112。图11A和11B示出了对于Re=1-15时间平均单向离心和/或阻力 促使聚集为单条粒子流。如图所示，随着De增大聚集变得更加复杂。图11C 进一步示出了在增加沿-x方向的离心力或阻力的情况下粒子聚集于一个最 小势能位置。如图11D所示，与直线矩形通道相比，对于更小的Rp～0.15和 更短的迁移距离(～3mm)也可出现完全聚集。这可能部分地由于狄恩流的混 合作用，进而允许粒子更快地选取稳定的流动区域。图11D还示出了在不对 称曲形通道110的入口114附近呈随机分布的粒子状态、在通道转弯7附近 的第二种分布、以及最后在通道出口附近紧密聚集的粒子流112。
另一示例性不对称几何结构可包括如以上图4C所示的扩展螺旋形几何 结构。现参照图12和13，描述示例性螺旋形通道120的各方面。如上所述， 在仅具有惯性升力的系统中，将粒子推向壁面的剪切诱导升力可与壁面诱导 惯性力达到平衡，所述壁面诱导惯性力将粒子从壁面推开而进入邻近壁面的 平衡位置。在一种实施方案中，对于大宽高比几何结构和曲率，两种重要的 几何特征引起平衡粒子聚集。对于大宽高比几何结构，沿通道120的宽度邻 近顶部122和底部124始终比邻近外壁内部发现通过惯性力平衡的粒子的可 能性大。因而，如图12所示，悬浮在样品中的粒子趋于朝向两个聚集位置 126a、126b聚集。弧度引起狄恩阻力，狄恩阻力将根据位置沿不同的横向方 向推动粒子。如以上在图6A中所示，箭头所示的速度场示出了对粒子产生 的作用的大小和方向。例如，如图12所示，位于中心的粒子将被推向外壁 并穿过外侧边缘顶部或底部循环，直至粒子达到内壁附近的平衡位置，在该 位置狄恩力与来自内壁的惯性力叠加。因而，在一种实施方案中，影响沿通 道高度方向聚集的粒子的主力可以是惯性升力，而狄恩力对粒子的横向定位 具有强烈影响。只要试图将粒子从内壁推离的狄恩力与试图将粒子推向内壁 的来自内壁的惯性升力到达平衡，粒子即可保持聚集。这使得粒子在单流横 向位置沿通道高度聚集成两条平行对称流。除了聚集以外，粒子沿如图13 所示的流动方向以均匀的间隔有序化。高速照相试验显示有序化粒子沿位于 底部124或顶部122的同一条流动线路128流动，或者沿交替的粒子串列流 动。所述行为看起来是随机的，对于所采用的粒子浓度，有序的交替粒子串 列之间的间隔始终小于同一条流动线路中的间隔。
现参照图14，根据任意应用的需要，在各种系统构造中可包括上述任 意示例性通道。然而，通常，图14示出了这种系统200的一种实施方案， 该系统200具有多条如上所述用于粒子有序化和聚集的通道202。如图所示， 系统200通常可包括具有一条或多条入口通道204a、204b的入口206，所述 入口通道经配置可经由过滤机构208将其中悬浮有粒子的样品引入系统 200。还可包括泵送机构210，该泵送机构210可与入口206和/或出口212 相连，以在正压或负压下将样品引入系统200。
可提供微构造基片214，该微构造基片中可形成有任意数量和构造的上 述任意通道。图14示出了微构造基片214中形成的多条通道202，所述通 道经配置可用于接收经由入口206和过滤器208引入的样品。可邻近通道 202的输出通道218设置分析区域216以对聚集粒子流进行监测、分选、计 数、成像或其它分析。可设置输出通道218以使每条通道在粒子流迁移通过 基片的分析区之后接收和/或收集一条或多条聚集粒子流。还可设置一条或 多条输出通道218以通过微流体阀使预定类型的粒子与主粒子流分离。可包 括控制器220以辅助将对聚集粒子进行的样品预处理、泵送、流速调节、阀 操作和任意分析，所述控制器220可包括任意数量的硬件、软件和分析元件。 在聚集之后，可将粒子从输出通道收集到储槽或出口212中以另外进行初始 或附加分析或者废弃。
现更详细地参照上述系统200，可设置一个或多个入口以将样品和/或其 它物质引入系统内的通道中。入口通常可包含入口通道、井或储槽、开口和 便于粒子进入系统的任意其它特征。入口中的开口可位于微构造基片的底部 以允许样品进入设备。入口还可包含适于接纳适宜的管件(例如液相色谱或 HPLC管件)的连接件，可通过所述管件从外部储槽供应样品。入口通常与通 道流体连通且通常位于通道上游。如上所述，样品可在进入通道之前进行稀 释或浓缩，并可设置单独的入口来引入稀释剂或浓缩剂以与样品混合，从而 获得所需的粒子体积比。如下所述，还可设置其它入口用于具有标识或标记 的其它物质，以便于在引入通道之前与样品混合。可设置任意数量的入口和 入口组合。如以下更详细的描述，可以相同的方式设置任意数量的出口来接 收和收集样品和样品中的聚集粒子流。
可采用各种方法识别通道内预定类型的有序聚集粒子。可在样品引入系 统之前、期间或之后，将用于识别或控制通道内待聚集粒子的标识或标记引 入样品。粒子的标识或标记是本领域公知的，例如用于荧光激活细胞分类 (FACS)和磁激活细胞分类(MACS)，在本文所述的系统中可采用任意标识方 法。通常，可采用基于粒子的尺寸、重量、密度、电性能、磁性、介电性、 可变形性、荧光性、表面特性、粒间特性(如粒间间距)和/或旋转特性(如旋 转速度、旋转频率和周期内旋转速度的变化)识别和/或控制粒子的任意相关 技术或方法。在其它实施方案中，可改变粒子的特性，从而可基于其改变的 特性控制和/或识别粒子。例如，可通过在粒子上增加珠体、粒子或其它标 记，改变粒子的尺寸，使得粒子基于其改变的尺寸偏移并聚集到特定的流动 线路中，可能是特定的通道分支或出口。示例性标识可包括但不限于量子点、 五邻体、抗体、纳米珠体、磁珠、分子、反映体、亲和标记珠、微珠、细胞 /细胞信号传导等。对可采用已知标识方法识别或测定的粒子特性的种类或 数量没有限制，条件是只要足以识别所关注的一种或多种特性即可。在1999 年5月21日提交的名称为"Microfabricated Cell Sorter for Chemical and Biological Materials"的美国专利6,540,896、1997年2月26日提交的名称为 "Method for Magnetically Separating Cells into Fractionated Flow Streams"的美 国专利5,968,820和2001年6月5日提交的名称为"Integrated Active Flux Micro fluidic Devices and Methods"的美国专利6,767,706中详细讨论了示例 性标识方法和技术，在此引入所述专利的全部内容作为参考。
如上所述，可在样品引入系统之前对粒子进行标识或标记。作为选择或 另外，在系统中可包括辅助入口以便在引入样品的同时引入标识，从而标识 和样品在进入通道的同时混合。在其它实施方案中，在系统内沿通道长度的 不同位置处可包含入口，使得在粒子聚集之前、期间和/或之后在通道内可 出现标识和粒子的混合。
存在各种使样品在本文所述的通道内移动的技术，通常，系统可包括泵 送机构以将样品引入通道并使样品在通道内移动。泵送机构还可根据需要调 节和控制通道内的流速。可以正泵送构造、负泵送构造或所述两者的特定组 合设置特定的泵送机构。在一种实施方案中，可采用负泵送构造在负压或真 空下将样品引入入口并吸入系统。负泵送构造能够允许处理所有样品，而不 会在通道内留下任何样品。示例性负泵送机构可包括但不限于注射泵、振动 泵、抽吸器和/或真空泵。在其它实施方案中，可采用正泵送构造。可在正 压下将样品引入入口并注入或推入系统。示例性正泵送机构可包括但不限于 注射泵、振动泵、气动泵、活塞泵和/或流体柱。可任选地使一些泵送机构 如振动泵引起的振动衰减，以允许在通道内进行适当地聚集。作为选择，可 利用振动促使粒子和标识在通道内混合。如本领域技术人员所理解的，可根 据系统的要求使用任意其它用于泵送流体的泵。可使用单个泵来满足所有泵 送要求，包括引入样品、调节物质和标识。作为选择，可采用独立的泵送系 统控制独立的样品、物质和标识向系统的引入。通常，可使用气密密封件如 有机硅垫圈使泵与系统面接，尽管还可根据具体构造的需要使用使泵与系统 面接的任意机构。
在系统的另一方面中，可调节和控制通道内的流速。这可包括流速的控 制、流动的阻止、各种输入通道和输出通道之间的流动切换和体积计量。在 具有多条通道的实施方案中，可统一或单独控制样品流速。在统一控制流速 的实施方案中，可根据平行通道的数量按照需要调节泵送机构提供的压力。 作为选择，可采用本领域已知的各种技术(例如包括多通道独立可控注射集 管)实现对各通道内流速的可变和差异性控制。更具体地，可改变输入通道 的分布以使全部平行通道网络脱离。出口可经由与抽吸器连接的单个集管收 集来自所有通道的输出。作为选择或另外，可单独收集各网络的输出来进行 下游处理。可通过泵送机构、阀系统和/或控制器控制流速。
