一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用

摘要

本发明公开了一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。实验证明，本发明所提供的WysR蛋白及其编码基因对于培育武夷菌素产量提高的菌株新品种具有重要的理论和实际意义。本发明在生物农药领域具有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基 因与应用。

背景技术

生物农药是农作物病虫害绿色防控和农产品安全的主要技术支撑。其中，抗生素 类杀菌剂是生物农药产业化发展最快的产品之一，具有高效、易分解、与环境相溶性 好等优点，被认为是减少或代替化学农药的主要技术，也是植物病虫害生物防治研究 的热点。

武夷菌素是由不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis） 产生的一种高效广谱低毒新型农用抗生素，是由中国农业科学院植物保护研究所研制 一种具有自主知识产权的生物农药，具有高效、广谱、低毒的特点，在生态农业和绿 色食品生产中得到了广泛的应用。2000年荣获得国家五部委颁发的“国家重点新产品” 认证。自2001年以来，连续多年被列入蔬菜病虫害安全防治技术规范（国家标准）， 指定用于防治茄果类、瓜类、绿叶类蔬菜白粉病、灰霉病、叶霉病等多种病害。2010 年武夷菌素产品获得国家有机产品认证（COFCC-R-0903-0070）。目前，武夷菌素已经 成为我国无公害蔬菜和有机蔬菜生产中防治真菌病害的高效生物农药。

武夷菌素的生产是利用培养不吸水链霉菌武夷变种，通过生物深层发酵产生的微 生物的次生代谢产物。工厂化发酵生产过程中所使用产生菌产素能力的高低以及培养 基配方的优劣是决定抗生素生产成本、防效的关键因素。因此，通过遗传育种技术选 育高产生产菌株、优化发酵培养基的营养成分以及营养成分的配比，对于降低武夷菌 素的生产成本、能耗，提高防治农作物病害的效果，加快我国自主研发的农用抗生素 产业化发展具有重要意义。

传统的农用抗生素菌株改良主要是通过自然选育及诱变育种来实现，由于突变的 随机性及突变的累积使得在获得高产的同时，菌株在生活能力和产孢量等方面会明显 减弱，使得传统育种受到了极大的限制。近年来，随着分子生物学的不断进步，可利 用基因工程育种方法进行定向育种，在一定范围内克服了传统育种技术的随机性和盲 目性，为创制高产、稳定的新菌株提供了有利的保障。将抗生素合成基因用于菌种的 改良，成为重要的育种手段。

研究武夷菌素的合成基因，对于基因工程育种提供了重要的理论基础，对于提高 我国农用抗生素新菌株的开发与创制水平，提高具有自主知识产权的新微生物农药产 业化程度具有重要的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种与武夷菌素生物合成相关的蛋白及其编码基因与应用。

本发明所提供的蛋白，名称为WysR，来源于不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces  ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15，具体可为如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且与武夷菌素生物合成相关的由序列1衍生的蛋白质。

上述（b）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（b）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。

其中，序列表中序列1由193个氨基酸残基组成。

编码所述WysR蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子 也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述WysR蛋白的基因（命名为 wysR基因）；所述wysR基因具体可为如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中序列7所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述WysR蛋白的DNA 分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述WysR 蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由582个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列，编码序列表中序 列1所示的WysR蛋白。序列7由632个核苷酸组成，其中第50-632位为序列2。

含有所述核酸分子的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。

在本发明的实施例中，所述重组表达载体中启动所述wysR基因转录的启动子具 体为P_SF14启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pSETC载体的多克隆位点（如BamH I和Spe  I）之间插入所述wysR基因后得到的重组质粒（命名为psf-wysR）。

所述表达盒由能够启动所述wysR基因表达的启动子，所述wysR基因，以及转录 终止序列组成。

在本发明的一个实施例中，所述重组菌具体为携带有所述wysR基因的重组链霉 菌；所述链霉菌具体为不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）CK-15。

