肽组合物和用于治疗肺损伤、哮喘、过敏反应、血管性水肿、全身性血管通透综合征和鼻塞的方法

摘要

本发明提供了末端结合蛋白3(EB3)和3型1,4,5-三磷酸肌醇受体(IP3R3)之间相互作用的肽抑制剂。还提供了用于治疗包括急性肺损伤(其可包括肺血管通透性过高)在内的肺损伤、血管渗漏、水肿发展、哮喘、过敏反应、血管性水肿、全身性血管通透综合征以及鼻塞的方法和材料。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于治疗肺损伤的肽，所述肺损伤包括炎症介导的血管 渗漏和水肿发展。本发明还涉及使用所述肽治疗哮喘、过敏反应、血管性水 肿、全身性血管通透综合征和鼻塞。

背景技术

微管(MT)细胞骨架提供了内皮屏障调节的一个重要控制点；但是，这种 关键骨架元素的作用还没有得到很好的研究。MT稳定药物紫杉醇显示出在 小鼠模型中缓解肺损伤，从而证明MT在介导增加肺血管渗透性中可能起到 重要作用。然而，紫杉醇具有一般毒性，对医生和患者而言它并不是方便的 药物。

微管末端结合蛋白是高度保守的与生长中的微管(MT)相结合并抑制 MT灾难性事件的微管正端跟踪辅助因子。两个这样的末端结合蛋白，EB1 和EB3，在调节内皮细胞骨架动力学和细胞形态的改变中发挥作用，是内皮 屏障渗透性的主要决定因素。

Ca²⁺是调节内皮通透性和血管稳态的一种高度通用的第二信使。磷酸酶 Cβ(PLCβ)的激活，处于PAR-1激活下游，其介导二磷酸磷脂酰肌醇 (phosphotidyl inositolbisphosphate，PIP2)水解成1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和甘油 二酯(DAG)。IP3刺激从IP3-敏感的细胞内储备库(即，内质网(ER))中释放 Ca²⁺。钙离子从ER储备库中Ca²⁺消耗由ER膜上IP3R的活化进行介导，并 导致细胞内Ca²⁺瞬间升高。Ca²⁺内流或“流入”是由瞬时受体电位通道(TRPC) 所介导的，所述瞬时受体电位通道对于各种阳离子，包括Ca²⁺和Mg²⁺是可 透过的。TRPCl和4是内皮肺微血管细胞中的库操纵性Ca²⁺通道(SOC)，其 由ER耗竭所激活。

细胞内Ca²⁺浓度增加上调蛋白激酶Cα(PKCα)的活性。PKCα是响应于 多重介导子2的内皮通透性的关键调节子。PKCα对p120-连环蛋白进行磷 酸化并介导其与VE-钙粘蛋白解离，从而导致VE-钙粘蛋白的内化。PKCα 还通过磷酸化P1l5RhoGEF和GDI-1而作用于RhoA活化的上游。RhoA蛋 白随之通过激活Rho激酶(ROCK)而促进肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)的磷 酸化诱导抑制。MLCP的抑制伴随着MLCK的Ca²⁺/钙调蛋白依赖性活化， 其导致MLC的磷酸化并诱发响应于促炎介质如凝血酶和组胺的肌动球蛋白 (acto-myosin)收缩。

MT细胞骨架的完整性是IP3诱导的从ER存储中释放Ca²⁺所必须的。 MT失稳剂或MT稳定剂，诸如噻氨酯哒唑、秋水仙素和紫杉醇，导致MT 动力学变化抑制Ca²⁺的IP3-门控释放，这表明MT动力学对于IP3R的完全 活化是必须的。MT细胞骨架参与了ER的重塑，从而保证组织和钙波的传 播响应于外部刺激。通过EB1和EB3与基质交感分子1(STIM1)的直接作用， ER与MT生长端相连并随之伸长。HeLa中剔除EB1(HeLa细胞不表达EB3) 降低ER突出事件，但是并没有抑制毒胡萝卜素导致的SOC激活，暗示一些 其他的机制参与了上皮细胞中SOC的激活和钙信号的传播。在内皮细胞中， IP3R在细胞膜穴样内陷中的定位对于ER Ca²⁺库耗竭和SOC激活而言都至 关重要。这表明，IP3R的激活和/或其对IP3的反应性是钙信号传导的重要 元素。因此建议MT细胞骨架正调节IP3R激活以响应于IP3，并从而穿过细 胞发送胞外信号，引发生理反应。

尽管在美国有先进的医疗支持，但每年仍有约100,000名患者死于急性 肺损伤(ALI)，急性肺损伤是与发生败血症时中性粒细胞浸润以及细胞因子 和炎症介质释放相关的复杂炎症反应。肺血管通透性过高是该疾病的一个特 征，导致肺水肿的形成。因此需要新的治疗方法来预防或治疗内皮屏障功能 障碍。

发明内容

本文提供了一种分离的肽。所述肽包括KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO: 1)、FTEIPTI(SEQ ID NO:3)以及它们的片段或变体。该肽也可由 KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1)、FTEIPTI(SEQ ID NO:3)以及它们的片 段或变体构成。所述变体可包括保守取代。所述变体可包括任何含有 Ser/Thr-x-ILE-Pro序列的肽序列，所述Ser/Thr-x-ILE-Pro序列是最小EB结 合共有基序序列。该肽可经肉豆蔻酰化或连接至载体肽。所述载体肽可以是 触角足肽(AP)。该肽可以是药物制剂的一部分，所述药物制剂还可包括药学 上可接受的赋形剂。

本文还提供了一种治疗肺损伤的方法，该方法可包括向有此需要的患者 施用包含所述肽的组合物。肺损伤可以是水肿、炎症介导的血管渗漏或哮喘， 可以是过敏性哮喘。所述过敏性哮喘可以是慢性或急性的。

本文还提供治疗全身血管通透性综合征的方法，该方法可包括向有此需 要的患者施用包含所述肽的组合物。该综合征可因内毒素血症、创伤或多次 输血引起。该综合征也可由药物治疗的副作用引起，所述药物治疗可以是全 身使用IL-2以治疗癌症。

本文还提供了一种治疗血管性水肿的方法，该方法可包括向有此需要的 患者施用包含所述肽的组合物。该血管性水肿可以是过敏原诱发的血管性水 肿或非过敏原诱发的血管性水肿。过敏原诱发的血管性水肿可以是喉部血管 性水肿，其可以随食物过敏或膜翅目昆虫螫咬伤而发生。非过敏原诱发的血 管性水肿可以是补体因子1抑制剂缺乏或成像造影剂诱发的血管性水肿。

本文还提供了一种治疗过敏反应的方法，该方法可包括向有此需要的患 者施用包含所述肽的组合物。该过敏反应可以是过敏原诱发的或非变应性过 敏样反应。所述非变应性过敏样反应可以是由造影剂引起的。

本文还提供了一种治疗全身性血管通透的方法，该方法可包括向有此需 要的患者提供包含所述肽的组合物。所述全身性血管通透可与内毒素血症相 关。

本文还提供了一种治疗鼻塞的方法，该方法可包括向有此需要的患者提 供包含所述肽的组合物。所述鼻塞可与过敏性或非过敏性鼻炎相关。鼻塞可 以是刺激相关的或者呼吸道病毒相关的。

附图简要说明

图1显示EB3的剔除抑制了响应于激活蛋白酶活化受体(PAR)-1的从储 备库中释放Ca²⁺。A.表达任一shRNA至EB1、EB3和萤光素酶的HMVECs 中加入Fura2-AM以及在不存在[Ca²⁺]₀和存在细胞外Ca²⁺(1.5mM[Ca²⁺]₀)的 情况下，计算用凝血酶(50nM)刺激细胞后的340(Ca²⁺结合)Fura/380(不含有 Fura)比率。箭头，凝血酶加入时间。应当注意EB3的剔除显著降低了细胞 内Ca²⁺浓度的增加。B.图中显示了凝血酶诱导的Ca²⁺释放和进入的平均值 ±SD，计算作为超过基准值的最大增值。该增值归一化至来自同一盖玻片的 对照非转染细胞(n＝9)。