在系统中还可包括任意数量的各种微流体阀，以阻挡或开启通过通道的 增压粒子流。阀可位于或接近任意数量的入口和出口，以及位于或接近通道、 通道分支、泵送机构和控制器。在一种实施方案中，在通道的分支位置可包 括薄悬臂，使得该薄悬臂通常可通过静电吸引移向主通道的一个或另一个壁 面，从而关闭或改变选定分支通道内的压阻。作为选择或另外，可将阀微构 造成静电操作隔膜形式(electrostatically operated diaphragm)，这是本领域公知 的。在多层结构中可使用移动隔膜和柔性膜，使得在压力作用下发生挠曲以 阻挡或改变入口、出口、通道和/或通道分支之中或附近的阻力，并可使流 动重新朝向特定的通道分支和/或出口。包括这种微构造阀的典型工艺可包 括在多层结构中使用例如选择性蚀刻牺牲层。在另一实施方案中，微型阀可 包括形成在通道分支、入口或出口上方的层中的一个或多个移动隔膜或柔性 膜，使得在起动时膜向上扩展以降低通道分支、入口或出口内的阻力，或者 向下扩展进入通道中以提高其中的阻力。可以这种方式根据预定参数定向并 控制通道内的粒子流。在2007年10月5日提交的名称为"Devices and Methods for Cell Manipulation"PCT公开文献PCT/US2006/039441中披露了 微流体隔膜的细节和讨论，在此引入其全部内容作为参考。本领域技术人员 应当认识到可根据需要在整个系统内使用本领域已知的任意微型阀和/或微 构造阀。
在系统的另一方面，可任选地包括一个或多个基于尺寸分离的微流体模 件或过滤器，以通过防止特定粒径或粒子类型进入通道来避免通道堵塞和/ 或促进粒子收集以进行下游处理。通常，可在除去大于最大通道尺寸的粒子 之后注入通道，以避免系统堵塞。在一种实施方案中，可脱离系统进行过滤 过程以将过大和/或过小的粒子(包括灰尘和碎屑)从最终将引入通道的样品 中除去。在另一实施方案中，在系统某处可包括一个或多个过滤器。例如， 可将一个或多个过滤器置于入口之后，使得样品需要经过过滤器进入通道。 可包括一个过滤器以除去大于所需尺寸的粒子，可包括另一个过滤器以除去 小于所需尺寸的粒子。任选地在正泵送机构中也可包括过滤器，使得样品在 过滤之后进入入口。作为选择或另外，可根据需要在系统的特定构造中将过 滤器置于阀系统内、通道内和/或通道出口附近。在其它实施方案中，可在 系统的一部分内连续减小通道尺寸以促使较大的粒子从物质中分离。
可使用本领域已知的各种微流体过滤器将特定尺寸或类型的粒子从样 品中除去。结构过滤器可用于过滤，包括网式过滤器、微构造过滤器板、柱 结构、微柱、亲和层析柱或通道内的限流器。在一种实施方案中，可使用一 个或多个网式过滤器以从样品中分离特定粒子。网式过滤器可机械地防止特 定尺寸的粒子迁移通过网中特定尺寸的孔或间隙。另外，网可基于粒子的尺 寸、形状或可变形性选择性地允许粒子通过。两个或更多个网式过滤器例如 可串联或并联布置以成功地除去尺寸增大或减小的粒子。在另一实施方案 中，在基片的输出区域可包括微柱，例如2007年5月8日提交的名称为 "Microfluidic Device for Cell Separation and Uses Thereof”的美国公开文献 2007/0264675中所述的那些微柱，在此引入其全部内容作为参考。根据需要 在基片上的各种位置可包括微柱以用于过滤。在一种实施方案中，如果另一 过滤器或分析装置漏失待分析并射向特定通道或储槽的标记粒子，则位于下 游的一个或多个微柱可作为过滤器使这些粒子射向附加通道或收集储槽，以 保证收集较大的部分。在其它实施方案中，除了基于结构的过滤器或作为基 于结构的过滤器的替换方案，可采用扩散过滤。
可采用各种方法制造其中形成有通道以用于粒子分离、有序化和聚集的 基片。可部分地基于形成基片所选用的材料选择采用的方法。用于制造微流 体基片的示例性材料可包括玻璃、硅、钢、镍、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、 聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乙烯、聚烯烃、有机硅(例如聚(二甲基硅氧烷))和 它们的任意及全部组合。在这些材料内形成通道的方法同样是本领域已知 的，可包括柔版印刷法、光刻法(例如立体印刷法或x射线光刻法)、模塑、 压印、硅微机械加工(silicon micromachining)、湿法或干法化学蚀刻、研磨、 金刚石切割、X光微影(LIGA)和电镀。例如，对于玻璃，可采用常规的硅 制造光刻技术，随后进行湿法(KOH)或干法蚀刻(使用氟或其它反应气体进行 反应离子蚀刻)。诸如激光微加工等技术可用于具有高光子吸收效率的塑性 材料。该技术由于工艺的顺次特性适用于处理量较低的制造。
对于大规模生产的塑性装置，可使用热塑性注塑法和压塑法。用于大规 模制造紧致盘的常规热塑性注塑法还可用于制造本文所述的微流体基片。例 如，可通过常规的光刻法在玻璃母版上复制基片上所需的通道特征以及其它 特征。电铸玻璃母版以形成韧性抗热冲击导热硬质模。该模具可作为将特征 注塑或压塑到塑性装置中的母版。根据用于制造基片的塑性材料和所得系统 的所需处理量，可选择压塑法作为优选的制造方法。压塑(也称作热压印或 凸印)具有与有益于小结构的高分子量聚合物相容的优势。对于大宽高比结 构，注塑法可以是优选的制造方法，但最适于低分子量结构。
微流体基片(如本文所述的微流体基片)可整体制造或分体制造再进行组 装。在一种实施方案中，基片独立的各层可包含用于单一流体的通道。基片 的各层可通过夹具、粘结剂、热量、阳极结合或表面基团之间的反应(薄膜 片结合)结合在一起。作为选择，在多个片面内具有通道的基片可整体制造， 例如使用立体印刷或其它三维制造技术。
在一种具体实施方案中，基片可由PMMA形成。可采用标准光刻法并 随后采用电镀法将特征(包括通道)转印到电铸模具上。模具可用于在接近 PMMA的玻璃转变温度(105C)的温度下并在5至20吨的压力下将特征热压 印在PMMA上。然后可冷却模具以能够移出PMMA基片。可采用真空辅助 热粘结将用于密封基片由相同或不同材料构成的第二片粘结在第一片上。真 空避免了在粘结区域形成空隙。如本领域技术人员所理解的，基片根据通道 内具体的压力要求以及特定的通道几何结构和尺寸要求的需要由任意材料 或材料组合形成。
如图14所示并如上所述，系统可任选地包括控制器。控制器可包括、 操作连接于、和/或控制设置在基片内和/或基片周围的各种分析设备或分析 器，以在粒子进入分析区域时容纳待处理和分析的聚集粒子以及控制各种流 速、泵送系统和/或阀系统。分析器可包括本领域已知的任意样品分析装置， 例如显微镜、微阵列、细胞计数装置等。分析器还可包括一个或多个计算机、 数据库。存储系统和系统输出(如计算机屏幕或打印机)。在一些实施方案中， 分析器可包括计算机可读介质，例如软盘、CD-ROM、硬盘驱动器、闪存、 磁带或其它数字存储介质，所述介质包括具有一套指令的程序编码，用于对 一条或多条聚集粒子流进行检验或分析。在一些实施方案中，分析器的计算 机执行逻辑或程序编码可装入计算机或由计算机执行，或者通过一些传输介 质如电线或电缆、光纤或电磁辐射传输。当在通用微处理器上执行时，计算 机执行逻辑配置微处理器以形成特定的逻辑电路。在一种实施方案中，计算 机执行逻辑进行本文所述的一些或全部任务，包括样品制备、稀释、浓缩、 泵送、流速调节、探测和/或分析。在一些实施方案中，控制器可位于远离 基片、通道、泵送机构和其它系统部件的位置。例如，基片、通道和其它系 统部件可位于一个房间、建筑、城市或场所，控制器可位于另一个房间、建 筑、城市或场所。控制器经配置可从远程区域与部件无线通信，以对与上述 粒子聚集和聚集粒子分析相关的步骤和装置的任意和所有方面进行配置、控 制、编程和/或其它管理。控制器可采用本领域已知的任意无线技术与本发 明系统中的其它部件进行通信，包括但不限于蓝牙、IEEE802.11标准、Wi-Fi、 宽带无线和/或可通过射频通信、微波通信和红外通信实现的任意无线通信。 控制器可使用点对点通信，单点对多点通信、广播、手机网络和/或无线网 络。控制器还可使用有限网络，例如局域网、广域网和/或Internet。
可预料到的是，本文所述的系统可组装在一起作为诊断和医疗应用的套 件或整体装置。在其它实施方案中，例如在工业应用中，一些、任意和/或 所有部件可在独立的位置单独工作以使规模和/或效率最大化。在一种实施 方案中，用于诊断和医疗应用的套件或整体单元可包括其上形成有通道的微 构造基片、泵送机构、阀、过滤器、控制器和具体应用可能需要的任意其它 部件。在具体装置中部件和通道构造可根据需要改变。在一些实施方案中， 单元可以是开放系统的形式，其中使用者可根据需要更换系统的各种部件例 如基片。在其它系统中，基片可以是封闭系统的形式，其中使用者不能够更 换部件。在任意实施方案和构造中，系统的任意和所有部件可单独使用、可 拆卸、可具有时限、可重新调节和/或可重复使用。