所述WysR蛋白，或所述核酸分子，或所述重组表达载体、表达盒或重组菌在如 下a1）-a3）任一中的应用也属于本发明的保护范围：

a1）调控菌株中武夷菌素产量；

a2）选育武夷菌素产量提高的菌株；

a3）制备用于抑制武夷菌素敏感菌株的产品。

在本发明的一个实施例中，所述调控菌株中武夷菌素产量具体为提高菌株中武夷 菌素产量。

所述选育武夷菌素产量提高的菌株的方法，具体为选育所述WysR蛋白表达量提 高的菌株。

本发明的另一个目的是提供一种获得转基因菌株的方法。

本发明所提供的获得转基因菌株的方法，具体可包括如下b1）和b2）的步骤：

b1）将编码所述WysR蛋白的基因导入目的菌株中，得到转基因菌株；

b2）从步骤b1）所得的转基因菌株中得到与所述目的菌株相比，具有如下性状中 至少一种的转基因菌株：武夷菌素产量提高、对武夷菌素敏感菌株的抑制作用增强。

所述WysR蛋白在所述转基因菌株中的表达量高于所述目的菌株；编码所述WysR 蛋白的基因（即wysR基因）是所述基因是如下1）至4）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

2）序列表中序列7所示的DNA分子；

3）在严格条件下与1）或2）限定的DNA分子杂交且编码所述WysR蛋白的DNA 分子；

4）与1）或2）或3）限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述WysR 蛋白的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

所述wysR基因具体可通过以上所述重组表达载体导入所述目的菌株中，得到所 述转基因菌株。

在上述应用或方法中，所述菌株为能产生武夷菌素的菌株；进一步，所述能产生 武夷菌素的菌株具体可为不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）CK-15。

在本发明的一个实施例中，所述菌株具体为不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces  ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15。

在上述应用或方法中，所述武夷菌素敏感菌株具体可为深红酵母AS2.282 （Rhodotorula rubra）。

利于所述方法获得的转基因菌株也属于本发明的保护范围。

实验证明，本发明所提供的WysR蛋白及其编码基因对于培育武夷菌素高产新菌 株具有重要的理论和实际意义。本发明在生物农药领域具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为△wysR缺失突变株的PCR鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量标准 200bp DNA Ladder（购自天根）；泳道1为作为对照的出发菌株CK-15；泳道2和3分 别为△wysR缺失突变株△wysR271和△wysR293。

图2为wysR基因互补菌株的PCR验证结果。其中，泳道M为DNA分子量标准 1Kb Plus DNA Ladder（购自北京全式金生物技术有限公司）；泳道1为对照的菌株 CK-15；泳道2为作为对照的突变株△wysR271；泳道3和4分别为互补菌株com-R1 和com-R2。

图3为wysR转基因菌株的PCR验证结果。其中，泳道M为DNA分子量标准1Kb Plus DNA Ladder（购自北京全式金生物技术有限公司）；泳道1为对照的出发菌株 CK-15；泳道2为wysR转基因菌株ooR7；泳道3为wysR转基因菌株ooR12。

图4为武夷菌素标准品和各菌株发酵液的HPLC检测结果。其中，A为武夷菌素 标准品的HPLC图谱；B为出发菌株CK-15的HPLC图谱；C为wysR转基因菌株（ooR7） 的HPLC图谱；D为△wysR缺失突变株（△wysR271）的HPLC图谱；E为wysR基 因互补菌株（com-R1）的HPLC图谱。

图5为各菌株发酵液的抑菌活性鉴定结果。其中，A为wysR转基因菌株（ooR7） 的抑菌圈；B、E为原始菌株CK-15的抑菌圈；C、G为空载体CK-15/pSETC的抑菌 圈；D为△wysR缺失突变株（△wysR271）的抑菌圈；F为wysR基因互补菌株（com-R1） 的抑菌圈；H为△wysR缺失突变株（△wysR293）的抑菌圈。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15：记载 于“王万群，武夷菌素产生菌CK-15细菌人工染色体（BAC）文库构建，2008.6.1” 一文中。