图2显示了肺部炎症时EB3与IP3R3和TRPC1的相互作用。WT和TLR4 KO小鼠接受了10mg/kg体重的内毒素脂多糖(LPS)的单次腹膜内注射(IP)， 内毒素脂多糖是革兰氏阴性细菌的外膜成分，会引发哺乳动物中强烈的免疫 反应。在指定的时间分离肺。从全肺匀浆中将EB3进行IP化(IP’ed)。所得 沉淀用于探查TRPC1、IP₃R₃和EB3。需要注意的是TLR4(LPS受体)的剔除 改变了EB3与TRPC1的相互作用。它还阻止了与IP₃R₃结合的增加。还需 要注意的是，在TLR4^-/-肺中EB3与IP₃R₃结合不亚于WT。数据代表了2个 独立的实验。

图3显示了人类IP3R(IP3R3型的794-814位氨基酸)与EB结合基序(以 红色突出显示)的比对。该IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)如下显示为绿色。

图4显示了条带表示的EB3结构(品红色)和对接在EB3的EB3疏水结 合槽中的IP3R3衍生肽(SEQ ID NO:1)(绿色球和棒)；所示为经180°旋转。 联合使用Z-Dock程序和Discovery Studio3.0软件进行对接IP3R3衍生肽。 所述肽和EB3之间的结合能经计算为-68.882kcal/mol。

图5显示了IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)抑制了响应于PAR-1的激活从ER中 释放Ca²⁺。A.用AP-结合IP₃R₃肽或对照(AP)肽进行预处理的HMVECs中 加入Fura2-AM，并在不存在和存在细胞外Ca²⁺的情况下，计算用凝血酶(50 nM)刺激细胞后的340/380比率。箭头，凝血酶加入时间。B.图中显示了凝 血酶诱导的Ca²⁺释放和进入的平均值±SD，计算作为超过基准值的最大增 值。该增值归一化至来自同一试验的对照非处理细胞(n＝4)。

图6显示了IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)在离体肺标本中抑制EB3和IP₃R₃之间的相互作用。经分离的肺进行了20分钟的平衡灌注，随后进行30分钟 的10μΜAP-IP₃R₃肽灌注。在5分钟之后，用30μΜPAR-1激动剂肽TFLLRN -NH2(PAR-1a.p.)灌注20分钟(IP₃R₃＋PAR-1组)。另一组仅用30μΜPAR-1 激动剂肽(PAR-1组)灌注。随后，肺用于制备肺组织匀浆，其用于确定IP₃R₃肽对EB3/IP₃R₃相互作用的影响。EB3用特异性抗体进行免疫沉淀，获得的 沉淀物用于探测EB3和IP₃R₃。需要注意的是，与基准水平(对照组)相比， PAR-1受体激活显著增加EB3/IP₃R₃相互作用(PAR-1组)，然而在激活的肺微 血管中丰富的IP₃R₃肽抑制了这种相互作用。

图7显示了IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)减少了响应于PAR-1的肺血管渗透 性(K_f,c，微血管过滤系数)的增加。离体肺进行了20分钟的平衡灌注，随后 进行30分钟的10μΜAP-IP₃R₃肽灌注。在5分钟之后，于K_f,c测量之前， 用30μΜPAR-1激动剂肽TFLLRN-NH2(PAR-1a.p.)灌注20分钟(IP₃R₃＋ PAR-1组)。每组n＝3-5。ANOVA测得，Bar＋SD*P<0.05。需要注意的是， 在含有丰富IP₃R₃的肺中响应于PAR-1激活的血管通透性并没有显著变化。

图8显示了IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)减轻在LPS诱发的炎症时肺中嗜中 性粒细胞的浸润。小鼠接受单次腹膜内注射LPS(30mg/kg体重；大肠杆菌 LPS0111:B4，LD50剂量)，并分别在2和6小时用于分析。肺用PBS进行 灌注、称重、冷冻并用于测量肺髓过氧化物酶(MPO)活性，其为肺部肺中性 粒细胞(PMN)的标度。N＝6只小鼠/组。

图9显示了IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)防止LPS诱发的败血症的致死性。 在LPS注射前用IP₃R₃肽处理的小鼠证实了LD50-(30mg/kg的LPS，A)和 LD90-挑战(50mg/kg的LPS，B)对照小鼠中的死亡率降低。ANOVA测得， (n＝11-15只小鼠/组，p<0.001AP-IP₃R₃组与对照组处理(AP对照)。在眼窝 后静脉注射IP₃R₃之前，用氯胺酮，10mg/ml；甲苯噻嗪，0.25mg/ml和乙 酰丙嗪，0.25mg/ml的混合物麻醉小鼠。

图10显示了IP₃R₃肽(SEQ ID NO:1)防止多微生物败血症的致死性。用 IP₃R₃肽处理的小鼠体现了CLP后的120小时内降低的死亡率。在CLP手术 前30分钟，以及手术后24小时和48小时用IP₃R₃肽(1μΜ/kg体重)静脉注射 6-8周龄CD-1小鼠。在中点位置结扎盲肠并将盲肠内容物轻轻推向远侧部 分。使用16号针头沿肠系膜至反肠系膜方向在盲肠结扎点和尖端之间的中 间位置进行穿刺。少量粪便从肠系膜和反肠系膜穿透孔中挤出。在假手术对 照中只进行剖腹探查术。将小鼠麻醉。IP₃R₃肽组的存活率显著高于对照组(n ＝10只小鼠/组)。死亡率差异由log-rank检验(P<0.05)进行评估。

图11显示了对小鼠存活的IP₃R₃肽的剂量响应。用指定剂量IP₃R₃肽处 理的CD-I小鼠用LD80剂量(50mg/kg，LPS)的LPS进行静脉注射，并监测 5天。成活率(％)相对于对数刻度的肽剂量作图。S形剂量-响应曲线由数据 点进行拟合。n＝10只小鼠/组。在眼窝后注射肽之前，在麻醉诱导室中用空 气中2.5％异氟醚对小鼠进行麻醉。在静脉注射时，在室内空气中的麻醉诱 导室。静脉注射时用特别设计的啮齿动物口罩与同轴管(哈佛仪器，AH 72-3026)维持麻醉。

图12显示了与EBIN(SEQ ID NO:3)(绿色棒)和IP₃R₃肽(黄色棒)(SEQ  ID NO:1)络合的EB3(品红色)条带示意。对于IPR和EBIN，计算结合能分 别为-68.882和-60.251。

图13显示了EBIN(SEQ ID NO:3)抑制IP3R3和EB3之间的相互作用。 用1μΜAP-EBIN或对照肽(AP)预处理的HPAECs用50nM凝血酶进行挑战。 EB3和IP₃R₃之间的相互作用在凝血酶刺激后不同时间点进行分析。EB3用 特别的抗体进行免疫沉淀，所形成的沉淀物用于探查EB3和IP₃R₃。EBIN 明显降低基准和凝血酶处理后的EB3-IP₃R₃相互作用。

图14显示了MYR-EBIN(SEQ ID NO:3)缓解激动剂诱导的细胞内钙增 加。HPAEC单层用50nM凝血酶(A)或90μΜ组胺(B)进行刺激后的[Ca²⁺]i 瞬态。平均值；n＝20个细胞。箭头，刺激时间。需要注意的是EBIN(蓝色 示踪剂)显著降低了在对照肽(损失结合的；FAEIPTI(SEQ ID NO:4))处理的 细胞(红色示踪剂)中的[Ca²⁺]i瞬态。

图15显示了EBIN(SEQ ID NO:3)减弱了激动剂诱导的内皮细胞旁通透 性过高。HPAEC单层跨内皮电阻(TER)的变化响应于50nM的凝血酶(A)和 50μΜ组胺(B)。TER值归一化至基准电阻。MYR-EBIN(红色曲线)防止了响 应于凝血酶和组胺的细胞形态变化和细胞旁通透性过高，而在对照肽处理的 细胞(蓝色曲线)中观察到细胞形态变化和细胞旁通透性过高。

图16显示了EBIN(SEQ ID NO:3)抑制激动剂诱导的NO产生。HPAECs 用对照肽(活性缺失)或Myr-EBIN进行预处理，且在首次20分钟刺激中测量 基底(A，响应于L-精氨酸的加入)和激动剂诱导(B，凝血酶和组胺)的NO产 生。EBIN丝毫不影响基础NO水平，但显著减弱激动剂诱导的NO。*，p <0.01和**，P<0.01。