可重新调节系统的任意和所有部件以在至少一次使用之后重新使用。重 新调节可包括本发明系统或系统部件的拆卸步骤的任意组合，随后清洁和/ 或更换具体零件、然后重新组装。具体地，本发明的系统可拆卸，可以任意 组合选择性地更换或取出装置的任意数量的特定零件或部件。在清洁和/或 更换具体零件之后，可将装置重新组装以随即在作业或探测之前在重新调节 设施处使用或由医疗或研究组使用。本领域技术人员应当理解的是，装置的 重新调节可采用各种拆卸、清洁/更换和重新组装方法。这些方法的使用和 所得的经重新调节的装置均落在本申请的范围内。
本文所述的系统可用于各种常规的计数、分选、集中和有序技术。生物 研究领域的需要日益增加，例如需要更精确和有效的方法来控制和分离目标 粒子和细胞群。从免疫和癌症医学到干细胞生物学等学科非常依赖于未污染 特定粒子群和细胞亚群的识别以进行详细表征。临床上，微生物学家出于诊 断目的按照常规分离菌细胞和白血细胞亚群。在癌症患者的循环血液中可发 现肿瘤抗原特异性调节T细胞，提供了转移性黑素瘤免疫学疗法的新的潜在 目标。环境感测要求监督水、食品和饮料加工的特定细菌细胞污染。疫苗开 发者主要利用抗原特异性T淋巴细胞、稀有细胞，所述细胞之间的差别在于 细胞表面存在的肽片段中不超过一个氨基酸。在这些不同的应用中，存在共 同的问题：需要隔离、分离和表征不同种类复杂流体中存在的细胞亚群。在 处理这些样品的过程中，必须小心处理目标细胞群，防止细胞生理学状态改 变，以能够实现随后的表达和分子研究。另外，对于循环肿瘤细胞或疾病特 种T淋巴细胞，所关注的细胞可能以极低的出现率(通常10,000,000个细胞 中少于1个细胞)存在，从而增大了挑战的复杂性。如图15C所示，目标细 胞群在全血中的出现率例如主要根据应用改变，显示出可以等同的特异性和 效率处理少量(10μl)和大量(10ml)全血而不改变细胞整体性的动态分类装置 的必要性。
灵敏的、高处理量、护理点粒子和血细胞控制器的应用远未达到。在遗 传异常产前诊断领域，例如胎儿成核血红细胞有希望成为非侵入性诊断的候 选。然而，母血中成核血红细胞的浓度非常低(1/106个细胞)，目前的细胞分 类技术不适于进行分析。在癌症研究领域，选择性隔离和表征极少(1/109个 细胞)的循环肿瘤细胞(CTC)的能力可改善患者诊断、预测和处理。在本文所 述的本发明系统提供高处理量的情况下，存在隔离细胞出现率更低的极早期 癌症患者的循环肿瘤细胞的潜力。基于自身/非自身识别，T细胞包含识别特 定肽序列的独特表面受体或抗原，尽管T细胞在体内的精确分集是未知的， 但估计值表明在人体血液中存在至少2.5×107个独特的T细胞。当这些细胞 在血液中的出现率极低时隔离这些细胞成为一种巨大的挑战，因而需要大量 待处理样品以隔离统计学上大量的这些细胞。例如，在潜在感染结核病的个 体中，在200,000个外周血单核细胞中，对特定T8抗原具有特异性的CD8+ T细胞的出现率可小于1，由此限制了现有分类和有序化系统的灵敏度。测 定更低出现率的能力有利于疫苗开发和诊断。然而，在给定的1ml全血中， 可能存在小于5个特定的抗原-特异性T细胞(ATG)，这意味着可能需要处理 5-10ml全血样品以获得合理大小的ATG群，这是常规系统以任何时间敏感 方式根本不能够做到的。
因此，本文所述的系统和方法提供了可连续高速地对稀有细胞进行分 选、分离、计数和分析的方式。无论特定细胞是否为稀有细胞，均可以至少 两种不同的方式看到。在表征为稀有细胞的第一种方式中，可将稀有细胞规 定为不会作为给定样品中的大部分自然出现的任意细胞。例如，对于人或哺 乳动物的血液，稀有细胞可以是除受检者血细胞(例如红血细胞和白血细胞) 以外的任意细胞。就此，血液中存在的癌细胞或其它细胞可视为稀有细胞。 另外，母血样品中存在的胎儿细胞(包括胎儿血细胞)应视为稀有细胞。在表 征为稀有细胞的第二种方式中，可考虑细胞在样品中或相对于其它细胞的出 现率。例如，稀有细胞可以是在每毫升血液中以约1至50的出现率出现的 细胞。作为选择，含非稀有细胞的给定群中稀有细胞的出现率可包括但不限 于小于约1个细胞/100个细胞、1个细胞/1000个细胞、1个细胞/10000个细 胞、1个细胞/100000个细胞、1个细胞/1000000个细胞、1个细胞/10000000 个细胞、1个细胞/100000000个细胞或1个细胞/1000000000个细胞。
现参照图15A，提供本文所述系统的粒子分选构造的一种实施方案。具 体地，图15A示出了磁力驱动粒子分选构造250形式的正分选机构。通常可 提供其中形成有一条或多条非对称通道252的微构造基片。还可设置基片的 分析区域，其中各主通道252的输出区域254可包括使主通道252转变为第 一输出通道258和第二输出通道256的岔口或通道分支位置。可制备引入系 统250的样品260，可使具有预定尺寸的目标粒子262射入不对称曲形通道 252以聚集成单条紧密局域化的粒子流。
可将磁标识、标记、标志264或使所关注的粒子具有磁性的试剂引入系 统250并在引入通道252之前和/或粒子262聚集之后进入分析区之前与样 品260混合。如本领域技术人员所理解的，任意和所有常规MACS方法和 技术可用于上述以及参照示例性实施方案进一步说明的本发明系统250。例 如，粒子262可以是与磁珠形式的磁标记264一同培养的细胞，所述磁珠包 覆有对抗细胞特定表面抗原的抗体。这使得表达这种抗原的细胞与磁珠连 接。在其它实施方案中，可通过用还原剂改变细胞质血红蛋白的氧化态，使 特定细胞例如成核血红细胞具有磁性。另外，可基于固有的磁性对细胞进行 分类。内含亚铁粒子的细胞如具有饱和转铁蛋白受体的细胞可基于它们较高 的磁动量与其它细胞分离。在又一实例中，可通过摄入红血细胞中血红蛋白 的磁性，分离含有摄入红血细胞的巨噬细胞与其它巨噬细胞和白血细胞。然 而，在聚集粒子流进入分析区时标记264最终将连接在聚集粒子流中预定类 型的目标粒子262上，与磁性标记264的类型、用于识别粒子的磁性或磁性 标记264引入的位置无关。
如图15A所示，可构造通道252，使得离开通道252的不对称形部分的 标记粒子262和未标记粒子266的聚集流自然流入第二输出通道256。偏磁 要素如磁场梯度和/或磁场268可施加在通道分支位置附近的分析区254上， 使得磁标记粒子262响应于磁场268偏离聚集流一段距离并进入第一通道出 口258而不是第二通道出口256。通过任意通道几何结构(例如通道252的直 线、对称和/或不对称曲形)提供的紧密聚集的粒子流允许这样的构造：仅需 要磁场268引起较小的偏离使标记粒子262射入第一通道出口258。由于聚 集粒子流所需的较小偏离能够实现较高的流动条件，因而允许本发明的系统 以较低的噪声、较好的精度和较高的处理量工作。在一种实施方案中，可分 离具有弱磁动量的细胞，因为需要极小的偏离使紧密聚集粒子流中的流动轨 迹偏离。因而可进一步根据需要对定向的标记和未标记粒子262、266进行 识别、分选、计数、收集和其它分析。本领域技术人员应当理解的是，在该 构造中可采用任意通道几何结构，并可包括任意数量的通道和通道分支位置 以分离粒子流并以平行布局进行分类。
粒子流的精确性对于上述磁分类应用十分重要，因而初始粒子位置的精 度提高使得磁偏离之后错误位置减少且处理量增大。所需的最低惯性力可计 算并用于形成在中心位置变化小于100nm的单条有序粒子流。较弱的惯性 聚集平衡位置可促进标记粒子的磁偏离。可通过分析来自高速照相数据的图 像测定该值，并可根据需要调节通道长度以补偿较低的惯性力。在一种实施 方案中，初始产生强平衡聚集力，然后通过逐渐增大通道宽度逐渐变为较小 力的设计可减小有效通道长度。
图15B示出了本文所述系统的粒子分选构造的另一实施方案。通常， 提供荧光激活粒子分选构造280形式的活性分选机构。类似于图15A，可提 供其中形成有一条或多条不对称通道282的微构造基片。基片可包括邻近各 主通道282的输出区域的分析或探测区域284。各通道282可包括使主通道 282转变为第一输出通道288和第二输出通道286的岔口或通道分支位置。
如同常规FACS系统的做法，可通过用光学敏感标记标记预定类型的粒 子292，制备引入系统280的样品290，所述光学敏感标记是响应于光源294 的作用可探测到的。通常，标记例如通过与粒子相关的标志与粒子或粒子特 征建立联系。标记可以是染料、荧光、紫外线或化学发光试剂、发色团、和 /或放射标记，所述任意标记均可在具有或没有能够实现荧光的刺激事件的 情况下被探测到。在一些实施方案中，一些粒子可在不需要标记的情况下自 然地光学探测到，在其它实施方案中，标记粒子可在不使用光源激励散射响 应的情况下光学探测到。光学敏感标记可在样品290引入系统280之前与样 品290一同制备，或者标记可在样品290引入通道282之后以及粒子292到 达基片探测区域284之前的某一时刻引入。本领域技术人员应当理解的是， 任何和所有常规FACS方法和技术可与如上所述并参照示例性实施方案进一 步描述的本发明系统一同使用。一旦将样品290引入不对称通道282，无论 粒子是否已经过光学标记，具有预定尺寸的粒子均可聚集为单一的局域化有 序粒子流，该粒子流在到达分支位置时将自然流入第二输出通道286。
