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法律状态
2016-12-21
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):G01N30/08 授权公告日:20141022 终止日期:20151105 申请日:20131105
专利权的终止
2014-10-22
授权
授权
2014-03-12
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/08 申请日:20131105
实质审查的生效
2014-02-12
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种药物微量杂质成分的HPLC的检测方法,特别是涉及右旋糖酐40氯化钠 注射液中2-糠醛的测定方法。
背景技术
右旋糖酐系蔗糖经肠膜状明串珠菌L.M-1226号菌(Leuconostoc mesenteroides)发酵 后生成的高分子葡萄糖聚合物,经处理精制而得,其分子式为(C6H10O5)n。右旋糖酐按 照分子量不同分为高分子(10~20万)、中分子量(6万~8万)、低分子量(2~4万) 和小分子量(1~2万)右旋糖酐。右旋糖酐40的重均分子量(Mw)为32000~42000, 属于低分子右旋糖酐。国内于1952年研制成功,1957年开始应用于临床。右旋糖酐40主 要用于增加血浆容量,维持血压,以抗休克为主。广泛应用于各种休克、血栓性疾病、肢体 再植和血管外科手术等。右旋糖酐能提高血浆胶体渗透压,吸收血管外的水分而补充血容量, 维持血压;使已经聚集的红细胞和血小板解聚,降低血液黏滞性,从而改善微循环,防止休 克后期的血管内凝血;抑制凝血因子Ⅱ的激活,使凝血因子Ⅰ和Ⅷ活性降低以及其抗血小板 作用均可阻止血栓形成。此外,还具渗透性利尿作用(黄勋,陈槐卿,王玲等.右旋糖酐40,70对 红细胞与内皮细胞粘附的影响[J].生物医学工程学杂志,1998,15(3):240~242.)。
可能是由于蔗糖经肠膜状明串珠菌L.-M-1226号菌发酵后生成的右旋糖酐分子量较大, 大分子右旋糖酐作为血浆代用品安全性较差,须用稀酸水解以获得较低分子量的药用右旋糖 酐,但是水解的同时,也会使部分右旋糖酐分解成低聚糖,经异麦芽三糖、异麦芽二糖,生 成葡萄糖(李艳,陈学武,牟德华.右旋糖酐的生产及应用.山西食品工业[J],1998.3:36-37.)。 己糖(葡萄糖、果糖等单糖)与氨基酸在高温、酸性条件或微生物的作用下脱水发生美拉德 (Maillard)反应生成5-羟甲基糠醛及糠醛(杨朝霞,李梅,董建军等.高效液相色谱同时测 定啤酒中的5-羟甲基糠醛和糠醛[J].酿酒科技,2006,9:88-89.)。《中国药典》2010年版二部中只 采用紫外法对右旋糖酐40葡萄糖注射液中的5-羟甲基糠醛(以下简称5-HMT)进行了限度 检查,而对右旋糖酐40氯化钠注射液未做控制。“HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中 5-羟甲基糠醛的限量”,建立了用HPLC法测定右旋糖酐40氯化钠注射液中5-HMT含量的方 法,其结果在各批右旋糖酐40氯化钠注射液中均检测出了5-HMT,因此有必要对其进行质 量控制。但是在现有的文献中均没有报导右旋糖酐40氯化钠注射液或葡萄糖注射液中有过检 测出糠醛的报导。
糠醛为有机化合物,是呋喃2位上的氢原子被醛基取代的衍生物,分子式C5H4O2,又称 2-呋喃甲醛。糠醛属中等毒性类物质,其蒸气具有强烈的刺激性,并有麻醉作用。动物 吸入、摄入或经皮肤吸收均可引起急性中毒,表现有呼吸道刺激、肺水肿、肝损害、中 枢神经系统损害、呼吸中枢麻痹,以致死亡。其急性毒性:LD50为65mg/kg(大鼠经口), 最小致死剂量500mg/kg(人经口),亚急性和慢性毒性:人吸入7.4~52.7mg/m3×3个月, 发生粘膜刺激、结膜炎、流泪、头痛。此外糠醛是染色体断裂剂,具有诱发碱基对置换的 突变作用,具有诱发精子畸形和精母细胞姊妹染色单体交换的遗传毒性作用,具有诱发脑室 扩张的致畸作用等较大的潜在遗传及生殖毒性(牛凤云,王金山,王建刚,魏艳萍.糠醛对大鼠 致畸效应的研究,1992,6(4):290;陈卫平,王金山,宋霖.糠醛诱发小鼠精子畸形的实验研究.卫生 毒理学杂志,1994,8(2):129)。因此,美国政府工业卫生专家学会(ACGIH)在1981年即通过了 2ppm的阈限值(TLV-TWA)的规定。