E.coli ET12567/pUZ8002：记载于“Kieser TBM,Buttner MJ,Chater KF,Hopwood  DA(2000)Practical Streptomyces Genetics.The John Innes Foundation,Norwich”一文中。

pKC1139载体：记载于“Bierman M,Logan R,O’Brien K,Seno ET,Rao RN,Schoner  BE(1992)Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to  Streptomyces spp.Gene116:43–49”一文中。pKC1139为温度敏感型质粒，带有一个来 自s.ghanaensis的温度敏感型复制子，当培养温度超过34℃时该游离质粒在链霉菌中 不能自我复制。

pSET152载体：记载于“Bierman M,Logan R,O’Brien K,Seno ET,Rao RN,Schoner  BE(1992)Plasmid cloning vectors for the conjugal transfer of DNA from Escherichia coli to  Streptomyces spp.Gene116:43–49”一文中。

pSETC载体：记载于“Keqiang Fan,Guohui Pan,Xiaojing Peng,Jianting Zheng, Wubin Gao,Juan Wang,Weishan Wang,Yue Li,and Keqian Yang.(2012)Identification of  JadG as the B Ring Opening Oxygenase Catalyzing the Oxidative C-C Bond Cleavage  Reaction in Jadomycin Biosynthesis.Chemistry&Biology19,1381–1390”一文中。

pBBR1MCS-5载体：记载于“刘钰莹.脱氮关键酶基因的克隆、鉴定及高效脱氮 菌株的构建.中国农业科学院，2010年硕士论文”一文中。

pEASY-T1simple载体：全式金生物试剂公司。

深红酵母AS2.282（Rhodotorula rubra）：武夷菌素生物效价测定用指示菌，载于 “曾洪梅林德忻石义萍，农抗武夷菌素产生菌原生质体诱变育种.中国生物防治， 1996年01期，48-49.”一文中。

实施例1、与武夷菌素生物合成相关的wysR基因的获得

以不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15为 出发菌株，通过筛选CK-15基因组fosmid文库中的阳性单克隆，并进行测序，得到一 段约50kb的序列，利用生物信息学分析及开放阅读框的比对，得到一个GC含量非 常高，符合链霉菌基因特征的基因，将该基因命名为wysR。wysR基因的核苷酸序列 如序列表中序列2所示。

提取不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15 的基因组DNA，以其为模板，采用引物1和引物2进行PCR扩增。

引物1：5'-ATGGCCTCCCTCGAC-3'（序列2的第1-15位）；

引物2：5'-TCACTTGATGAAGTCGTCC-3'（序列2的第564-582位的反向互补序 列）。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示经PCR扩 增获得了长度约为580bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，进行测序。结果表明， 该片段的长度为582bp，核苷酸序列如序列表中序列2所示，整个序列2即为wysR基 因的编码区序列，编码序列表中序列1所示的蛋白质，将该蛋白命名为WysR。

实施例2、wysR基因缺失突变株的构建及鉴定

一、同源重组质粒pKC-WG的构建

将不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15的 基因组DNA中的wysR基因的上、下游片段分别扩增出来，得到两个同源臂，接着在 两个同源臂之间连入抗性标记基因庆大霉素基因（Gm），再将其插入到pKC1139载体 骨架中，得到用于构建wysR基因缺失突变株的同源重组质粒pKC-WG。具体操作如 下：

1、用于扩增两个同源臂的引物的设计

根据不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15 基因组DNA中wysR基因及其上下游序列（序列3）设计引物，用于扩增两个同源臂。

用于扩增上游同源臂（简称ArmA）的引物如下：

ArmA-F：5'-AAGCTTAGCACCGACGAACCTGG-3'（下划线部分为Hind III的识 别序列，其后为序列3的第1-17位）；

ArmA-R：5'-TCTAGAACTGCGGCGGAACTCCT-3'（下划线部分为Xba I的识别 序列，其后为序列3的第1030-1046位的反向互补序列）。