可将光学组件296设置在基片探测区域284附近且通常可包括光源 294、滤片298、光学元件300和探测器302，所述探测器302围绕通道出口 设置在分支位置之前以探测光学敏感标记粒子292。当聚集有序化粒子流中 各自独立的粒子经过通道280的探测区284时，光源294可照射所述粒子。 在粒子被照射时，探测器302可探测到粒子292和/或与粒子292结合的标 记散射的光，从而识别出预定类型的粒子。基于一些预定参数，探测器302 可向控制器304传送关于经过探测区284的粒子类型的信号。
当预定类型的粒子292经过探测区284并接近分支位置时，控制器304 可通过使用例如任意上述类型的微流体阀在适当的时间起动与第一输出通 道288和第二输出通道286相关的流阻的变化。在一种实施方案中，阀膜或 隔膜305可在正压的作用下在分支位置处扩展到第二输出通道286中，从而 提高样品流动的阻力以防止标记粒子292流入第二输出通道286。以相同的 方式并在合适的时间，阀膜或隔膜308可在负压作用下在分支位置处扩展出 或离开第一输出通道288，从而减小通过第一输出通道288的流阻并允许粒 子292流入第一输出通道。
在另一实施方案中，探测系统还可包括荧光极化(FP)系统。用染料、over free dye标记的粒子的极化改变可实现所需粒子的选通和分类。使用FP，还 可根据尺寸差别进一步分离标记粒子，因为具有不同的尺寸的标记粒子表现 出不同的极化值并可分别分离到独立的出口。探测器测定FP值并向控制器 发出信号，进而控制器如上所述适当地改变通道阻力以使粒子射向适当的出 口。
与图15A的磁系统相同，图15B的荧光系统可提供超越常规系统的明 显优势。由于粒子的准确聚集，仅需微小的方向改变来确定特定粒子的方向， 从而能够实现较高的处理量和较小的噪声。另外，粒子的纵向有序化明显降 低了噪声，因为系统可更可靠地区分沿通道长度各粒子的离散位置，并且输 出分支的流阻改变可更容易地精确定时。经过分离之后，可根据需要进一步 对标记粒子292以及任意未标记粒子进行识别、分类、计数和其它分析。本 领域技术人员应当理解的是在该构造中可使用任意通道几何结构，并可包括 任意数量的通道和通道分支位置来分离粒子流并以平行布局进行分类。
在其它实施方案中，现有的粒子计数系统例如流式细胞计量器、FACS 和/或MACS可包括本发明的系统来提供更精确的粒子技术。纵向有序的紧 密聚集粒子流为预定类型粒子的计数提供了极高的精度。聚集流中的粒子有 序化，使得各粒子可独立地经过基片分析区域内的预定位置以进行计数和分 析，从而消除粒子群聚引起的误差。
在一种实施方案中，本发明的系统可用于浓缩来自稀释样品的预定类型 粒子。可将样品中稀有或稀释的粒子引入具有上述任意几何结构的系统通道 中。可连续高速地对粒子进行分类和聚集以获得浓缩样品，其中与原始样品 相比在最终的样品中预定类型的粒子以明显较高的出现率出现。基片上可包 括源于单条通道和/或多条通道的分支，以将少量聚集粒子从在通道内流动 的原始稀释样品移至容纳浓缩样品的收集储槽。浓缩样品可提供对稀有粒子 和/或源于稀释样品的粒子较容易地分析和控制。
对于各种应用(包括如上所述的分类和计数)可提供任意数量的系统构 造。可设计其它系统构造以获得与在各种通道几何结构内聚集的粒子相关的 某些特定结果和/或性能。在以下实施例中，将更详细地说明与本文所述系 统相关的一些性质。尽管可参照某些性质或参数说明某些试验条件，但应当 理解的是所述性质和参数可广泛应用于任意通道几何结构。因而，本发明的 系统可以各种方式构造以进行识别、分选、技术，从而获得以下实施例中讨 论的任意数量的性质和参数。
实施例1
如将参照图16A-16C的描述，在本文所述的各种通道几何结构中粒子 的有序化和聚集不受粒子相对密度的影响。如图16A和16B所示，当悬浮 溶液的密度改变使得悬浮粒子的密度大于或小于溶液(即正浮力或负浮力) 时，聚集可不受扰动并可保持位置不变。例如，如图16C所示，当同时含有 密度小于(硅油，ρ=0.95g/ml)和大于(聚苯乙烯，ρ=1.05g/ml)悬浮流体(ρ= 1.00g/ml)的粒子时，两种粒子均聚集于相同的位置。粒子密度与粒子聚集的 无关性不符合直接作用于粒子占主导的离心力并且表明狄恩阻力FD是造成 对称性降低的主要作用。
具体地，如以上详述，曲形通道中存在的作用包括(i)作用于悬浮粒子的 惯性(离心)力(Fcfg=ΔmUp2/r)和(ii)流体自身惯性引起的副旋流即狄恩流。对于 恒定的几何结构，狄恩流的平均速度与De的平方成比例。由于这种二次流， 据信两种阻力可作用于半径为a的悬浮粒子。粘性(斯托克斯)阻力 (FD=6πμaUD)和压差阻力(Fp=(1/2)ρπUD2Cda2)可能具有明显作用。单聚集流所 需的速度条件使得能够计算可作用于系统的力的数量级。对于在成功聚集的 通道速度范围内10μm的粒子，Fp小于FD的5%，这表明由于粒径小粘性阻 力(1-10nN)的作用更加明显。然而，随着通道速度增大，压差阻力可能起到 更加主导的作用，因为压差阻力随De的四次方增大，而粘性阻力仅随De的 平方增大。在速度较高的范围内这种贡献可能对粒子运动具有明显的作用， 在所述速度范围内出现多条聚集流。在相同的成功聚集的范围内，作用于流 动粒子的离心力的大小同样小于粘性阻力(Fcfg～0.1-0.4nN)。
基于这种忽略了粒子尾流和与流场相互作用的初步分析，表明导致粒子 偏离稳定位置的占主导的力是狄恩流引起的粘性阻力。另外，密度小于和大 于悬浮流体的粒子经受沿相反方向的离心力(Δm具有相反的符号)且没有聚 集为单一粒子流。这进一步表明狄恩流诱导粘性阻力为控制力。不对称通道 可如图4所示产生影响。在该实施例中沿通道中线的粘性阻力较大，进而导 致方向偏离，而由于叠加惯性升力的作用已位于势能最低位置的粒子保持俘 获状态。这些粒子因在两条涡流分岔或汇合的区域中作用于粒子的粘性阻力 较小而不能够脱出。
实施例2
如图17A和17B所示，在本文所述的示例性通道几何结构中粒子可以 较高的精度和稳定性有序化并聚集。具体地，检验一段时间内聚集粒子流的 稳定性以证实聚集现象在流式细胞计量器和库尔特计数系统中的效用。可通 过10μm聚苯乙烯粒子溶液以Rp=0.24的速度连续流动10分钟所成的图像 表征惯性聚集流的稳定性和精度。在图17A和图17B所示的实施例中，各 图像具有700ms的曝光时间，取1100个经过粒子的平均值。在图17A中， 得到了各粒子流的强度分布曲线，对该分布曲线进行高斯拟合。涉及两个参 数：针对每个时间点提取并绘制的高斯拟合中心位置和半高宽。在图17B中， 在同一个轴上绘出各点的所述两个参数。聚集流的平均半高宽比相同的显微 镜系统中成像的平均粒子半高宽大5%。聚集流中心位置的标准偏差沿y轴 测定为80nm，聚集流的平均宽度仅为单个粒子平均宽度的1.05倍。尽管其 它外力如磁力、光学作用力和介电电泳力也可用于使矩形流场内的特定平衡 位置偏离，但在曲形通道结构中利用流体动力学方法可能是理想的。附加作 用力随着流速增大，仅需极小的几何结构变化来使粒子聚集，而不需要附加 的机械或电子部件。
实施例3
图18A-18D示出了除了通道横断面内的粒子聚集以外还可出现沿流动 线路在纵向上的粒子自有序化。可利用高速成像(2μs曝光)显示出间隔均匀 的特征性粒子长串列，所述特征性粒子长串列在矩形通道内的四个稳定横向 位置之间交替(如图18A和18B所示)或者对于不对称通道集中在单一粒子流 中(如图18C和18D所示)。具体地，图18A和18C示出了流速Rc=120的 10μm粒径。如图18A所示，粒子串列趋于在各位置之间交替而不是重合占 据数个位置。图18B和18D示出了自相关函数(ACF)，该函数证实了在直线 通道中粒子以36μm的平均距离有序化以及在曲形通道中粒子以48μm的平 均距离有序化。
如以上实施例所示，阈值以下的粒子-粒子距离是不利的并造成沿纵向 的自有序化。如图18B和18D所示，与不对称曲形通道相比，在矩形通道 中以较高的Rc观察到较短的优选距离。本文所述的有序粒子串列与宏观系 统相当，其中假设优选距离可归因于剪切流动中旋转粒子周围的二次流的相 互作用。在这种情况下，分离的二次流本身可作为目标。例如，大柱形管(直 径为～1cm)中的刚性粒子(直径为～0.5mm)形成Rc～450以上的长串列且稳 定的粒间间距随Rp减小。在本文所述的系统中，对于较小的Rc～90出现粗 略的有序化。
实施例4
在另一实施方案中，参照图19A-20B可观察到附加粒子有序化和排列。 如图19A所示，与缓冲溶液中的粒子相同，稀释全血(2%vol/vol)中的细胞出 现自有序化。可变形粒子如细胞在外加流场中可经受附加的流体动力，然而 通过试验结果发现全血、液滴和培养细胞在直线微通道和曲形微通道中的表 现如同刚性粒子。图19B示出了通过具有核(表示聚集粒子)的数据卷积由图 像获得的峰值曲线片段。在该实施例中强度表示与平面内粒子符合的程度。 获得了在该系统中速度为15000个细胞/秒的图像。如图19C所示，利用从 连续图像提取的时间序列，可对流经探测空间的粒子进行计数和分析。绘制 粒子间距离的矩形图，示出了能够容易地进行分析的粒子间距极限(5%的粒 子的间隔小于16μm)。在本文所述的通道中还可出现不对称粒子轴向旋转排 列的第四维。