从现有文献报导来看,对于右旋糖酐40氯化钠注射液或葡萄糖注射液中糠醛的存在是有 可能的,即使其含量非常的低,为保证用药安全,对于糠醛检测及限量是必须的。
按照“HPLC法检查右旋糖酐40氯化钠注射液中5-羟甲基糠醛的限量”建立的HPLC法测 定右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛,由于2-糠醛与5-羟甲基糠醛的结构有差异,而且2- 糠醛的含量很低,上述检测方法要同时检测出两种杂质难度较大。前期研究结果表明,采用 液相色谱进行测定时,液相色谱对糠醛的最低检出限为0.003μg/mL,即注射液中2-糠醛可检 出的最低浓度为0.003μg/mL,糠醛在其氯化钠注射液中含量较低,约为0.008~0.17μg/mL, 最低含量接近于最低检出浓度,不便于准确检测。此外,由于该样品中右旋糖酐40的浓度较 高,采用文献中流动相等度洗脱方式进行洗脱,将会使右旋糖酐40残留在色谱柱柱头,影响 色谱柱的寿命。因此采用检测5-羟甲基糠醛的条件及方法,还不能检测出右旋糖酐40氯化 钠注射液中2-糠醛的存在。
发明内容
针对上述领域中的不足,本发明提供一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方 法,通过优化的液相检测条件,检测出右旋糖酐40氯化钠注射液中确有2-糠醛存在,该HPLC 检测方法重复性好,且采用梯度洗脱方法,右旋糖酐40的残留少,对色谱柱的使用寿命影响 较小。
一种右旋糖酐40氯化钠注射液中2-糠醛的测定方法,包括固相萃取及液相检测两个步 骤,其特征在于:所述固相萃取为采用经活化后的固相萃取小柱,量取右旋糖酐40氯化钠注 射液上柱,用水洗涤,去除右旋糖酐及氯化钠,再加甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液,真空离心 挥干,用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)(50:50)溶解,0.45μm 微孔滤膜滤过,作为液相检测的供试品溶液;所述液相检测中的洗脱程序采用梯度洗脱,所 述流动相A:甲醇,流动相B:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0),0~3.00min 采用100%的水相,迅速去除样品中残留的右旋糖酐;3.10~18.00min采用A-B体积比为30:70 的混合流动相,18.10~21.00min采用A-B体积比为50:50的混合流动相,21.10~28.00min采 用100%的水相平衡色谱柱。
所述固相萃取小柱为Waters Oasis HLB固相萃取小柱。
所述固相萃取中,用水洗涤至少三次。
所述液相检测中的色谱柱为MACHEREY-NAGEL C18(250×4.6mm,5μm),检测波长: 275nm。
所述洗脱过程中,柱温为40℃,流动相流速:1.0mL/min。
由于右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛浓度太低,不便于检测,因此本发明在进行液相检 测前,进行了预处理,使用固相萃取法将注射液中氯化钠和右旋糖酐去除,同时将糠醛富集 吸附,提高其检测浓度。右旋糖酐40氯化钠注射液中右旋糖酐浓度为6%,氯化钠浓度为0.9%, 使用固相萃取小柱萃取过程中,需用水洗脱3次,每次3mL,用以去除右旋糖酐及氯化钠, 然后用甲醇洗脱糠醛,收集甲醇洗脱液,挥干甲醇,加流动相甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓 冲液(用磷酸调节pH为3.0)(50:50)溶解,用于液相分析。由于右旋糖酐40易于在色谱柱 的柱头残留,从而影响色谱柱的使用寿命,本发明采用了梯度洗脱的方式,0~3.00min采用 100%的水相,柱温40℃,迅速去除样品中残留的右旋糖酐;3.10~18.00min采用甲醇-0.05mol/L 磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)(30:70)对样品中的糠醛进行分析测定; 18.10~21.00min采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)(50:50),增 加流动相中有机相的比例,洗脱样品中的极性较弱的杂质;21.10~28.00min采用100%的水相 平衡色谱柱。