用于扩增下游同源臂（简称ArmB）的引物如下：

ArmB-F：5'-TCTAGAATGGGCATCCTCAACG-3'（下划线部分为Xba I的识别序 列，其后为序列3的第1509-1524位）；

ArmB-R：5'-GGATCCGCGAGATGCCGTTGG-3'（下划线部分为BamH I的识别序 列，其后为序列3的第2785-2799位的反向互补序列）。

2、PCR扩增获得两个同源臂

以不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15基 因组DNA为模板，采用引物对ArmA-F/ArmA-R进行PCR扩增，扩增产物大小约为 1046bp，测序后其核苷酸序列为序列表中序列3的第1-1046位。

以不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15基 因组DNA为模板，采用引物对ArmB-F/ArmB-R进行PCR扩增，扩增产物大小约为 1291bp，测序后其核苷酸序列为序列表中序列3的第1509-2799位。

3、重组质粒pEASY-W的构建

用HindⅢ和Xba I双酶切上游同源臂，回收酶切产物，与经过同样双酶切的 pEASY-T1simple载体骨架大片段相连，得到中间载体；用Xba I和BamH I双酶切下 游同源臂，回收酶切产物，与经过同样双酶切的中间载体骨架大片段相连，得到重组 质粒。将经测序表明在pEASY-T1simple载体的HindⅢ和BamH I之间插入“序列3 的第1-1046位+TCTAGA+序列3的第1509-2799位”的重组质粒命名为pEASY-W。

4、重组质粒pEASY-WG的构建

以pBBR1MCS-5载体为模板，采用引物Gm-F和Gm-R进行PCR扩增，获得抗 性基因庆大霉素基因（Gm）。其中，引物GM-F和GM-R的序列如下：

Gm-F：5'-TCTAGAGACGCACACCGTGGAAA-3'（下划线部分为Xba I的识别序 列，其后为序列4的第1-17位）；

Gm-R：5'-TCTAGAGCGGCGTTGTGACAATTT-3'（下划线部分为Xba I的识别序 列，其后为序列4的第838-855位的反向互补序列）；

将经过上述PCR扩增所得产物——抗性基因庆大霉素基因（Gm）进行序列测定， 其核苷酸序列为“TCTAGA+序列4+TCTAGA”。

将所得PCR产物用Xba I单酶切，回收酶切产物，与经过同样酶切的pEASY-T  1simple载体骨架大片段相连，得到重组质粒，将其命名为pEASY-TGM。

用Xba I单酶切重组质粒pEASY-TGM，与经过同样酶切的重组质粒pEASY-W的 骨架大片段相连，得到重组质粒pEASY-WG。

重组质粒pEASY-WG的结构描述为：在pEASY-T1simple载体的HindⅢ和BamH  I之间插入序列5后得到的重组质粒。

5、同源重组质粒pKC-WG的构建

用HindⅢ和BamH I双酶切重组质粒pEASY-WG，回收大小约为3200bp的目的 片段，将其与经过同样双酶切的pKC1139载体的骨架大片段相连，得到重组质粒。将 酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测序表明在pKC1139载体的酶切位点HindⅢ和 BamH I之间插入序列表中序列5所示DNA片段后的质粒命名为pKC-WG。

二、wysR基因缺失突变株的构建

将步骤一构建的同源重组质粒pKC-WG通过电击法转入E.coli ET12567/pUZ8002 中，得到的重组菌命名为ETpKC-WG。再通过接合转移的方法，将ETpKC-WG导入 不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15中，具体 操作参见“杨振娟,孙蕾,武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索 及初建.生物技术通报,2012,(10):193-198”一文，如下：取作为出发菌株的不吸水链 霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15的成熟孢子做成孢 子悬浮液，将重组菌ETpKC-WG做成感受态，与CK-15孢子悬浮液等体积混合后涂 MS平板，于30℃培养16小时后，覆盖含25μg/ml的萘啶酮酸（抑制大肠杆菌生长） 以及50μg/ml的安普霉素（pKC1139载体携带安普霉素抗性基因）和50μg/ml的庆大 霉素的1ml无菌水中，继续放37℃培养箱恒温培养至长出接合转移子。长出的菌落可 能为重组质粒pKC-WG整合到链霉菌CK-15染色体上的重组菌株，再挑取单菌落分 别在含有庆大霉素和安普霉素的MS平板上划线，选取在庆大霉素抗性平板上生长， 而在安普霉素抗性平板上不生长的菌株，得到wysR基因缺失突变株，将其命名为△ wysR缺失突变株。