图20A示出了在20ms内流经探测区域的红血细胞空间图。可更清晰 地看到放大的细胞旋转轴向聚集排列。在该实施例中，血红细胞沿图像平面 内的圆盘面排列。具体地，如在图20B中清晰可见，盘状红血细胞旋转排列， 使得圆盘轴平行于矩形通道壁。
实施例5
现参照图21-22，由于分离应用直接基于不同尺寸粒子的差异性聚集， 因而提供了不同尺寸的细胞和粒子的聚集程度。对于曲形不对称通道，在 Rc=0.075-225的范围内检测了粒径范围(2-17μm)和通道尺寸范围(Dh= 10-87μm)。如图21所示，绘出了聚集结果随De和a/Dh比的变化。具体地， 如图21的绘图结果所示，无聚集由实心方块表示，聚集成两条粒子流由空 心三角表示，聚集成单条粒子流由空心圆圈表示，更复杂的行为由实心三角 表示。使用各种尺寸的粒子(2-17μm)以及四种不同的通道几何结构采集该图 的数据。
图21所示的结果普适于落在特定范围内的任意直径比和狄恩准数，而 与特定的几何结构无关。例如，10μm的通道中2μm的粒子应与1μm的通 道中200nm的粒子的聚集程度相同。另外，以恒定的Rc在直线矩形通道中 迁移的横向距离理论上可表现为随a/Dh的三次方增大，进而产生动力学分 离。具体地，图22示出了粒子聚集与a/Dh的关系。对于Re=100的流动， 在入口下游3cm处显示出出口处的拖尾图像。示出了两条分支汇合处的图 像以显示通道之间流动分布的一致性。随着a/Dh减小聚集变得较分散，表明 在沿y方向的面处势井较浅。这符合无限宽通道的极限情况，其中不存在y 力且聚集仅出现在通道底部和顶部。事实上，随着方形通道中粒子的直径比 减小，通道开始表现出圆形通道的特性并沿修正的环形聚集(注意对于 a/Dh=0.04边缘处的高强度)。在给定的距离下，随着Rp按照Fz与Rp2的关系 增大，聚集变得更加受限。
对于不对称系统，狄恩流引起的附加作用与惯性升力一同作用来确定粒 子成功聚集为单一粒子流所允许的粒子和通道尺寸范围。根据试验数据和理 论计算，可限定粒子成功聚集的大范围，其中a/Dh>0.07。在该值以下，与 a/Dh成比例的两种作用可造成聚集损失：(i)惯性迁移速度(与(a/Dh)3成比例) 比在通道的给定长度内完全聚集所要求的速度慢；或(ii)由于a/Dh变小，对 于所有的Rc值狄恩阻力均变得明显大于惯性升力。另一极限为De>20，在 该值以上，对于大多数粒径源于狄恩涡流的阻力大于惯性升力并导致粒子混 合。此外，需要足够大的狄恩流以偏离特定的平衡位置(绘出FD=0.5nN的 恒定平均狄恩阻力线)。最后，实际极限为a/Dh=0.5，此时可发生粒子堵塞 通道。
图21中绘出的数据类似于相图且对于确定正确的设计条件十分重要。 具体地，如果通道几何结构保持不变，则图上的垂直移动相应于粒径改变。 为了实现分离，必须选择相图中小的粒径变化使得聚集流变为非聚集流的区 域(即特定的几何结构)。因而，使一种粒径的粒子聚集为特定的流动线路并 收集所述粒子作为富集部分，而不聚集其它较小的粒子。
实施例6
在其它实施方案中，由于这些系统以高的Rc工作，因而使用这些系统 可实现大处理量的分离，图23A-23C中示出了一种实例。对于1%的粒子溶 液1.5ml·min-1的流速，覆盖1.6cm2的未优化装置可实现～1g·hr-1的质量分 类速度。如图23A所示，通过调节不对称通道几何结构也可分离尺寸接近 的粒子(4μm和7μm)，但处理量稍小。在这些系统中，除了驱动流动的压 力以外没有外加作用力，因而如图23C所示易于级联和并联这些设计元件， 从而将富集度和处理量提高到极高的水平，或者组合不同水力直径的元件以 跨越多个尺寸阈值进行分离。可通过使用如图23A所示的多个出口收集达 到理想纯度的部分，其中在左侧显示出拖尾图像，画面中部显示出聚集，在 出口处显示出四个收集通道，证实了在通道1和3中分离的可能性。图23B 进一步示出了这种分离。入口显示为其中具有随机粒子分布。一种类型的粒 子可聚集并可与其余粒子分离，如图所示可提供三个不同的出口1、2和3。 聚集粒子可射入出口1并收集在如图所示的储槽中，剩余样品收集在出口2 和3中。对于装置面积为15cm2时确定的位移，大多数典型的微流体系统的 处理量为30mg·hr-1。然而，在处理稀有细胞计量和提纯或工业过滤的应用 中，必需提高处理量。
实施例7
参照图24，还提供了刚性粒子、乳液和血液成分的快速分离(1mL/min) 和过滤。在一种实施方案中，调节系统中的流动状态，从而以最大可能的流 速实现最佳的粒子聚集。在本文所述的系统中在各种受控流速下10μm的荧 光珠体显示出拖尾图像。如图24所示，对于小的通道雷诺准数，可看到在 整个通道宽度内粒子随机分布。随着Rp增大，逐渐变为较大通道宽度外侧 边缘附近的一条聚集条纹线。对于大于～2的Rp，粒子流再次变得较分散。 还观察到随着粒子雷诺准数增大聚集条纹线的位置从较大转弯的壁移出。使 用该数据，可采用例如0.9mL/min(Rp=1.53)的最佳流速运行本文所述用于 示例性分离应用的系统。
实施例8
现参照图25-27，可将流速为0.9mL/min的20mL混合物引入系统，所 述混合物是直径为9.0μm和3.1μm的聚苯乙烯珠的混合物。如图25所示， 荧光拖尾图像显示出两种粒径在入口出基本均匀分布的粒子位置。在装置的 出口处，可观察到直径为9.0μm的粒子为聚集条纹线形式，而直径为3.1μm 的粒子保持未聚集。在一种实施方案中，从系统收集五部分并按照图25的 图示进行标记。通过库尔特计数器获得输入溶液和各种输出部分的粒径分 布，在图26A中示出了各种输出部分的粒径分布。直径为3.1μm的粒子的 粒径分布窄且包含几个额外的位于3.6和4.2的峰，所述位于3.6和4.2的峰 相应于两个和三个聚集粒子。对于所有输出部分，均存在大量3.1μm的粒 子，然而从部分5中收集到中值为9μm的粒子分布中的大部分粒子。
如图26B所示部分4还包含一些较大的粒子，其中有趣的是收集的粒 子具有8μm的较低中值，且具有比大粒子的初始分布窄20%的分布。通过 将计数拟合为高斯分布，测定收集粒子的平均和标准偏差。图27示出了从 3.1μm粒子中过滤出大粒子的纯度和产率，其中百分数是指绝对圆锥花序数 (panicle number)。纯度定义为直径为3.1μm的滤出部分在总粒子中的百分 数，产率是回收的3.1μm粒子的百分数。如图27所示，产率和纯度之间存 在确定的折中，可用于确定具体应用的收集策略。
实施例9
参照图28描述了系统的另一实施方案。由于可在相对较短的时期内过 滤大量粒子，因而如果来自5个出口的滤出物汇合到2个池中则类似于图 25所示的分离可容易地串联以达到较高的富集水平。图28给出了具有2层 的级联分离数据。在一种实施方案中，使来自部分1-4的滤出物汇集并再次 经过系统，并对部分5进行相同的操作。在每层记录的关键参数为粒子绝对 数、3.1μm和9μm粒子之比(比率3/9)、富集比(即层X3/9比率除以分层03/9 比率)。该样品由第一次通过的汇集部分1-4组成，使该样品经过系统并再次 收集部分1-4。应当指出的是，在两层分离之后，收集了样品中～56%的初始 3.1μm粒子，其中9μm粒子数减少了3个数量级(即99.9%的纯度)。
实施例10
在该实施例中，示例了可变形粒子的行为。具体地，示出了通常在溶液 中不能够混溶的流体液滴在通道中的聚集行为非常类似于其它粒子。在图 29A-29C所示的实施方案中，非刚性的各种尺寸的硅油液滴也可用本文所述 的系统分离。如图29A所示，可以0.9mL/min的流速将连续分布的硅油液 滴(ρ=0.95g/cm3，μ=10cst)(尺寸范围为<1至20μm)引入系统。具体地，如 图所示，输入的液滴溶液很好地混合。在通过分离通道之后，观察到较大的 液滴聚集，而较小的液滴保持未聚集。借助相差显微法，5个收集部分在大 液滴的含量上表现出明显的差异，相应于图29A所示的聚集流动线路图像 结果。所述部分还表现出如图29B所示的粒径分布，所述粒径分布良好地符 合显微数据。收集部分的连续液滴尺寸分布清楚地示出采用示例性几何结构 时分离的截止尺寸(将部分3的数据拟合为波尔兹曼反曲函数以精确确定 50%贫化位置)。
根据图29B所示的分布，可估计出可以>90%的分离纯度从3μm粒子 中过滤出等量的4.5μm粒子并且50%的3μm粒子被回收。有趣的是，刚性 粒子的截止尺寸类似于可变形粒子。例如，如图29C所示，使用相同的系统 和流动布置使具有不同分布(<2至40μm)的刚性PDMS珠分级。在这种情况 下，确定部分3的截止尺寸为4μm(稍高于可变形粒子)。另一值得注意的差 异是部分5中较小粒子的较大浓度以及部分1-3中较大粒子减少。总体上， 刚性粒子和可变形粒子的分离行为明显相似，大量的大粒子收集在部分5中 并达到较低的程度4(to a lesser extent4)。在两种情况下，部分2在整个尺寸 范围内具有最低的粒子浓度。