图17显示了EBIN(SEQ ID NO:3)防止组胺诱导的体内血管扩张。小小 鼠清醒血压测量–小鼠经麻醉并手术准备放置动脉(颈动脉)和静脉(颈外) 导管。在手术后一小时，直接用压力传感器监控血压。随后通过颈静脉导管 进行AP-EBIN肽的静脉注射(i.v.)(1μΜ/kg体重；绿色)或对照AP肽(红色) 和组胺(10mg/kg体重)；箭头指示注射时间。需要注意的是，EBIN对基线血 压没有影响，但防止了响应于组胺的血压下降。n＝6只小鼠/组。

图18显示了EBIN(SEQ ID NO:3)防止LPS诱发的败血症致死。用EBIN 处理的小鼠体现了在注射LD90剂量的LPS(50mg/kg大肠杆菌LPS0111： B4)后120小时时间段里死亡减少。雄性CD1小鼠通过腹腔(i.p.)注射LD90 剂量的LPS进行挑战。试验组和对照组接受与细胞透膜触角足肽(AP)的C 端相连的EBIN或单独的AP以1μM/kg的浓度进行眼窝后静脉(i.v.)注射。 小鼠经注射三次，LPS给药前30分钟和LSP给药后1小时和24小时。在眼 窝后注射之前，用氯胺酮(10mg/ml)、甲苯噻嗪(0.25mg/ml)和乙酰丙嗪 (0.25mg/ml)对小鼠进行麻醉。

图19比较了EBIN(SEQ ID NO:3)进行预处理和后处理对LPS诱发的败 血症致死的影响。用EBIN处理的小鼠体现了在注射LD90剂量的 LPS(50mg/kg大肠杆菌LPS0111：B4)后120小时时间段里死亡减少。雄性 CD1小鼠通过腹腔(i.p.)注射LD90剂量的LPS进行挑战。试验组和对照组在 以1μM/kg的浓度的LPS和Myr-对照失去结合的肽处理前30分钟(预处理) 和30分钟之后(后处理)接受尾静脉(i.v.)注射Myr-EBIN。预治疗组，小鼠注 射三次，LPS给药前30分钟和给药后1小时和24小时；治疗组，小鼠注射 两次，LPS给药后30分钟和24小时。在眼窝后注射之前，用氯胺酮(10mg/ml)、 甲苯噻嗪(0.25mg/ml)和乙酰丙嗪(0.25mg/ml)对小鼠进行麻醉。用EBIN后处 理显示出一些但并不显著的存活提高。

图20显示了EBIN(SEQ ID NO:3)防止IgE介导的过敏性反应后皮下血 管渗漏。小鼠在耳部(A)和背部(B)接受皮内注射IgE抗体-人血清白蛋白，24 小时后，静脉注射伊文思蓝(Evans Blue)和HSA(1-3)或生理盐水(4-5)。在HAS 之前30分钟，组1和组4接受盐水，组2接受对照肽(失去结合)以及组3 和组5接受Myr-EBIN静脉注射(1μΜ/kg)。需要注意的是，HAS注射导致局 部血管渗漏，这被EBIN明显缓解(第3组)。C.条形图证实了伊文思蓝的血 管渗漏。伊文思蓝从耳组织中提取并在λ＝620nm测量伊文思蓝浓度，并归 一化至组织重量。*，p<0.05，n＝6只小鼠/组。

图21显示了EB3在炎症诱导的内皮屏障通透性过高中的作用。EB3建 立生长中的MT与IP₃R₃之间的瞬态相互作用，使IP₃R₃对IP3敏化，并正调 节炎症过程中由储备库释放Ca²⁺和SOC依赖性Ca²⁺内流。这将通过PKCα- 介导的p120-连环蛋白的磷酸化和肌动球蛋白收缩而导致Ca²⁺信号传导放大 和通透性增加。

具体实施方式

本发明人得到惊人的发现，即由3型1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)受体(IP₃R₃) 的EB3-相互作用域衍生得到的肽降低了末端结合蛋白3(EB3)和IP₃R₃之间 的相互作用，并减轻了与细胞形态变化相关的血管内皮通透性响应。

基于下面给出的实施例，但不被理论所束缚，EB3在炎症诱发的内皮屏 障通透性过高中的作用在于其建立生长中的MT末端与IP₃R₃的瞬态相互作 用的能力。其结果是EB3使得IP₃R₃对IP3敏华，且正调节从内质网(ER)释 放Ca²⁺。这导致了SOC依赖性Ca²⁺内流和Ca²⁺信号传导放大。胞质Ca²⁺浓 度的增加诱发p120-连环蛋白的PKCα-介导磷酸化，导致VE-钙连蛋白的粘 连的解体。这也有利于RhoA蛋白依赖性肌动球蛋白收缩从而导致细胞形态 变化。参见图21。

以下描述的方法和材料减轻了与细胞形态变化相关的血管内皮通透性 响应，并因此可用于治疗肺损伤，包括肺部炎症介导的血管渗漏和肺水肿或 者任何其他器官水肿的发展，这可能与败血症、过敏性反应或急性免疫响应 有关。所述方法和材料也还可以用于缓解病理过程，诸如慢性炎症、癌症、 哮喘和动脉粥样化形成时的慢性血管渗漏。

1.定义

本文所用的术语仅用于描述特定实施例，并不旨在进行限制的目的。如 在说明书和所附的权利要求书中，单数形式“一个”、“和”和“所述”包括复数 引用，除非上下文另有明确规定。

对于本文数值范围的描述，之间插入的每个数值可被明确地预期具有相 同程度的精度。例如，对于范围6～9，除了6和9之外，还可设想数值7 和8，对于范围6.0～7.0，则可明确地预期数值6.0、6.1、6.2，6.3、6.4、 6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。

a.片段

本文所使用的“片段”意指参考肽或多肽或核酸序列的一部分。

b.同一性

在本文中描述两种或更多种多肽或核苷酸序列时，“相同”或“同一性”意 指所述序列在特定区域中具有特定百分比的残基或核苷酸是相同的。该百分 比可以如下计算，最优化地比对两个序列，在指定的区域内比较两个序列， 确定在两个序列中均出现的相同残基的位置的数目从而得到匹配位置数，将 匹配位置数除以指定区域的位置总数，并将结果乘以100得到序列同一性的 百分比。在两条序列具有不同长度或者比对产生一个或多个交错末端，所述 比较的指定区域仅包括单一序列时，单一序列的残基包括在计算的分母中， 但不包括在分子中。

c.肽

本文中使用的“肽”或“多肽”可以指氨基酸的连接序列，并且可以是天然 的、合成的，或者天然和合成的序列的修改或组合。

d.基本上相同

本文中使用的“基本上相同”意指第一和第二蛋白质或核苷酸序列在6～ 100个或更多氨基酸或核苷酸的区域中至少有50%～99%的同一性。

e.治疗

“进行治疗”、“治疗”或“以治疗”每个都意指临时地或者永久地缓解、压 制、抑制、消除、预防或减缓病况或疾病的症状出现、临床体征或潜在病理。 预防病况或疾病包括在疾病发病前将本发明的试剂施用于受试者。压制病况 或疾病包括诱发了所述病况或疾病后但还未临床表现出来之前将本发明的 试剂施用于受试者。抑制病况或疾病包括在疾病临床表现以后将本发明的试 剂施用于受试者。

f.变体

“变体”意指一种肽或多肽，其氨基酸序列因插入、缺失或氨基酸的保守 置换而不同，但仍保留着至少一种生物活性。“生物活性”的代表性实例包括 与末端结合蛋白、toll样受体(TLR)结合的能力，以及与特定抗体结合的能力。 变体也可以指一种蛋白质具有的氨基酸序列与保留着至少一种生物活性的 参考蛋白的氨基酸序列基本相同。氨基酸的保守取代，即氨基酸被具有相似 性质(例如亲水性、电荷区域程度和分布)的不同氨基酸替代在本领域中广为 所知，并通常被视为仅涉及细微变化。在本领域中可以理解的是，通过考虑 氨基酸亲水指数能部分地鉴别这些细微的变化。见，Kyte等，J.Mol.Biol. 157：105-132(1982)。氨基酸亲水指数基于对其疏水性和电荷的考虑。在本 领域已知具有相似亲水指数的氨基酸可以被取代并仍然保留蛋白质功能。在 一个方面，具有亲水指数±2的氨基酸可以被取代。氨基酸的亲水性也可用 于揭示将会使得蛋白质保留生物功能的取代。在肽范围内考虑氨基酸的亲水 性使之能允许计算所述肽的最大局部平均亲水性，已报道其为与抗原性和免 疫原性相关的有用指标。见美国专利4,554,101，其通过引用的方式完全并 入本文。具有相似亲水性值的氨基酸的取代能导致肽保留生物活性，例如免 疫原性，如本领域理解。可以用彼此所具有的亲水性数值±2的氨基酸进行 取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性数值均受氨基酸具体侧链的影响。与观 察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代可以被理解为取决于氨基酸，尤 其是这些氨基酸的侧链的相对相似性，如疏水性、亲水性、电荷、大小和其 他属性所揭示的。