三、wysR基因缺失突变株的鉴定

挑取步骤二构建的△wysR缺失突变株的单菌落，进行液体培养，提取菌株的基因 组DNA，以其为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，通过PCR产物大小及序列对 △wysR缺失突变株进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链霉菌武夷变种 （Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15作为对照。

上游引物：5'-TCAAGGAAACCTCAAGCG-3'（序列5的第589-606位，序列3的 第589-606位）；

下游引物：5'-GCGTAACACGGGAATGG-3'（序列5的第2108-2124位的反向互补 序列，序列3的第1703-1719位的反向互补序列）。

理论上，在△wysR缺失突变株中，由于庆大基因Gm（855bp）代替了原来目的 基因wysR（582bp），而且重组质粒左右臂中各包含了wysR基因上游和下游60bp的碱 基序列，同时在庆大基因Gm（855bp）的上下游各加入了一个Xba I的识别序列（6bp）， 发生同源重组双交换的突变株比出发菌株序列长405bp（855-582+60+60+6+6=405）。 采用以上引物对进行PCR扩增的片段大小应为1536bp（序列5的第589-2124位）；而 作为对照的出发菌株CK-15的PCR产物大小应为1131bp（序列3的第589-1719位）。

将△wysR缺失突变株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果 如图1所示。从图中可以看出，△wysR缺失突变株的PCR产物大小约为1536bp，而 出发菌株CK-15的PCR产物大小约为1131bp，与预期结果一致。进一步，将△wysR 缺失突变株的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列5的第589-2124位；将出 发菌株CK-15的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列3的第589-1719位。可 见，步骤二所得到的△wysR缺失突变株为阳性，从中选取两株鉴定阳性的菌株分别命 名为△wysR271和△wysR293。

实施例3、wysR基因互补菌株的构建及鉴定

为了证明缺失突变株丧失产生武夷菌素的能力是由wysR基因的缺失引起的，而 不是极性效应导致的其他基因的失活，本发明的发明人将带有启动子区域的wysR基 因重新导入实施例2制备的△wysR缺失突变株，观察对产生武夷菌素的影响。将wysR 基因克隆至整合性穿梭质粒载体pSET152上，构建重组质粒p-wysR。通过接合转移 实验，导入实施例2制备的△wysR缺失突变株，并利用PCR验证回复株中包含完整 的wysR基因。具体如下：

一、重组质粒p-wysR的构建

根据不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15 基因组DNA中wysR基因及其上游包含其自身启动子的序列（序列8）设计引物com-F 和com-R，用于扩增完整的wysR基因。

com-F：5'-TCTAGA CGGAAGCGGCGGTAGT-3'（下划线部分为Xba I的识别序列， 其后为序列8的第1-16位）；

com-R：5'-GGATCC CGGTCGGCGTCACTT-3'（下划线部分为BamH I的识别序列， 其后为序列8的第959-973位的反向互补序列）。

PCR扩增得到完整的wysR基因序列，将所得PCR产物用Xba I和BamH I双酶切， 回收酶切产物，与经过同样酶切的pSET152载体相连，得到重组质粒，将其命名为 p-wysR。将酶切鉴定正确的质粒送样测序。测序结果表明与序列8吻合。