实施例11
如图30所示，上述示例性系统的截止尺寸可用于从其它血液成分中分 离血小板(2-4μm)。在一种实施方案中，可采用0.9mL/min的相同流速检验 在稀释血液(PBS中2%的全血)中从血细胞中分离血小板。血液细胞成分的 尺寸为7-15μm(球形白细胞(WBC))至6-8μm×2μm(盘状RBC)，而血小板的 直径为2-4μm。1微升血液包含～5×106RBC、(2-5)×105血小板和 (5-10)×103WBC。如图30所示，通过流式细胞计量器检验稀释至2%的原始 血溶液。血液中血小板与其它细胞成分的初始数量比为0.04。在10mL稀释 血液(200μL全血)通过系统并收集5个不同部分之后，观察到血小板群的富 集或贫化。在部分5中，与较大细胞相比血小板的量贫化到1/2，然而在部 分3中血小板的相对量富集100倍。
实施例12
表明最佳聚集流速的试验数据与理论预测一致，与小Rp的理论假设无 关。如以上图24所示在具有低粒子雷诺准数的通道中Rp，在最大通道速度 (Um)较小时，升力占主导，然而通道中没有足够的距离使粒子达到平衡位置。 如图24所示在具有中等雷诺准数的两条通道中，随着Um增大，升力与阻力 RD之比接近1，此处由于阻力和惯性升力的叠加单个平衡位置是有利的。如 图24所示在具有高Rp的通道中，随着Um进一步增大，Rf在整个通道截面 范围内小于1且聚集受阻力干扰。这些结果表明有限Rp理论应类似于所采 用的小Rp理论取决于增大的流速。
采用确定聚集截止尺寸的试验数据，可建立半实验关系，以预测在给定 截止尺寸下进行聚集的预期几何结构。对于本文所述的具体条件，Rf～1(对 于4.0μm的粒径)，水力直径为90μm，Rc=115。为确定针对截止尺寸ac的新几何结构，可将所述试验参数代入下述方程式：
假设在新系统中曲率半径保持恒定，新的水力直径为所需截止值的函 数：
所述关系表明，对于8μm的截止值，如果宽度保持恒定则对于～95μm 的通道高度需要150μm的Dh。对于基于单一几何结构的力平衡比例关系可 获得该值，从而确定分离几何结构的数值收敛是否进一步支持该方法。总体 上，半经验法提供升力与阻力之比的比例关系，而没有提供各作用力的大小。 可根据基本方程式计算基于升力大小的聚集速度。
可认为血细胞落在介于刚性粒子和可变形液滴之间的连续区间内，然 而，由于液滴经测定具有类似于刚性粒子的截止尺寸(3.7vs.4.0μm)，以上 给出的方程式也可应用于细胞。可变形液滴和刚性粒子之间缺少差异意味着 相似的惯性升力与狄恩阻力之比，而额外的贡献极小。差异(包括分类液滴 的部分5中较小粒子相对减少和部分4中收集范围减小)可源于已知由于流 动中变性而作用于柔性粒子的力，即变形诱导升力，该变形诱导升力额外发 挥作用将可变形粒子推向通道中心。然而在惯性流动中这些差异应较小，因 为对于小液滴惯性升力表现出主导液滴的行为或者当液滴和悬浮流体之间 的粘度比为1或更大时。对于大粘度液滴或细胞，期望液滴的行为近乎刚性 粒子。
实施例13
参照图31，粒子间相互作用在分离中具有一定影响，进而使得具有不 同总体积分数的溶液产生不同的行为。由于系统使粒子聚集为特定的流动线 路，因而可计算出～5%的粒子浓度上限，其中所述粒子相接触并以单一构型 排列。然而，即使低于该浓度，粒子-粒子作用也可限制聚集度。如图31所 示，粒子随机干扰惯性升力和狄恩阻力精确值所需的理想抛物线流体流动。 具体地，图31示出了粒子浓度对有序化的影响。示出了在50μm聚集通道 中流动的9μm珠体的浓度升高溶液的荧光拖尾图像。在聚苯乙烯珠的体积 分数为0.1%时观察到理想地聚集为单条粒子流。在1%时聚集还保持相对未 受扰动。随着浓度进一步升高，聚集较大程度地受到干扰。对于这种几何结 构可能聚集为单条粒子流的最大浓度为～4%，但进行该计算时假设粒子相互 接触且不是实际情况。低于该浓度时聚集仍受到扰动。
实施例14
重新参照图23C以及图30，在惯性聚集过程中可保持细胞成活能力。 由于细胞高速迁移(～0.5m/s)，因而重要的是评价该过程中细胞的成活能力和 损坏。应当注意的是细胞随流体以稳定的状态迁移时其表面仅经受小的法向 和切向应力，而在流体必定使细胞加速的入口和出口区域瞬时经受巨大作用 力。在本文所述的系统中，在入口处通道宽度可任选地逐渐变小以使所述效 应最小化。在通过示例性系统之后通过活体染色发现细胞具有高的成活能 力。在图30中可进一步证实小的损坏，其中处理之前血液的散射曲线宽度 和位置在通过系统之后表现为基本不变。细胞碎片和起泡引起较大的散射分 布。
细胞在高速通过本文所述的惯性聚集系统之后成活能力没有发生明显 变化。即使平均速度为0.5m/s，对细胞也没有可辨识的损坏(使用荧光活体/ 死体测定为99.0%vs.99.8%初始成活能力)。高的细胞成活能力和处理量对 于诸如流式细胞计量等应用至关重要。与现有的流式细胞计量中采用的流体 动力聚集相比，由于惯性自有序化而呈现出明显的优势。所述优势包括(i) 单粒子流输入；(ii)由于纵向自有序化诊断位置中多细胞减少；(iii)对于均匀 散射模式非球形粒子的角取向。这种聚集系统的另一有力优势在于如上所述 以及图23C所示处理量可通过平行通道容易地规模化，因为不需要用于表皮 流体的额外流体通道。图23C证实了高处理量分析的粒子排列平行化。可将 最初随机分布的10μm粒子溶液送入16个平行通道。可使均匀分布的输入 在出口处聚集为16条稳定的粒子流。
实施例15
在该实施例中说明系统的相对分离性能。具体地，重要的是通过确定多 个关键品质图像来表征本文披露的分离实施方案的相对性能，所述关键品质 图像可应用于不同的情况。在多数情况下，难以比较各种技术，因为通常仅 记录一幅最适于应用的品质图像。在该实施例中提出了分离系统性能的四种 可量化测量，从而能够容易地对不同装置进行比较：(1)处理量；(2)富集率； (3)产率；和(4)分离分辨率。由于可通过改变分离条件平衡不同的测量，因 而对于各记录条件应将这些参数记录在一起。将系统的处理量定义为在给定 时间段内分类的体积数。处理量(Qm)由Qm=QΦ给定，其中Q为体积流速，Φ 为输入粒子的体积分数。另外，对于大多数系统而言，增大装置的占地(即 平行度)线性提高装置的处理量。因而，单位面积的处理量(mL hr-1cm-2)是有 用的测量。在一种示例性系统中，在装置面积为2.5cm2的情况下获得了 0.6mL hr-1的处理量。将富集率定义为滤出物中选定粒子/非选定粒子的值除 以选定粒子/非选定粒子的初始分数(sf/uf/si/ui)。因而，富集取决于使非选定 粒子贫化，还取决于保持高的选定粒子产率(sf/si)。在本文所述的系统中，通 过一次之后8-∞的富集率相应于60%-5%的产率。∞的富集率相应于滤出物 中不存在非选定粒子。分离分辨率是成功分离所需的尺寸差的量度(较小值 较好)。将分离分辨率定义为非选定粒子>90%的贫化所需的尺寸差除以选定 粒子的产率。利用图24B，在一种实施方案中，通过一次赋予粒子分离1log 的富集且分辨率为3μm。
实施例16
现参照图32A-32B，在一种实施方案中，对于给定的几何结构提供聚集 大于特定尺寸的粒子而使较小粒子保持未聚集的系统。为研究粒径和通道几 何结构的关系，使10μm和2μm的珠体混合物以不同的流速从具有扩展螺 旋结构的通道中流过。由图32A和32B可知，较小的2μm粒子保持未聚集， 而10μm粒子快速聚集并在螺旋的不同转弯处保持聚集。检测了不同的流速 和与流速无关保持未聚集的2μm粒子，支持了通道几何结构的最佳粒径理 论，小于该最佳粒径时不发生聚集。图32B所示的高速照相结果示出了较大 的10μm粒子聚集在非常接近内壁的单条粒子流中，而2μm粒子分散在整 个通道中。
较大的10μm粒子在大的Rc范围内保持聚集，这是因为占主导的升力 与将粒子推向外壁的副狄恩流平衡。较大的10μm粒子接近内壁聚集，从而 能够实现富集10μm粒子部分几乎100%的回收率。聚集粒子不限于刚性粒 子，也不限于非刚性生物材料。细胞也可成功地聚集为单条粒子流，从而提 供了生物组分高处理量处理的机会。
实施例17
为检验Rc对聚集粒子在螺旋通道中横向位移的影响，对于给定的通道 几何机构和曲率半径，使10μm粒子以大范围的流速(0.1-5.5mL/min)流动。 如图33A-33C所示，在大的Rc范围内粒子保持聚集，且随着Rc增大聚集粒 子串列逐渐横向位移离开内壁。所述结果支持理论并证实在大的Rc范围内 副狄恩流影响单条聚集粒子流横向位移的重要作用。如图33B所示，对于给 定的通道几何结构和粒径，当Rc增大超过特定值时，与惯性升力相比狄恩 阻力占据主导，且单条聚集粒子流开始偏离内壁以形成多条聚集粒子带。Rc进一步增大造成破坏聚集粒子带和混合的复杂流体行为。这表明存在De上 限，超过该上限粒子由于狄恩流占主导而开始混合。除了De以外，粒径与 通道几何结构比以及曲率半径对粒子行为具有强烈影响。