本发明方法在采用液相分析前对样品溶液进行了预处理,采用Waters Oasis HLB固相萃 取小柱对糠醛进行富集吸附,并将右旋糖酐40去除,收集到液相样品溶液;同时液相检测中 采用梯度洗脱的方式,去除残留,延长了色谱柱的使用寿命。采用本发明的方法,能同时检 测出右旋糖酐40注射液中的5-羟甲基糠醛和2-糠醛,对于该注射剂安全性评价有重要依据。 本发明方法灵敏度高,注射液中2-糠醛的最低检出量为0.00015μg/mL,特别适用于注射液中 2-糠醛含量较低样品的检测,测定结果更准确;重复性好,一批6份注射液测定结果,其含 量平均值为0.0889μg/mL,RSD为0.6%;精密度RSD为0.4%,加样回收率平均为93.1%, RSD为0.9%。
附图说明
图1空白色谱图,
图22-糠醛对照品色谱图,
其中峰1为2-糠醛,
图3右旋糖酐40氯化钠注射液色谱图,
其中峰1为5-羟甲基糠醛,峰2为2-糠醛
图4右旋糖酐40氯化钠注射液色谱图,
其中峰1为5-羟甲基糠醛,峰2为2-糠醛。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
1.仪器与试药
仪器:Waters Alliance HT系统;检测器:Waters2487紫外检测器。
固相萃取柱:Oasis HLB,60mg,3cc,使用时依次加入3mL水、3mL甲醇和3mL水活化。
试药:糠醛为分析纯,甲醇为色谱纯,水为高纯水。
2.方法与结果
2.1色谱条件:Waters Alliance HT系统;检测器:Waters2487紫外检测器;色谱柱: MACHEREY-NAGEL C18(250×4.6mm,5μm);洗脱程序采用梯度洗脱,流动相A:甲醇,流 动相B:0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0);梯度洗脱程序见表1。柱温: 40℃;流速:1.0mL/min;检测波长:275nm;进样量20μL。
表1注射液梯度洗脱程序
0~3.00min采用100%的水相,柱温40℃,迅速去除样品中残留的右旋糖酐;3.10~18.00min 采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)(30:70)对样品中的糠醛进 行分析测定;18.10~21.00min采用甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0) (50:50),增加流动相中有机相的比例,洗脱样品中的极性较弱的杂质;21.10~28.00min采用 100%的水相平衡色谱柱。
2.2对照品溶液的制备:精密称取糠醛对照品10.10mg,用甲醇稀释并定容于100mL量 瓶中,摇匀,浓度为101μg/mL,作为对照品储备液。分别精密量取对照品储备液适量,用流 动相甲醇-0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)(50:50)稀释制成质量浓度 分别为0.01,0.10,0.50,1.01,5.05,10.10μg/mL的系列对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备:取经活化的Waters Oasis HLB固相萃取小柱,精密量取右旋糖 酐40氯化钠注射液2mL上柱,抽干,用水洗涤3次,每次3mL,抽干,去除右旋糖酐及氯 化钠,加3mL甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液,真空离心挥干,用流动相甲醇-0.05mol/L磷酸二 氢钾缓冲液(用磷酸调节pH为3.0)(50:50)100μL溶解,0.45μm微孔滤膜滤过,作为供试 品溶液。
2.4线性实验:分别精密量取系列对照品溶液各20μL,注入液相色谱仪,采用Waters2487 紫外检测器,按2.1项下色谱条件分别测定,以峰面积Y对质量浓度X作线性回归,线性方 程为Y=193499.7X-4378.4(R=0.9999),线性范围:0.01~10.00μg/mL。