重组质粒p-wysR的结构描述为：在pSET152载体的Xba I和BamH I之间插入序 列8后得到的重组质粒。

二、wysR基因互补菌株的构建

将上述步骤一构建的重组质粒p-wysR通过电击法转入E.coli ET12567/pUZ8002 中，得到的重组菌命名为ETp-wysR。再通过接合转移的方法，将ETp-wysR导入实施 例2制备的△wysR缺失突变株△wysR271中，具体操作参见“杨振娟,孙蕾,武哲等. 不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传转化体系的探索及初建.生物技术通报,2012, (10):193-198”一文，如下：取实施例2制备的△wysR缺失突变株△wysR271的成熟 孢子做成孢子悬浮液，将重组菌ETp-wysR做成感受态，与△wysR271孢子悬浮液等 体积混合后涂MS平板，于30℃培养16小时后，覆盖含25μg/ml的萘啶酮酸（抑制大 肠杆菌生长）以及50μg/ml的安普霉素（pSET152载体携带安普霉素抗性基因）1ml 无菌水中，继续放30℃培养箱恒温培养至长出接合转移子。挑取单菌落，获得wysR 基因互补菌株，从中选取两株分别命名为com-R1和com-R2。

三、wysR基因互补菌株的鉴定

挑取步骤二构建的wysR基因互补菌株com-R1和com-R2的单菌落，进行液体培 养，提取菌株的基因组DNA，以其为模板，采用如下引物对进行PCR扩增，通过PCR 产物大小及序列对wysR基因互补菌株进行分子鉴定。由于pSET152载体携带安普霉 素抗性基因，若扩增出安普霉素抗性基因，则说明获得的菌株确为wysR基因互补菌 株。同时以不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15 和实施例2制备的△wysR缺失突变株△wysR271作为对照。

引物3：5'-GTGCAATACGAATGGCGAA-3'（序列6的第1-19位）；

引物4：5'-GCATTCTTCGCATCCCGCCT-3'（序列6的第731-750位的反向互补 序列）。

理论上，在wysR基因互补菌株中，由于重组表达载体p-wysR中有安普霉素抗性 基因，以其基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，会得到与安普霉素 抗性基因序列大小吻合的扩增片段（750bp，序列6的第1-750位）；而作为对照的不 吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15和实施例2 制备的△wysR缺失突变株△wysR271由于不含有安普霉素抗性基因，因而采用以上 引物对进行PCR扩增，不会得到目的条带。

通过验证，将得到的wysR基因互补菌株和实施例2制备的△wysR缺失突变株△ wysR271的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图2所示。从图中可以看出，泳 道3和4为互补菌株com-R1和com-R2的PCR产物大小约为750bp，而菌株CK-15 （泳道1）和突变株△wysR271（泳道2）无扩增条带，与预期结果一致。进一步，将 互补菌株的PCR产物送样测序，其核苷酸序列正为序列6的第1-750位。可见，得到 的互补菌株com-R1和com-R2为阳性。

实施例4、wysR转基因菌株的构建及鉴定

一、重组表达载体psf-wysR的构建

提取不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15 的基因组DNA，以其为模板，采用引物wysR-F和wysR-R进行PCR扩增，获得包含 wysR基因的核糖体结合位点（RBS）的区域序列。

wysR-F：5'-GGATCC TGATATCCGCGCAGACCGCTCC-3'（下划线部分为BamH I 的识别序列，其后的序列为序列7的第1-22位）；

wysR-R：5'-ACTAGT TCACTTGATGAAGTCGTCC-3'（下划线部分为Spe I的识 别序列，其后的序列为序列7的第614-632位的反向互补序列）。

反应结束后，对PCR扩增产物进行纯化，用限制性内切酶BamH I和Spe I对纯化 产物进行双酶切，回收目的片段，与经过同样双酶切的pSETC载体骨架大片段相连， 得到重组质粒。将酶切鉴定正确的重组质粒送样测序。将经测序表明在pSETC载体的 酶切位点BamH I和Spe I之间插入序列表中序列7所示DNA片段后的质粒命名为 psf-wysR。