为了研究影响粒子聚集的各种参数之间的关系，以不同的粒径和通道几 何结构进行了不同的流动试验。对于4-700的Rc值，检验了粒径范围(2-15μm) 和通道几何结构(Dh为55-183μm，曲率半径为1.4-9.5mm)。图33C示出了 对于不同的测试条件聚集粒子横向位移结果随Rf的变化。使数据归一化且 所有计算基于n=-0.43。结果证实尽管大小不同但不同的参数以类似的方式 影响阻力和惯性升力的平衡，这与理论预测良好地符合。y轴上大的值表明 Fz>>F阻力，使得聚集粒子与内壁的横向偏离较小。这通过以小的Rc聚集特定 粒径或对于给定的Rc增大曲率半径来实现。增大Rc或减小曲率半径引起横 向偏离内壁。
为了详细研究聚集粒子的横向偏离，混合了不同粒径的粒子并以不同的 流速进行检验。如图34A和34B所示，在低流速时10μm和7μm的粒子聚 集在相同的粒子流中，这表明惯性升力的主导作用超过狄恩阻力。随着Rc增大，两种粒径的粒子被推离内壁，这与如上所述所预测的狄恩阻力的作用 增大相符。然而，与较大的粒子相比较小的粒子受Rc增大的影响更大，并 因而更加远离内壁偏移到新的平衡位置。所述新的平衡位置与存在较大粒子 无关。因而，对于给定的通道几何结构和Rc，粒子始终聚集在预测的平衡位 置。
实施例18
参照图35A-35F，可证实基于螺旋微流体装置内差异平衡偏移的分离应 用。使粒子混合物(10、7、5和3μm)流过通道深度为50μm并具有两个出 口的微流体螺旋装置。通道的一个出口为50μm宽，另一个出口为950μm 宽。根据理论和试验发现，对于任意给定的Rc，所述特定尺寸应允许10、7 和5μm的珠体聚集，而3μm的珠体保持未聚集。如图32A-32F所示，加快 流速将7μm和5μm的珠体推离内壁，而10μm的珠体未受干扰聚集为最接 近入口的单条粒子流并可有效地分离。在该示例性系统中，如图35F所示， 以3.5ml/min的流速，提供了10μm的珠体将近100%的分离。
实施例19
图36示例了利用惯性聚集进行粒子分离。将0.1%w/v均匀分布的平均 直径为3.87μm(4)和7.32μm(7)的粒子的输入溶液引入单一不对称装置(宽度 为100μm(窄)-160μm(宽)，高为50μm，长度为3cm)。通道在出口处分裂 为阻力相等的5条出口通道，收集以Re～8的速度流动的部分。1mL溶液 整体流动10分钟允许通过库尔特计数器分析充足的样品。示出了各部分(编 号1-5并示于图中)的粒径分布图。在各分布图上示出了4(3-5μm)和7(6-8.5 μm)微米粒子之间的体积比。应当注意的是，在部分2中较大的粒子增加两 倍，而在部分5中较大的粒子减少～200倍。
实施例20
图37示出了在对称曲形通道中的聚集行为。当Re值从0.5升至5时， 观察到转变为两条聚集流。当Re进一步升高时，观察到稳定但复杂的行为。 比例尺(Scale bar)为50μm。
实施例21
图38示出了粒子聚集与a/Dh的关系。对于Re=100的流动，示出了入 口下游3cm处位于出口的拖尾图。示出了两条分支汇合处的图像，以示意 通道之间流动分布的均匀性。
实施例22
图39示出了35μm至65μm宽的通道的聚集行为。对于小尺寸平均曲 率半径为32.5μm。当Re为5时观察到聚集为单条粒子流，而在更高和更低 的Re值时观察到聚集为两条粒子流。粒径直径为10μm。比例尺为50μm。
实施例23
图40示出了50μm至80μm宽的通道的聚集行为。对于小尺寸平均曲 率半径为40μm。当Re为2.5时观察到聚集为单条粒子流，而在更高的Re 值时观察到聚集为两条粒子流。在高于Re=25时，观察到更复杂但稳定的 行为。粒径直径为10μm。比例尺为50μm。
实施例24
图41示出了100μm至160μm宽的通道的聚集行为。对于小尺寸平均 曲率半径为80μm。当Re为12时观察到聚集为单条粒子流，而在更高的 Re时观察到更复杂但稳定的行为。粒径直径为10μm。比例尺为100μm。
实施例25
图42示出了350μm至650μm宽的通道的聚集行为。对于小尺寸平均 曲率半径为325μm。当Re为90时观察到聚集为单条粒子流，而在更高的 Re时观察到更复杂但稳定的行为。粒径直径为10μm。比例尺为100μm。
实施例26
图43示出了分离时粒子与聚集的关系。在入口输入10μm和2μm粒子 的均匀混合物，对于(A)绿色荧光10μm粒子以及(B)红色荧光2μm粒子， 在出口处观察到荧光拖尾图像。流速为Re=5。在没有外加作用力的情况下 不同尺寸粒子的流动限流存在明显的分离。比例尺为50μm。
实施例27
图44示出了血细胞以与刚性粒子相同的方式聚集。使在PBS中稀释的 5%全血通过50μm宽的矩形通道。在出口处，下游3cm处，观察到相差方 式的细胞拖尾图。所述拖尾图呈现为灰色通道内的暗流。通道边缘也呈暗色。 对于刚性粒子3，观察到相应于矩形通道面上四个聚集位置的拖尾。
实施例28
图45A和45B示出了培养细胞株的聚集。与粒子相同，可变形细胞聚 集为单条粒子流。图43A示出了细胞的拖尾图，示出了不同Re值时的聚集。 各聚集区的入口示于左侧。对于Re～2在迁移3cm之后聚集成单条线路开始 出现。在图43B中，示出了各转弯处和出口处的强度截面。应当指出的是， 在出口处，聚集流的宽度与单个细胞的直径相当(～15μm)。
试验条件和设备
尽管可采用多种试验条件建立和应用本文所述的示例性系统，但以下给 出用于获得上述结果的一些条件。
材料荧光聚苯乙烯微粒子(密度～1.05g/ml)购自Bangs Laboratories (Fishers,IN)或Duke Scientific(Fremont,CA)。对于4(3.87)μm和7(7.32)μm 的粒子，Bangs Labs产品编号分别为FS05F/7772和FS06F/6316。对于2(2.0) μm、9μm、10(9.9)μm和17μm的粒子，Duke Scientific产品编号为R0200、 36-3、G1000和35-4。通过在磷酸盐缓冲液(PBS)中稀释使粒子混合达到所 需的重量分数并通过添加0.1%吐温20进行稳定。通过在PBS中稀释使粒子 混合达到所需的重量分数并通过添加0.1%吐温20进行稳定。在所述各试验 中，粒子的wt/vol%在0.1%至1%之间变化。通过用2%wt/vol聚乙二醇一 油酸(分子量860，SigmaAldrich)稳定的10%wt/vol DC200(10厘沲，Dow Corning)，形成硅油液滴。剧烈摇动所述混合物并进行20分钟的沉降。从管 形瓶的底部1cm处取溶液以保证液滴的尺寸范围<20μm。通过乙醇(ρ= 0.78g/ml)或浓缩的CaCl2溶液(ρ=1.12and1.23g/ml)制备不同密度的溶液， 这些溶液的粘度在1至3厘沲之间变化。
在含有10%FBS的RPMI1640培养基中培养细胞(H1650肺癌细胞株) 并在使用前使所述细胞经受受胰蛋白酶作用并重新悬浮在PBS中。经过训 练的抽血师将健康志愿者的全血采集到涂有EDTA的vacutainer管中。将血 液稀释在PBS中达到1-5%以用于试验。使用钙黄绿素AM(5μM)、细胞质 染料或Hoescht33342(1μM)(细胞渗透DNA染料)将细胞染色。
微构造采用标准柔性印刷技术制造本文所述的示例性装置。简言之， 使SU-82035以2250rpm的速度旋转30秒以在10cm的硅片上形成50μm 厚的层。使用具有计量焦点(metered focus)的显微镜测量厚度，厚度在晶片 上在42μm至56μm之间变化。使用以40,000dpi印制的聚酯树脂掩模通过 光刻法将图案限定在所述层中(参见计算机辅助CAD文件)。在将基体与交 联剂之比为10:1的PDMS倒在SU-8母版上之后，在真空室中除气并于65℃ 固化一夜。然后将装置从模具上切下，用尖锐的平头针穿出端口，然后用氧 气等离子体粘结在载玻片或盖玻片上。在经过等离子体处理并防止在玻璃基 体上之后，使装置在热板上保持70℃15分钟以增强粘结。
无量纲值对于直线矩形通道，可将Re(惯性力和粘性力之比)容易地定 义为ρUDh/μ，其中ρ为流体密度，U为平均速度，将水力直径Dh定义为 2ab/(a+b)。a和b为通道的宽度和高度。然而，对于曲形通道和不对称曲形 通道，仅取矩形截面并仅考虑矩形截面的Re将过高地估计惯性作用。为了 定义这些几何结构的正确的Re，使用COMSOL Multiphysics进行流体动力 学模拟。根据流体中部节点的惯性力与粘性力的平衡确定Re。该方法也得 到直线矩形通道的分析Re。在不对称通道的情况下，在小转弯或大转弯中 Re不同，为了简便起见在整个研究中使用相应于小转弯的单一Re。例如， 42cm/sec的平均速度相应于50μm×50μm小曲形通道(曲率半径r=40μm) 中Re=5，而对于直线矩形通道Re=20。使用模拟得到的Re计算了狄恩准数。