2.肽

本文提供的是肽，其包括氨基酸序列KFARLWTEIPTAIT(SEQ ID NO:1) 的氨基酸序列、KFARLWAEIPTAIT(SEQ ID NO:2)(本文中也称为IP₃R₃肽)、 FTEIPTI(SEQ ID NO:3)(本文中也称为末端结合抑制肽或“EBIN”)、本文表 3中所公开的肽、它们的片段或者它们的变体。所述变体可包括保守取代。 所述肽可包括EB结合共有基序(如IP₃R₃的EB结合共有序列)或其片段。 IP₃R₃的EB结合保守序列可以是Ser/Thr-x-ILE-PRO。所述肽可由 KFARLWTEIPTAIT的(SEQ ID NO:1)、KFARLWAEIPTAIT(SEQ ID NO:2)、 FTEIPTI(SEQ ID NO:3)、包含Ser/Thr-x-Ile-Pro的共有序列、本文表3中公 开的肽、上述序列的片段或上述序列的保守变体构成。变体可包括含有 Ser/Thr-x-Ile-Pro序列、最小EB结合共有基序序列的任何肽序列。

所述肽可被偶联、肉豆蔻酰化或链接到其他肽(如载体肽)。所述肽可以 是触足肽。

3.治疗方法

本文提供了一种治疗肺损伤的方法。所述肺损伤可以是肺部炎症，其可 以是炎症介导的血管泄漏和/或水肿发展。所述肺损伤可以是急性肺损伤。 所述肺损伤也可以是慢性血管渗漏，诸如在哮喘患者中观察到的那样。所述 治疗可以减轻慢性血管渗漏。肺损伤可以是肺部血管通透性过高，包括全身 性血管通透性，如内毒血症。肺损伤可以与败血症、炎症、严重多发伤、吸 入唾液/胃内容物、吸入性肺炎、休克、溺水、多次输血、吸入刺激性或有 毒烟雾、动脉粥样化形成、机械损伤(通气诱导损伤)或辐射暴露相关。本文 也提供了治疗哮喘和/或改善肺功能以及哮喘患者整体健康的方法。哮喘可 以是过敏性哮喘，它可以是慢性或急性的。

本文还提供了一种治疗过敏性反应的方法，所述过敏性反应诸如过敏原 诱发的过敏性反应和非变应性过敏样反应，例如对显影染料的反应。本文还 提供的是治疗血管性水肿的方法，包括过敏原诱导的血管性水肿，如喉部水 肿，其可以随食物过敏或膜翅目昆虫螫咬而发生。血管性水肿也可以是非过 敏原诱导的血管性水肿，如补体因子1抑制剂缺乏或成像造影剂诱发的过敏 样反应。

本文提供了一种治疗全身性血管通透性综合征的方法。该综合征可因内 毒素血症、创伤或多次输血导致。该综合征也因药物治疗的副作用而导致。 药物治疗可以是全身使用IL-2来治疗癌症。本文还提供一种治疗鼻塞的方 法。鼻塞可能与过敏性或非过敏性鼻炎相关。鼻塞可以是刺激相关的或与呼 吸道病毒有关。

所述方法包括对所述哺乳动物施用包含治疗有效量的所述肽的组合物。 所述组合物可以是药物制剂。所述包含肽的组合物可与一种或多种可用于治 疗肺损伤的其他肽、化合物和/或药物组合物联合施用。所述一种或多种其 他肽、化合物和/或药物组合物可以是治疗的肺损伤的任何试剂，包括但不 限于预负荷减速剂(reducer)如硝酸甘油，以及利尿剂如呋塞米(速尿)。这种 药物扩张肺部和全身静脉，从而降低进入心脏和肺部的流体压力。其他一种 或多种化合物包括后填装的还原剂。这些药物扩张周围血管并减掉对左心室 的压力负荷。后负荷减速剂的一些例子包括硝普钠(Nitropress)、依那普利 (Vasotec)和卡托普利(开博通)，

a.受试对象

受试对象可以是哺乳动物，其可以是人类。在诊断前，受试对象可以由 于暴露于一种或多种危险因素、心脏问题等等而具有肺损伤风险。所述一种 或多种危险因素包括例如受试对象具有癌症家族史、年龄、吸烟、饮用含酒 精饮料和/或和/或饮食缺乏。受试对象可能暴露于有毒气体或辐射、机械供 氧。受试对象可以患有烧伤创面、炎症、严重多发伤、吸入唾液/胃内容物、 吸入性肺炎、败血症、休克、溺水、多次输血。

b.施用

利用本文所述的方法进行肽的施用可以是全身、口服、肠胃外、舌下、 穿透皮、经直肠、穿透粘膜、局部、经吸入、经口腔给药、经鼻进行施用， 或者它们的组合。肠胃外施用包括但不限于静脉内、动脉内、腹膜内、皮下、 肌内、鞘内和关节内施用。施用还可以是皮下、静脉内、经由内空气通道或 肿瘤内。至于兽医用途，可以根据常规兽医实践当作适当可接受的制剂施用 所述肽。兽医可以容易地确定最适合于特定动物的剂量方案和施用途径。所 述肽可以施用于人类患者、猫、狗、大型动物或禽类。

所述肽可以作为单一疗法施用或者同时地或有规律地与其他治疗一起 施用，其他治疗可以是肿瘤外科手术或切除。本文所使用的术语“同时的”或 “同时地”意指肽和其他治疗相互在48小时内施用，优选24小时，更优选12 小时，还更优选为6小时，最优选3小时或更少时间内。本文所用的术语“有 规律地”意指所述肽的施用时间与其它治疗不同，并且以一定频率相对重复 施用。

所述肽可以在另一治疗前的任何时间点进行施用，包括约120小时、118 小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、104 小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90小时、 88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、74小时、 72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、58小时、 56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、42小时、 40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、26小时、 24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、10小时、 8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50分钟、45 分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、10分钟、 26分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分钟和1分 钟。所述肽可在第二肽治疗之前的任何时间点进行施用，包括约120小时、 118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小时、 104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、90 小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、 74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、 58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、 42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、 26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、 10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50 分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、 10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分 钟和1分钟。

所述肽可以在另一治疗后的任一时间点进行施用，包括约1分钟、2分 钟、3分钟、4分钟、5分钟、6分钟、7分钟、8分钟、9分钟、10分钟、 15分钟、20分钟、25分钟、30分钟、35分钟、40分钟、45分钟、50分钟、 55分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12 小时、14小时、16小时、18小时、20小时、22小时、24小时、26小时、 28小时、30小时、32小时、34小时、36小时、38小时、40小时、42小时、 44小时、46小时、48小时、50小时、52小时、54小时、56小时、58小时、 60小时、62小时、64小时、66小时、68小时、70小时、72小时、74小时、 76小时、78小时、80小时、82小时、84小时、86小时、88小时、90小时、 92小时、94小时、96小时、98小时、100小时、102小时、104小时、106 小时、108小时、110小时、112小时、114小时、116小时、118小时和120 小时。所述肽可可在第二肽治疗之后的任何时间点进行施用，包括约120小 时、118小时、116小时、114小时、112小时、110小时、108小时、106小 时、104小时、102小时、100小时、98小时、96小时、94小时、92小时、 90小时、88小时、86小时、84小时、82小时、80小时、78小时、76小时、 74小时、72小时、70小时、68小时、66小时、64小时、62小时、60小时、 58小时、56小时、54小时、52小时、50小时、48小时、46小时、44小时、 42小时、40小时、38小时、36小时、34小时、32小时、30小时、28小时、 26小时、24小时、22小时、20小时、18小时、16小时、14小时、12小时、 10小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、55分钟、50 分钟、45分钟、40分钟、35分钟、30分钟、25分钟、20分钟、15分钟、 10分钟、9分钟、8分钟、7分钟、6分钟、5分钟、4分钟、3分钟、2分 钟和1分钟。

c.制剂

所述方法可包括施用所述肽。本文所提供的肽可以是以常规方式配制的 片剂或锭剂形式。例如，用于口服施用的片剂和胶囊剂可含有常规的赋形剂， 可以是粘合剂、填充剂、润滑剂、崩解剂和润湿剂。粘合剂包括但不限于糖 浆、阿拉伯胶、明胶、山梨醇、黄蓍胶、淀粉粘液和聚乙烯吡咯烷酮。填充 剂可以是乳糖、蔗糖、微晶纤维素、玉米淀粉、磷酸钙和山梨醇。润滑剂包 括但不限于硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉、聚乙二醇和二氧化硅。崩解剂可以 是马铃薯淀粉和淀粉乙醇酸钠。润湿剂可以是十二烷基硫酸钠。片剂可根据 本领域熟知的方法进行包衣。