在重组表达载体psf-wysR中，启动序列2所示的wysR基因转录的启动子为P_SF14启动子。

二、wysR转基因菌株的构建

将步骤一构建的重组表达载体psf-wysR通过电击法转入E.coli  ET12567/pUZ8002，得到的重组菌命名为ETpKC-wysR。再通过接合转移的方法，将 ETpKC-wysR导入不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis） CK-15中，具体操作参见“杨振娟,孙蕾,武哲等.不吸水链霉菌武夷变种CK-15遗传 转化体系的探索及初建.生物技术通报,2012,(10):193-198”一文，如下：取作为出发 菌株的不吸水链霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15的 成熟孢子做成孢子悬浮液，将重组菌ETpKC-wysR做成感受态，与CK-15孢子悬浮液 等体积混合后涂MS平板，于30℃培养16小时后，覆盖含25μg/ml的萘啶酮酸以及 50μg/ml的安普霉素（pSETC载体携带安普霉素抗性基因）的1ml无菌水中，继续培 养至长出接合转移子，得到wysR转基因菌株，从中选取2个菌株分别命名为ooR7、 和ooR12。

同时设置向出发菌株CK-15中转入pSETC空载体的对照，所得重组菌株命名为 CK-15/pSETC。

三、wysR转基因菌株的鉴定

挑取步骤二构建的wysR转基因菌株ooR7、和ooR12的单菌落，进行液体培养， 提取菌株的基因组DNA，以其为模板，采用如下引物进行PCR扩增，通过PCR产物 大小及测序结果对wysR转基因菌株进行分子鉴定。同时以作为出发菌株的不吸水链 霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15作为对照。

引物3：5'-GTGCAATACGAATGGCGAA-3'（序列6的第1-19位）；

引物4：5'-GCATTCTTCGCATCCCGCCT-3'（序列6的第731-750位的反向互补 序列）。

理论上，在wysR转基因菌株中，由于重组表达载体psf-wysR中有安普霉素抗性 基因，以其基因组DNA为模板，采用以上引物对进行PCR扩增，会得到与安普霉素 抗性基因序列大小吻合的扩增片段（750bp，序列6的第1-750位）；而作为对照的出 发菌株CK-15由于不含有安普霉素抗性基因，因而采用以上引物对进行PCR扩增， 不会得到目的条带。

将wysR转基因菌株和出发菌株CK-15的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如 图3所示。从图中可以看出，wysR转基因菌株ooR7（泳道2）和ooR12（泳道3）的 PCR产物大小约为750bp，而出发菌株CK-15（泳道1）无扩增条带，与预期结果一 致。进一步，将wysR转基因菌株ooR7和ooR12的PCR产物送样测序，其核苷酸序 列正为序列6的第1-750位。可见，步骤二所得到的wysR转基因菌株ooR7和ooR12 为阳性。

实施例5、△wysR缺失突变株、wysR基因互补菌株和wysR转基因菌株发酵产物 的HPLC分析

一、△wysR缺失突变株、wysR基因互补菌株和wysR转基因菌株的发酵培养

以实施例2获得的△wysR缺失突变株△wysR271和△wysR293，实施例3获得 的wysR基因互补菌株com-R1和com-R2，实施例4获得的wysR转基因菌株ooR7和 ooR12，转入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出发菌株的不吸水链 霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var.wuyiensis）CK-15为实验材料。

取各实验材料新鲜成熟的斜面孢子制成孢子悬浮液，测其OD值，让其OD值在 同一水平，各取5ml分别接种于100mL发酵培养基中，振荡培养（28℃，220r/min） 64h，过滤收集发酵液。

其中，发酵培养基配方如下：每100ml发酵培养基中含玉米粉3g，黄豆饼粉2g， 葡萄糖2g，硫酸铵400mg，碳酸钙300mg，pH约为7.0。

二、发酵液中武夷菌素含量的HPLC分析

采用型号为Agilend l100的高效液相色谱仪进行HPLC分析各菌株发酵液中武夷 菌素的含量。具体如下：

1、标准曲线制作

取武夷菌素标准品，用纯水配制系列浓度的溶液。将系列浓度的武夷菌素标准品 溶液按照如下条件进行高效液相色谱检测。以武夷菌素标准品溶液的浓度为横坐标， 以峰面积为纵坐标，制作标准曲线。