粒子局域化基于拟合为函数形式的局域化偏差和精度取决于像素大小 (即取样水平)和系统的信噪比(S/N)。将S/N定义为S/N=(I0-Ib)/σ0，即目标的 平均强度减去背底的平均强度除以目标的标准偏差或噪声。由于散粒噪声与 光电子数的平方根成比例，因而这是最大噪声区。对于该系统，使用高度染 色荧光微球体的情况下，通过取一段距离内单粒子流的强度水平的标准偏 差，确定了S/N为60。与之相对，单分子成像系统的S/N通常为4-10。对 于信噪比和330nm的像素取样大小，预计局域化预期精度为～3nm。该结果 使得比该值大出约1个数量级的局域化测量结果能够置信。
图像分析对于流式细胞计量应用以及为了确定粒子流的自相关函数， 使用Matlab(The Mathworks Inc.)进行图像序列分析。首先，对于每次摄制， 选择代表聚集粒子的核图像。然后对所述核图像进行卷积以形成在粒子位置 具有峰值的强度图谱。将相应于粒子在给定画面中的迁移距离的强度图谱限 定区转化为强度时间序列并附加在具有在先画面时间序列的阵列上。对于每 幅画面重复该过程，直至汇集流过探测区的粒子的全部时间序列。利用瞬时 信号确定自相关函数以分析粒子之间的最佳距离和串列长度。应当指出的 是，卷积需增大给定粒子的表观宽度，但进行卷积以从多强度峰原始数据中 得到粒子位置的单峰。
试验设置如本文所述，利用时延荧光显微法进行试验以确定通道内的 粒子位置分布。将溶液引入注射器并通过PEEK管与PDMS装置连接。在一 种实施方案中，如图33所示，系统包括除去任意大碎片过滤区、曲形分离 微通道和5个收集出口。在其它实施方案中，系统包括多个入口和单个收集 出口。PEEK管的出口还与装置的出口连接并通入废料容器或收集管。通过 注射泵(Harvard Apparatus PHD2000)驱动流动。在一种实施方案中，使用在 小曲率半径转弯处宽度为350μm且在大曲率半径转弯处宽度为650μm的曲 形通道。窄转弯和宽转弯的平均曲率半径分别为325μm和890μm。这种几 何结构形成存在狄恩阻力(FD)的不对称系统，小半径转弯处的狄恩阻力是大 转弯处的狄恩阻力的8倍。在示例性实施方案中，整个分离通道由31个单 元构成并卷绕成三个直段(每个直段包括10-11个单元)以减小装置占地，所 述单元由一个小转弯和一个大转弯组成。将PDMS装置安装在倒置荧光显微 镜(Nikon TE2000-U)的载物台上。使用冷却CCD照相机(Spot RT,Diagnostic Instruments)以500-5000ms的曝光时间获得了荧光拖尾图像，所述曝光时间 取决于粒子浓度和流速。将图像采集在Spot软件中并使用ImageJ进行进一 步地分析。
以与倒置荧光成像相同的方式进行共焦成像，不同的是将装置粘结在盖 玻片上以允许物镜选取(objective access)。使用针孔直径为1.05埃里班的40× 物镜。连续扫描z-y面8次，在每个扫描位置的停留时间为0.3ms以获得图 像。
以与倒置荧光成像相同的反式进行高速照相成像，不同的是使用科勒白 光照射目标面。移去所有中性滤光片，灯的最大功率允许使用Phantom v4.2 camera(Vision Research,New Jersey,USA)以2μs的曝光时间成像。对于流式 细胞计量应用，使用32×32像素的采集窗口以10μs的间隔采集图像。对于 较大的单个图像和影像，采用20-70μs的间隔。
在将粒子溶液分为多个部分之后，使用库尔特计数器(Beckman Coulter Zl)分析各部分。库尔特孔的尺寸为100μm，设置增益和电流以观察3-9μm 的粒子。将采集样品稀释400至800倍以充分稀释进行成功的计数。
使用流式细胞计量器(Becton Dickinson FACSCalibur)分析血细胞。以对 数标度观察前散射和侧散射以区分血小板和其它血液成分。调节探测器电压 以获得正确的增益来同时观察较大粒子和较小粒子的散射。样品通常稀释 100倍以进行测量。对于每个样品观察25,000-100,000次计数。
乳液在水相(连续相)中存在乳化剂用于稳定以避免所形成的油滴聚结 的情况下，通过混合硅油和水这两种不混溶相，形成硅油的水乳液。使用动 力粘度为9.35cP以及密度为0.935g/cm3的硅油作为分散相(Dow Corning, Midland,MI;200fluid10cst)，连续相由去离子水构成，并包含2%w/v聚乙 二醇一油酸(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO;Mn～860)以稳定乳液。在剧烈搅拌 5%v/v硅油和水相之后，经由沉降获得不含直径大于约20μm的液滴的样 品以进行随后的试验。具体地，从均匀混合乳液底部1cm处提取乳液，所 述均匀混合乳液已静置20分钟，使得乳液下部2cm处的大液滴完全排除， 如根据作用于浮力球形粒子的斯托克斯阻力所推导出的(v=D2(ρ水相-ρ油相)g/(18η水相)～(3.55×104m-2s-1)D2)。
PDMS珠以非常类似于有机硅乳液的方式制造PDMS(聚二甲基硅氧 烷)珠。以10:1的树脂与交联剂(Dow Corning，Sylgard184)标准比混合PDMS， 但在固化之前将经除气的树脂-交联剂混合物添加到相同的2%w/v聚乙二醇 一油酸水溶液中(PDMS为10%w/v)。在进行涡流混合直至达到所需的尺寸 范围之后，将装有未固化PDMS乳液的试管置于70-90C的水浴中至少3 小时，以使液滴能够硬化为PDMS实心球。试验之前通过如图33所示的装 置的重复过滤器(duplicate filter)进行过滤，将大于约20μm的珠从提取的珠 溶液中除去。总体上，本文披露的实施方案给出与在层流中移动的粒子相关 的非直观现象，所述层流在微通道系统中引起不同程度的有序化。披露了应 用所述现象和主要原理的参数范围，还提出了可能引起有序化的力。本发明 的系统具有多种优势，包括快速连续地处理样品而不需要过滤器或者机械或 电学部件、高处理量应用、低噪声结果以及聚集与粒子形状和密度的无关性。 本发明披露的系统和方法的惯性聚集对于粒子分类应用是理想的，这是因为 粒子定位于单一粒子流的精确性和粒子之间可控的纵向间隔。精确控制粒子 流动线路(即粒子位置的标准偏差小)使得能够以小的粒子位置诱导变化进行 分类。粒子离开平衡流动线路的微小诱导移动将使粒子位置的背底标准变差 产生大的差异并允许在通道中的岔口处高速提取目标粒子而没有高度的第 一类误差。另外，有序化的单列性和规则的纵向间隔确保偏转粒子与流动中 的其它粒子没有明显的相互作用。给出的特定几何结构可用于任意应用以使 惯性流中粒子的相互作用定向，本发明的系统在微观尺度以及宏观尺度上均 可应用。应当认识到本文披露的任意和所有通道几何结构、系统实施方案和 试验参数可以多种方式组合，以实现不同应用中的特定结果。
本发明系统的应用广泛并可用于各种行业(商业和学术应用)。例如，在 生物医药领域，该系统可用于常规技术如FACS、MACS、基于阻抗的粒子 计数、血液过滤、稀有细胞识别和过滤、异源/同源细胞信号传导等。例如， 惯性聚集引起的粒子移动的性质理想地适用于细胞分离和计数技术。当细胞 高速流过微流体通道时，可利用各细胞的极度排列和离散间隔例如通过用荧 光标记或磁性粒子标记细胞对细胞进行单独计数。本文披露的系统和方法具 有多种超越现有稀有细胞分离和计数技术的优势。常采用免疫磁性技术，其 中以抗体涂覆的磁性珠标记所关注的细胞，然而，由于该技术的复杂性和人 工处理步骤，在处理这些样品时出现细胞消亡。所述系统和方法的另一优势 是能够在所关注的位置处进行细胞有序化和分离，而不需要仅适于实验室安 装的庞大设备。诸如本文披露的粒子聚集技术可与已有的免疫磁性标记技术 和微电子技术组合，以设计和构建例如能够处理全血样品而不会遭遇现有技 术的问题的细胞分离微芯片。
可将微电子部件集成在微流体装置中，从而将流体流动和电子操控或探 测组合在单一的装置中。本文披露的系统和方法将为快速筛查患者的多种疾 病创造机会并允许临床医生追踪患者的治疗过程。
在其它应用中，例如在工业中，本发明的系统和方法可能的应用可包括 化妆品、润滑剂、颜料开发，颗粒环境监测，天然油提取，粒子合成和聚合 物球制造等中的用途。在研究中，本发明的系统可用于组织工程学、药物控 制释放机理研究、细胞信号传导研究、蛋白结晶、病毒/细菌捕获、核酸提 纯和化学特种提取等。在农业领域，本发明的系统可应用于开发多相肥料乳 液、多相农药乳液、流式细胞计以及血液分析。本发明的系统和方法存在各 种可能的应用，广泛覆盖所有研究、工业和商业应用。
本领域技术人员应当认识到基于上述实施方案的本发明其它特征和优 势。因而，本发明不受限于具体示例和描述的内容，而仅限于所附权利要求。 在此并入本文列举的所有出版物和文献的全部内容作为参考。
机译： 通道中的粒子聚集方法和系统
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机译： 通过液相电等离子放电使粒子聚集的系统和方法