2.5系统适用性:取空白溶液、对照溶液(浓度为1.01μg/mL)、供试品溶液各20μL,注 入液相色谱仪,按2.1项下色谱条件测定,经Waters2487紫外检测器记录色谱图。结果显示, 空白溶液对糠醛测定无干扰,各色谱峰分离良好,且能同时测出右旋糖酐40注射液中的5- 羟甲基糠醛和2-糠醛。空白溶液、对照溶液、供试品溶液的色谱图见图1~3。
2.6最低检测限和最低定量限:根据色谱图的信噪比,仪器最低检测限(S/N=3)为 0.003μg/mL,最低定量限(S/N=10)为0.01μg/mL,即注射液中2-糠醛的最低检出量为 0.00015μg/mL。
2.7精密度实验:取线性实验项下质量浓度为1.01μg/mL对照品溶液,连续进样6次, 按2.1项下色谱条件测定,RSD为0.4%。
2.8重复性实验:取同一批注射液6份,采用2.3项下的操作过程制备样品,按2.1项下 色谱条件测定,其含量平均值为0.0889μg/mL,RSD为0.6%。
2.9加样回收率试验:精密称取糠醛对照品适量,用已知糠醛浓度的注射液稀释至糠醛 浓度为0.1μg/mL的溶液,按照2.3项下的操作过程,制备加样回收率样品,平行6份,精密 进样20μL。按2.1项下色谱条件进行分析,记录色谱图,根据对照品的标准线性方程,计算 回收率,得糠醛的平均回收率为93.1%,RSD为0.9%。
2.10供试品中糠醛的检测及结果
分别精密量取供试品溶液20μL,按2.1项下色谱条件进行分析。(色谱图见图4)。
右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛含量见表2。
表2右旋糖酐40氯化钠注射液中糠醛含量的测定结果
本发明采上述方法测定到多家医药公司生产的右旋糖酐40氯化钠注射液中均有糠醛存 在,且固相萃取与非固相萃取的含量检测有一定的差别,采用固相萃取后提高了检测的灵敏 度,注射液中2-糠醛的最低检出量由非固相萃取时的0.003μg/mL降低至0.00015μg/mL,特 别适用于注射液中2-糠醛含量较低样品的检测,测定结果更为准确。本发明方法灵敏度高, 重复性好,值得推广。
机译: 应用6-(2- u0442 u043e u043b u0438 u043b) u0442 u0440 u0438 u0430 u0437 u043e u043b u043e u043f u043f u0438 u0440 u0438 u043c u0438 u0434 u0438 u043d u043e u0432作为杀菌剂,新6-(2- u0442 u043e u043b u0438 u043b) u0442 u0440 u0438 u0430 u0437 u043e u043b u043e u043e u043f u0438 u0440 u0438 u043c u0438 u0434 u0438 u043d u044b,获得它们的方法及其在对抗病原性gr u0438 u0431 u0430 u043c u0438中的用途以及包含工具
机译: n-(4-(1)-氧基-1- u043c u0435 u0442 u043e u043a u0441 u0438 u043a u0430 u0440 u0431 u043e u043d u0438 u043b-2,2,2- u0442 u0440 u0438 u0444 u0442 u043e u0440 u044d u0442 u0438 u043b)- u0444 u0435 u043d u0438 u043b-n-甲基-n'- u0430 u043b u043a u0438 u043b u043c u043e u0447 u0435 u0432 u0438 u043d u044b与 u0430 u043d u0442 u0438 u0434 u043e u0442 u043d u043e u0439活动相对于 u0445 u043b u043e u0440 u0441 u0443 u043b u044c u0444 u0443 u0440 u043e u043d u0443在玉米和fa盐类作物中
机译: 2-(2'-戊烯-4'-yl)的导数 u0430 u043d u0438 u043b u0438 u043d u0430与 u0438 u043d u0433 u0438 u0431 u0438 u0440 u0443 u044e u0449矿物酸中 u0440 u0430 u0441 u0442 u0432 u043e u0440 u0435 u043d u0438 u0438中的 u0443 u044e活性及其获得方法