本发明提供的肽也可以是液体制剂，诸如水溶液或油状悬浮液、溶液、 乳液、糖浆和酏剂。所述肽也可配制成干燥产品，在使用前用水货其他适宜 的载剂进行复建。这种液体制剂可以含有添加剂诸如助悬剂、乳化剂、非水 载剂和防腐剂。助悬剂可以是山梨糖醇糖浆、甲基纤维素、葡萄糖/蔗糖糖 浆、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶和氢化食用脂肪。 乳化剂可以是卵磷脂、脱水山梨醇单油酸酯和阿拉伯胶。非水性载剂可以是 食用油、杏仁油、分馏椰子油、油酯、丙二醇和乙醇。防腐剂可以是甲基或 丙基对-羟基苯甲酸酯和山梨酸。

本文提供的多肽也可以配制成栓剂，其可包含栓剂基质诸如可可脂或甘 油酯。本文提供的多肽也可以配制用于吸入，其可以为诸如溶液、悬浮液或 乳液的形式，可以使用推进剂如二氯二氟甲烷或三氯氟甲烷以干粉或气溶胶 形式进行施用。本文提供的肽也可配制成透皮制剂，包括水性或非水性的载 剂，如乳膏、软膏、洗剂、糊剂、含药硬膏剂、贴剂或膜剂。

本文提供的多肽也可以配制用于肠胃外施用，例如通过注射、瘤内注射 或连续输注。用于注射的制剂可以是悬浮液、溶液或在油性或水性载剂中的 乳液形式，并可含有调制剂，包括但不限于悬浮剂、稳定剂和分散剂。所述 肽也可以以粉末形式提供的用于采用合适的载剂进行复建，合适的载剂包括 但不限于无菌无热原水。

本文提供的多肽也可以配制成长效制剂，可以通过植入或通过肌内注射 施用。所述肽可用适宜的聚合或疏水材料(例如，可接受的油中形成乳液)、 离子交换树脂，或作为微溶的衍生物(例如微溶的盐)进行配制

d.剂量

所述方法可包括将治疗有效量的肽施用于有需要的患者。治疗中所需要 的治疗有效量随需要治疗的病况性质、激活TLR活性所需时间以及患者年 龄/状况而变化。然而，在一般情况下，用于成人治疗的剂量通常是在每天 0.001mg/kg至约200mg/kg范围内。剂量可以是每天约0.05mg/kg至约10 g/kg。所需剂量可便利地以单一剂量，或作为多剂量以适当的间隔施用，例 如为每天两个、三个、四个或更多个分剂量。多剂量可以是希望的或者要求 的。

所述剂量可以是任何剂量，例如约0.05mg/kg、0.06mg/kg、0.07mg/kg、 0.08mg/kg、0.09mg/kg、0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5 mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1mg/kg、25mg/kg、 50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、 225mg/kg、250mg/kg、275mg/kg、300mg/kg、325mg/kg、350mg/kg、375 mg/kg、400mg/kg、425mg/kg、450mg/kg、475mg/kg、500mg/kg、525mg/kg、 550mg/kg、575mg/kg、600mg/kg、625mg/kg、650mg/kg、675mg/kg、700 mg/kg、725mg/kg、750mg/kg、775mg/kg、800mg/kg、825mg/kg、850mg/kg、 875mg/kg、900mg/kg、925mg/kg、950mg/kg、975mg/kg、1g/kg，2g/kg、 3g/kg、4g/kg，5g/kg、6g/kg、7g/kg、8g/kg、9g/kg或10g/kg。

4.试剂盒

本文提供的试剂盒，其可用于治疗肺损伤。所述试剂盒可包含一种或多 种所述肽。这些肽可以是药物组合物的一部分。所述试剂盒还可包括施用该 试剂盒以及进行施用所述肽或制剂的说明书。

所述试剂盒还可包括一个或多个容器，如小瓶或瓶子，每个容器装不同 的试剂。所述试剂盒还可包括书面指南，描述如何执行或解读本文所描述的 方法。

本发明具有多个方面，通过以下非限制性实施例进行说明。

实施例

实施例1

EB3的缺失抑制从储备库释放Ca²⁺

以往的工作表明MT的细胞骨架在调节从ER储备库中IP3-门控释放 Ca²⁺的作用。测试了EB3调节位于PAR-1信号传导下游的从IP3-敏感储备库 中释放Ca²⁺的能力。测定了在响应于PAR-1激活而向EB1、EB3和荧光酶 表达shRNA的HMECs中的胞内Ca²⁺浓度变化(图1)。由于我们的基于载体 的siRNA构建体被克隆到GFP-C1载体中，所以我们能够比较来自于同一盖 玻片的非转染细胞和转染细胞。与对照非转染细胞或向荧光酶表达shRNA 的细胞相比，EB1的缺失对于从储备库从释放Ca²⁺没有任何影响。相比而言， EB3的缺失导致显著的Ca²⁺释放的抑制，从而导致减小的Ca²⁺内流。EB1 和EB3的同时缺失与EB3的单独缺失的效果相当(图1B)。这些数据表明， EB3对于ER的Ca²⁺耗竭是必须的。

实施例2

EB3互动中的Ca²⁺IP3门控释放机制作用与IP3R

确定了EB3是否与IP₃R3型相互作用，其活性对于EC中凝血酶诱导的 Ca²⁺释放至关重要。小鼠用亚致死量的LPS挑战并确定了EB3与IP₃R₃和 TRPC1(SOC)通道的关联。如如图2所示，EB3与IP₃R₃在静息内皮微血管 中相互作用，在LPS-诱发的肺部炎症中该相互作用的水平提高。有趣的是， 在发生炎症的肺中(LPS刺激3小时)，也在EB3沉淀中发现TRPC1。并没有 在TLR4(LPS受体)KO小鼠中发现这些变化，从而表明这些相互作用和炎症 的因果关系。

有趣的是，IP₃R₃含有EB结合共有基序，Ser/Thr-x-Ile-Pro(SxIP)。基于 IP₃R₃序列(KFARLWTEIPTAIT-SEQ ID NO:1)的短肽(图3)显示出结合EB3 的高结合活性，结合自由能为-68.882kcal/mole(图4)。用10nM的附着于细 胞透膜触角足肽(AP)的C-端的IP₃R₃序列预处理细胞能显著地降低响应于凝 血酶而从储备库中释放Ca²⁺(图5A)，这表明IP₃R₃和EB3之间的相互作用 在IP₃R激活机制中是至关重要的。IP₃R肽和紫杉醇调节Ca²⁺释放的作用进 行了比较。人们发现，预处理细胞与在凝血酶刺激用5μg/ml的紫杉醇预处 理20分钟的细胞抑制了从ER释放Ca²⁺的程度与IP₃R₃肽相同(图5B)。

实施例3

IP₃R₃肽防止发炎诱发的肺血管渗漏和败血症致死

为了阐述EB3/IP3R相互作用在调节血管内皮通透性中的作用，我们使 用了离体肺标本。在输注PAR-1激动剂肽之前，用该肽注入肺中30分钟， 且EB3和IP₃R₃之间的相互作用由IP检测来测定(图6)。与基础水平相比， PAR-1受体活化显著增加EB3/IP₃R₃相互作用，然而在活化肺微血管中，丰 富的IP₃R₃肽抑制这种相互作用。因此，根据微血管过滤系数，K_f,c的变化所 测定，IP₃R₃肽可减少肺血管通透性的增加。图7证实IP₃R₃肽显著地减弱了 响应于PAR-活化而造成的微血管通透性增加。这些数据表明EB3和IP3R 之间的相互作用对于肺部炎症诱发的血管渗透和水肿的发展可能是关键重 要的。

最近的研究证实，血管渗漏是造成败血症致死的关键因素。IP₃R₃肽的 药理作用在LPS诱发败血症小鼠模型中进行测试。用腹膜内注射(i.p.)LPS (30mg/kg体重)挑战雄性CD1小鼠，并测定肺部嗜中性粒细胞的浸润，其为 肺部炎症的指标。肺经PBS灌注、称重、冷冻，再用于测量肺髓过氧化物 酶(MPO)活性，其为激活中性粒细胞的标志。如图8所示，与对照组相比， 在LPS挑战之前30分钟用IP₃R₃肽处理的小鼠明显地减少了LPS挑战之后 2小时和6小时时的肺嗜中性粒细胞的浸润。这一观察表明，IP₃R₃肽减轻了 LPS诱导的肺部炎症和损伤。因此，在LPS施用前30分钟和1小时候，接 受IP₃R₃肽治疗的小鼠证实在LD50-和LD80挑战的对照组中显著提高的存 活率(图9)。此外，还确定了IP₃R₃肽是否可以防止盲肠结扎穿孔(CLP)诱发 的多种细菌败血症。CLP会造成致命的腹膜炎，且伴有急性肺损伤(ALI)。 在实验性啮齿动物中存在例外以及临床相关方法。图10显示了IP₃R₃肽改善 了CLP之后动物的存活。尽管90％的对照组小鼠在第一个48小时内死亡， 而术前24小时和术后48个小时注射IP₃R₃的动物证实显著更高的存活率。

这些数据表明，IP₃R₃肽衍生物肽可潜在地用于预防肺动脉通透性过高 以及缓解如炎症和动脉粥样化形成等病理过程中慢性血管渗漏。在LPS诱 发败血症小鼠模型中进一步测试了IP₃R₃肽的剂量响应。通过腹膜内注射 LD80剂量的LPS挑战雄性CD1小鼠。以每公斤体重0.01、0.033、0.1、0.33、 1.0、3.3和10μΜ的剂量对小鼠眼窝后静脉注射IP₃R₃肽。小鼠接受3次IP₃R₃肽注射，LPS给药前30分钟，给药后在1小时和24小时。每组中动物存活 百分比作为IP₃R₃剂量的函数进行绘图。图11显示IP₃R₃肽从0.033μΜ/kg 起改善对照组的存活率，并在1μΜ/kg时达到最大效力。增加IP₃R₃剂量并 不会导致进一步的改善，但重要的是也不会引起动物死亡。这些数据表明， IP₃R₃肽在该剂量范围内具有低毒性。使用3-参数对数等式计算ED₅₀(有效 剂量，50％)为80nM/kg：

y＝最小值＋(最大值+最小值)/1＋10^LogED50-×

其中min和max是最小和最大响应值。所呈现的数据表明，IP₃R₃是具有高 效力和低毒性的潜在药物。与紫杉醇不同的是，该药物预计不会表现出一般 毒性。

EB3正调控从ER储备库中释放Ca²⁺，从而增加响应于促炎症刺激的内 皮细胞屏障通透性。EB3和IP3R之间的相互作用对于IP3门控释放Ca²⁺的 机制是关键重要的。IP₃R₃肽阻止肺部炎症介导的血管渗漏和水肿的发展， 并且和显着提高两种不同的败血症模型中小鼠的存活。

实施例4

确定在内皮细胞通透性提高和肺水肿形成机制中Ca²⁺信号传递的EB3调节 作用

我们假定位于MT末端的EB3与ER的动态相互作用对于在响应于促炎 介导子的Ca²⁺波传递和提高内皮细胞屏障通透性是必须的。

假设：从ER中IP3-门控释放Ca²⁺的EB3调节对于内皮细胞通透性的 MT依赖性增加是必须的。我们将阐释以下观点，即在生长中的MT末端的 EB3聚集有利于EB3与IP3R的瞬时相互作用，并正调节从储备库中释放 Ca²⁺，从而导致SOC依赖性Ca²⁺内流，Ca²⁺-依赖性PKCα亚型的激活，PKCα 介导的p120-连环蛋白磷酸化和VE-钙连蛋白的内化(如图21中的模型进行 假设)。

实施例5

EB3在调控持续MT生长和IP3R激活中的作用

MT-失稳剂和稳定剂抑制IP3诱导的Ca²⁺释放11-13。我们的初步数据显 示出在血管内皮细胞中缺失EB3但不缺失EB1也抑制PAR-1介导的从储备 库中释放Ca²⁺。我们将确定EB3是否间接地通过MT动力学的调节从ER中 IP3诱导释放Ca²⁺。我们将确定如us20所示的通过表达人工EB2二聚体从 而在EB3缺失细胞中恢复MT持续生长，是不是也能恢复从ER中PAR-1 介导释放Ca²⁺。由于人工二聚体EB3-NL-LZ是完全没有任何负责结合已知 EB伴侣的结构域，如果EB3和IP3R之间的相互作用对于IP3R的激活是至 关重要的，那么并不能预期可以恢复IP3诱导的Ca²⁺释放。因此，如果我们 观察到表达人工EB3二聚体的细胞中IP3R活性的恢复，我们将得出结论， 通过MT动力学，EB3间接地调节激动剂诱导的从ER中释放Ca²⁺。这个实 验将阐述由HMLVECs的Fura2-AM的340/380比例成像所评估的从ER中 凝血酶介导释放Ca²⁺，以及细胞外Ca²⁺内流。根据我们的假设的有效性，我 们预测EB3-NL-LZ的表达不会恢复从ER中激动剂诱发释放Ca²⁺。

实施例6

EB3与IP3R相互作用在IP3R胞内分布中的作用

在我们的数据的前提下，我们提出EB3和IP3R3型之间的相互作用可 能在受体激活的机制是非常重要的。IP3R包含Ser/Thr-x-Ile-Pro(SxIP)共有 基序(图17)，这是EB-相互作用伴侣的特定标志。在该基序附近Ser或Thr 的磷酸化显著减低了EB1与其已知伴侣的亲和力。我们将测定与AP序列融 合的短IP3R序列肽(798-811；KFARLWTEIPTAIT-SEQ ID NO:1)是否扰乱 IP3R和EB3之间的相互作用，以及它是否能抑制凝血酶诱导的IP3-门控Ca²⁺释放。因为存在一些可能，肽可在细胞中被磷酸化，我们将表达Avi标记的 IP3R肽，并用放射自显影确定其磷酸化。如果我们发现肽被磷酸化，我们 将使用磷酸化缺陷肽，其中第一个Thr将被替换为Ala(磷酸化缺陷肽； KFARLWAEIPTAIT-SEQ ID NO:2)，对于所有其他研究而言更有效。所述肽 与EB3的结合将通过co-IP和下拉测验(pull-down assay)在细胞内和体外得到 证实。我们将使用这种肽破坏细胞中EB3和IP3R之间的相互作用。我们期 望IP3R肽会抑制响应于凝血酶从储备库中释放Ca²⁺。

我们将研究EB3缺失或者用阻断肽抑制EB3和IP3R之间的相互作用是 否改变IP3R的细胞内分布。在肺内皮微脉管系统中主要表达IP3R2型和3 型。对于激动剂诱导的从储备库中释放Ca²⁺需要将IP3R3型募集到细胞膜 穴样内陷(caveolae)中。考虑到相对较低的IP3对IP3R3型的固有亲和力， 该受体在IP3产生位点附近区域定位是IP3-门控释放Ca²⁺的关键。因此，我 们将测试EB3是否调控ER膜通过IP3R3/TRPC1/TRPC4复合体系连于细胞 膜穴样内陷。我们将通过免疫荧光染色和活细胞成像测定在凝血酶刺激过程 中，IP3R3受体的细胞内分布。如果我们发现EB3通过将IP3R3的束缚于细 胞膜穴样内陷而调控Ca²⁺的IP3门控释放，我们将确定EB3是否有利于 IP3R3和TRPC1/TRPC4之间的相互作用。

实施例7

EB3在激动剂诱导IP3R磷酸化机制中的作用

IP3R包含16个CaM激酶II(CaMKII的)26-28的潜在位点，且CaMKII 介导的磷酸化增加受体对IP3的敏感性。Thr804，一个经预测的CaMKII磷 酸化位点(图17)位于651-1130区域，其对于IP3结合和通道开放之间的功能 耦合是至关重要的。因此，Thr804的磷酸化在IP3-诱导通道开放机制中起到 重要作用。EB3结合CaM并可能精心协调CaMKII的空间和时间激活以及 受体磷酸化。为了验证该观点，我们将测定EB3的缺失或者用特定肽干扰 EB3和IP3R之间的相互作用是否会抑制IP3RR磷酸化。IP3R磷酸化水平将 通过放射自显影进行评估。我们预计，EB3缺失和IP3R肽都将降低IP3R磷 酸化水平。将通过磷酸化蛋白质组学分析确定磷酸化位点。在用伴刀豆球蛋 白A小珠进行凝血酶处理之前和之后从HLMVECs中纯化内源性IP3R。通 过比较采用或者不采用CaMKII抑制剂得到的磷酸化谱图来确定CaMIKK位 点的特异性。我们将突变CaMKII位点并确定它们在IP3R3细胞内分布和 IP3-门控释放Ca²⁺中的意义。

另一系列实验中，将确定IP3R的CaMKII依赖性磷酸化是否与质膜上 所述受体与TRPCl/4的结合相耦合。磷酸化可能会从生长的MT尖端释放 IP3R并诱导其与TRPCl/4结合。在小肠上皮细胞、胰腺腺泡细胞和表面粘 液细胞的顶端区域观察到CaMKII和IP3R3的协同定位。因此，在内皮细胞 的腔表面也可能发生CaMKII和IP3R3的协同分布。我们将首先确认在静息 和凝血酶刺激HLMVECs中IP3R3与CaMKII的协同定位。我们也将通过 FRET分析确定受体和激酶之间的相互作用。CaMKII的活性将使用基于 FRET的生物传感器，Camui33(从Yasunori Hayashi，日本获得)进行评估。 EB3在CaMKII的空间活化中的作用也将用相同方法进行确定。

实施例8

与IP3R EB3相互作用的SOC诱发Ca²⁺内流的机制作用。

ER储备库耗竭对于SOC激活的机制和Ca²⁺内流34-36是重要的。一致 的是，我们发现EB3缺失而EB1不缺失将降低Ca²⁺内流。在我们的初步数 据的前提下，我们假设EB3的缺失将抑制凝血酶诱导激活TRPC1和TRPC4， 它们是内皮细胞主要的SOC通道。为了直接验证这种可能性，用EB3siRNA 或IP3R3肽处理的HLMVECs将被用于在全细胞膜片钳测定法中于-50mV 测量凝血酶诱导和La3+敏感的内向电流。我们也将评估电流-电压(I-V)的关 系(-100至+100mV)以证实激活通道的反转电位。这一结果将与用其中IP3R3 被siRNA耗尽或者被IP3R拮抗剂2-氨基乙氧基硼酸(2-APB)抑制的 HLMVECs获得的数据进行比较。互补实验将验证，与EB3缺失相比，用特 定的抗体或者用siRNA分别地或者同时地失活TRPC1和TRPC4是否会对 全细胞电导产生相类似的效果。在我们假设正确的基础上，我们预EB3的 缺失将抑制Ca²⁺通过TRPCl/4通道内流。这些实验中将伴随进行用Fura2 -AM比例影像测量细胞内Ca²⁺浓度的变化。

另一组实验中，将确定EB3缺失是否能抑制毒胡萝卜素(TG)-或IP3-诱 导的(细胞内输送my微注射)SOC激活和Ca²⁺的内流。TG抑制肌浆/内质网 Ca²⁺ATP酶并导致独立于IP3R激活的从ER中耗竭Ca²⁺。这两种方法都有 望在对照siRNA处理的细胞中诱导SOC的激活引起的Ca²⁺内流，然而EB3 缺失将仅仅在IP3-诱导的IP3R激活的情况下抑制Ca²⁺内流。这个实验将区 分EB3通过IP3R的激活间接还是直接地(如果EB3(或者MR动力学变化)对 SOC通道本身的激活有任何作用)参与调控SOC-引起的Ca²⁺内流。我们还将 评估的全细胞电导和电流-电压(IV)的关系，以证明这些实验中TRPCl/4通道 的活性。

实施例9

EB3与IP3R相互作用在增加内皮细胞通透性和形成水肿的机制中的作用。

我们将确定EB3和IP3R之间的相互作用导致的Ca²⁺信号传递的传播是 否增强了响应于PAR-1活化的通透性增加。在这方面，我们将讨论用IP3R 阻断肽处理的细胞和肺中渗透性屏障增加。我们将通过测量TER和跨内皮 变化白蛋白通量作为内皮屏障改变的功能性量度指标来评估内皮通透性增 加。将通过免疫染色，通过VE-钙连蛋白内化的定量分析(使用生物素测定 法)，通过VE-钙连蛋白和p120-连环蛋白的相互作用来测定AJ的完整性以 及细胞内间隙的形成。在我们假设有效的基础上，我们预计，在细胞内Ca²⁺浓度增加受到抑制将导致减少通透性响应，这反映在更少的细胞内间隙形成 和更稳定的VE-钙连蛋白结合。由于增加的细胞内Ca²⁺激活PKCα，其通过 磷酸化p120-连环蛋白介导AJ的解体，我们将确定PKCα激活的水平和PKCα 特异性位点Ser879上p120-连环蛋白磷酸化的水平。为确定在EP3缺失细胞 中或者用IP3R3肽预处理的细胞中，PAR-1介导的细胞收缩是否也受到抑制， 我们将分析RhoA蛋白和MLCK-L活化的水平。将使用IP3R3缺失细胞或 者从IP3R3-/-小鼠37中分离的或肺微血管内皮细胞作为比较。

为确定EB3和IP3R之间的相互作用是否加强了微血管通透性和肺水肿 的激动剂诱导增加。我们将使用离体肺模型。小鼠灌注肺标本将用于确定细 胞渗透IP3R肽是否抑制PAR-1-介导的肺血管通透性增加。通过在PAR1激 动剂肽输注后测量毛细血管滤过系数(K_f,c)和肺部经血管125I-白蛋白流来评 估内皮微血管通透性。我们也将使用IP3R3-/-小鼠(由Katsuhiko Mikoshiba， 日本获得)或其中IP3R3由siRNA耗尽的小鼠以验证用肽所获得的结果。如 果我们设想IP3R和EB3之间的相互作用对于调控激动剂诱导的肺微血管通 透性增加是至关重要的，那么我们预料IP3R肽和IP3R3-/-将产生类似的结 果，揭示了响应于PAR-1激活的微血管通透性增加的部分抑制。

这些研究的目的是确定EB3在调节从ER储备库中IP3-门控释放Ca²⁺中的作用。我们将确定EB3和IP3R之间的相互作用在IP3R磷酸化和ER易 位到质膜心尖的机制中的意义。基于我们的假设，我们预计EB3和IP3R之 间的相互作用提供了IP3R激活的一个控制点。在我们假设有效的基础上， 我们预测，破坏EB3与IP3R相互作用会抑制从ER储备库中释放Ca²⁺，并 将在细胞培养和肺中消除增加的通透性响应。我们将研究以下机理模型验证 EB3/IP3R相互作用调控Ca²⁺的IP3-门控释放，1)通过将IP3R3束缚于细胞 膜穴样内陷，IP3产生区域附近，和2)通过由CaMKII促进IP3R3磷酸化。 因此，细胞培养试验以及肺微血管研究将鉴定出通过何种机制EB3调控 IP3R3活性。对于在检验假设的基础上从这些研究中得到崭新结论我们并没 有预料会出现问题。所有提出的技术均已在我们的或者合作者的实验室中建 立，因此也都是可行的。

在静息细胞中，MT骨架在维护内皮屏障中起着重要作用，并提供了通 过促炎刺激介导从而加强内皮细胞通透性提高的机制。EB3，一种MT末端 结合蛋白，其通过促进持续的MT生长以调控MT动力学，并因此EB3抗 突变活性可能是控制MT细胞骨架重组以及诸如急性肺损伤(ALI)和成人呼 吸窘迫综合征(ARDS)等炎性疾病时内皮屏障功能丧失的主要机制。所提议 的研究将验证在提高的内皮细胞通透性和水肿形成机制中，EB3在调控响应 于PAR-1激活的从ER储备库中IP3-门控释放Ca²⁺中的作用。我们将确定在 Ca²⁺波的组织和传播机制中潜在重要的EB3和IP3R3相互作用，其介导了通 过PKCα-介导的AJ解体和RhoA/MLCK-L-驱动肌动球蛋白收缩而提高的内 皮通透性。

实施例10

IP₃R₃肽截断对与EB3结合的影响

计算机模拟计算建模用于估算KFARLWTEIPTAIT肽(SEQ ID NO:1) 中每个残基对于结合自由能的能量贡献。氨基酸序列KFARLWTEIPTAIT (SEQ ID NO:1)的截断变体被安放在EB3界面中并计算相互作用的自由能 (表1)。该数据表明，Thr-X-Ile-Pro具有最低的结合能，而侧翼氨基酸在稳 定EB3和肽之间的相互作用中起到关键作用。

表1环绕IP₃R₃肽的Thr-x-Ile-Pro基序的氨基酸残基揭 短后自由能计算变化值

肽序列 结合自由能(-kcal/mol)

KFARLWTEIPTAIT(IP₃R₃肽) -68.882 FARLWTEIPTAIT -68.809 RLWTEIPTAIT -46.571 LWTEIPTAIT -54.443 WTEIPTAIT -42.886 TEIPTAIT -37.16 TEIPTAI -39.337 TEIPTA -41.234 TEIPT -34.5 FARLWTEIPTAI -51.42 TEIP -45.071 RTEIPTI -49.74 FRTEIPTI -40.728 FRTEIPT -55.469 KFARTKIPTAIT -57.32 FARTKIPTAI -33.415 KFARTEIPTAIT -55.736

实施例11

基于结构设计末端结合抑制肽(EBIN)

根据计算机模拟计算丙氨酸扫描以及IPR肽对EB结合袋的完全柔性对 接而设计了末端结合抑制肽(表2和表3)。结合自由能(ΔG)用于确定每个残 基对于稳定肽和EB蛋白相互作用做出的贡献。

采用以下标准：

ΔG值≥1＝稳定化残基

ΔG值≥-1＝去稳定化残基

ΔG值<-1至0至<1＝中性残基

丙氨酸扫描揭示了稳定化残基(具有0.50Kj/mole或更大的正结合能，以 黑色显示)和去稳定化残基(具有-1的负结合能，以蓝色表示)。

表2.在用丙氨酸突变IP₃R₃：K₁F₂A₃R₄L₅W₆T₇E₈I₉P₁₀T₁₁A₁₂I₁₃T₁₄每个残基结合自由能计算变化值

氨基酸 ΔG K1 0.25

F2 0.52 R4 0.01 L5 -1.03 W6 -1.08 T11 0.91 I13 1.33 T14 0.40

表3.突变EBIN每个氨基酸残基为丙氨酸后结合自由能计算变化值

氨基酸 ΔG F1 1.64 T2 1.07 E3 0.02 I4 0.68 T11 0.98 I7 0.94

结果，具有14个氨基酸的IPR肽缩短到7个氨基酸的末端结合抑制肽 (EBIN；FTEIPTI(SEQ ID NO:3)。图12证实了EB3和EBIN之间的相互作 用。与IP₃R₃相类似(如图12中黄色小棒所示)，EBIN与位于EB酸性尾部 和卷曲螺旋域之间的疏水沟相结合。EBIN与EB3的计算结合能是-60.251kcal /mol，这与IPR和EB3之间的结合能相类似。位于EBIN的2位上的苏氨酸 在与EB3对接面的结合中起到关键作用，因为将该残基突变为丙氨酸将完 全丧失结合。因此，单一氨基酸突变T→A肽，FAEIPTI(SEQ ID NO:4)用 作丧失结合的对照

实施例12

EBIN抑制EB3/IP₃R₃相互作用并减弱响应于促炎介导子的细胞内钙流

为了确定EBIN在细胞中的抑制特性，用EBIN或对照肽以1μM浓度 进行预处理的人肺主动脉内皮细胞(HPAECs)单层用凝血酶挑战。用蛋白印 迹分析EB3和IP₃R₃受体之间的相互作用。如图13所示，EBIN处理减弱了 EB3和IP₃R₃之间的基准和凝血酶诱导相互作用。与EB3在调控IP₃R₃对IP3 的响应性中的起作用的想法一致，EBIN明显地抑制响应于凝血酶和组胺的 细胞内钙流。图14证实了在用1μM Myr-EBIN或对照肽(FAEIPTI)(SEQ ID  NO:4)进行预处理然后用50nM凝血酶或90μΜ组胺挑战的HPAECs中 340/380(结合的/游离的Fura-2M)比率的变化。EBIN减轻了在用促炎性细胞 因子对HPAEC单层刺激后细胞内钙[Ca²⁺]i瞬态的激动剂诱导增加，而对照 肽没有减轻。

为了测定EBIN对细胞形状变化和细胞旁渗透性的作用，测量了HPAEC 单层的反式-内皮电阻。图15表明EBIN，而不是失去结合的肽，抑制了 HPAEC单层响应于两种促炎介导子的细胞形状变化和细胞旁渗透性。这些 结果证实EEBIN的屏障保护性作用与该信号传递的抑制和内皮细胞的细胞 形状变化相关。

实施例13

EBIN抑制小鼠中NO的产生和组胺引起的血管扩张

产生NO的内皮细胞特异性酶，一氧化氮合成酶3(eNOS)的活性是由钙 信号调控的，具体而言，通过eNOS与钙调蛋白相互作用，并已知是炎症过 程中内皮屏障渗透性过高的原因。因为EBIN抑制钙信号，可以假定EBIN 的屏障保护作用部分地是由于对eNOS的抑制。因此，测量了EBIN对基准 的和激动剂诱导的NO产生的影响。使用与FAS1femtostat和装有电化学软 件的个人电脑(Gamry Instruments)相连接的卟啉NO电极测量NO生成。与 NO浓度成正比的电极电流经测量为时间的函数。有趣的是，EBIN对基准 NO产生没有作用，这表明它不抑制组成型eNOS活性。然而，EBIN显著地 减少激动剂诱导的NO产生(图16)。与这些结果一致的是，小鼠静脉注射 AP-EBIN显示对收缩血压没有影响，然而EBIN显著地抑制组氨酸诱导的血 管舒张(图17)。这些数据与细胞培养实验中获得的数据一致。这些结果表明， EBIN通过抑制响应于组胺的NO生成从而减弱血管舒张。

实施例14

EBIN防止LPS诱发的败血症致死和过敏反应后血管渗漏

确定了EBIN对LPS诱发的败血症死亡率的影响。在施用LD90剂量的 LPS之前30分钟和一小时后，小鼠接受了AP-EBIN或AP对照肽的眼窝后 静脉注射。用EBIN处理的小鼠显示出相比对照组明显提高的存活率(图18)。 此外，还确定了EBIN后处理是否也显示出任何保护作用。在该实验中，于 LPS挑战后30分钟和24小时，尾部静脉注射Myr-EBIN。如图19显示，EBIN 后处理导致的存活率改善与对照组(失去结合的肽)相比不明显。与之前使用 Ap-EBIN的结果相一致，用Myr-EBIN预处理显示存活率显著提高(p<0.05)， 存活率(图19)。可以得出结论，在全身性炎症之前施用EBIN具有更有利的 呃效果。

气道微血管通透性过高作为血浆VEGF升高的结果，是导致患有典型哮 喘及其咳嗽变异的患者张红哦那个异常气道功能的关键因素之一。因为急性 过敏哮喘反应主要都是由于IgE介导的超敏反应，我们还确定了EBIN是否 能保护免受IgE介导过敏性反应后的皮下血管渗漏。图20表明，EBIN的静 脉注射显著地缓解耳部(高位血管，A)和背部(低位血管，B)的皮下血管渗漏 (伊文思蓝阳性区域的面积和强度)，而对照丧失结合的肽却没有。这些数据 表明EBIN能有效地用于改善患有慢性或急性形式的过敏性哮喘的肺功能和 整体健康，并减少了哮喘炎症反应。