其中，高效液相色谱条件如下：

色谱柱：ZORBAX SB-AQ（4.6mm×250mm，5μm）；流动相：浓度为1.4g/L的 三氯乙酸水溶液；流速：1mL/min；柱温：25℃；检测波长：254nm；进样量20μL。

具体参见“王立东，张克诚，石义萍，崔增杰，高效液相色谱法测定发酵液中的 武夷菌素，农药，第47卷第11期，816-817，2008年11月”一文。

2、待测发酵液中的武夷菌素含量测定

将步骤一所得的各菌株发酵液也分别按照如上条件进行高效液相色谱检测，将与 武夷菌素标准品保留时间一致的色谱峰的峰面积代入步骤1所得标准曲线，从而计算 得到待测发酵液中的武夷菌素的含量。实验重复三次，结果取平均值。

3、结果

武夷菌素标准品的HPLC图谱如图4中A所示，从图中可以看出武夷菌素标准品 的出峰时间为21min。出发菌株CK-15的HPLC图谱如图4中B所示，wysR转基因 菌株（ooR7）的HPLC图谱如图4中C所示，△wysR缺失突变株（△wysR271）的 HPLC图谱如图4中D所示。从图中可以看出，与出发菌株CK-15的目的色谱峰相比， wysR转基因菌株的目的色谱峰峰面积增大，而△wysR缺失突变株未检测到目的色谱 峰。

另外，wysR基因互补菌株（com-R1）的HPLC图谱如图4中E所示，结果表明 wysR基因互补菌株可重新产生武夷菌素，而且产量与原始出发菌株CK-15相比没有 太大差别。可见，wysR基因的回复实验排除了极性效应的影响，确定了wysR基因可 以正调控武夷菌素的生物合成。

进一步，各菌株发酵液中武夷菌素含量的检测结果具体如表1所示。

表1 各菌株发酵液中武夷菌素含量的检测结果（单位：μg/ml）

  重复1 重复2 重复2 平均值 出发菌株CK-15 1190 1100 1050 1113.33 wysR转基因菌株ooR7 2740 2680 2620 2680 wysR转基因菌株ooR12 2860 2740 2700 2766.67 △wysR缺失突变株△wysR 271 0 0 0 0 △wysR缺失突变株△wysR 293 0 0 0 0 wysR基因互补菌株com-R1 1200 1050 1100 1116.67 wysR基因互补菌株com-R2 1010 1210 1040 1086.67

转入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC的实验结果与未转基因的出发菌株 CK-15基本一致，无统计学差异。

实施例6、△wysR缺失突变株、wysR基因互补菌株和wysR转基因菌株抑菌活性 测定

一、△wysR缺失突变株、wysR基因互补菌株和wysR转基因菌株的发酵培养

以实施例2获得的△wysR缺失突变株△wysR 271和△wysR 293，实施例3获得 的wysR基因互补菌株com-R1和com-R2，实施例4获得的wysR转基因菌株ooR7和 ooR12，转入pSETC空载体的对照菌株CK-15/pSETC，以及作为出发菌株的不吸水链 霉菌武夷变种（Streptomyces ahygroscopicus var. wuyiensis）CK-15为实验材料。

取各实验材料新鲜成熟的斜面孢子制成孢子悬浮液，测其OD值，让其OD值在 同一水平，各取5ml分别接种于100mL发酵培养基中，振荡培养（28℃，220r/min） 64h，过滤收集发酵液。

其中，发酵培养基配方如下：每100ml发酵培养基中含玉米粉3g，黄豆饼粉2g， 葡萄糖2g，硫酸铵400mg，碳酸钙300mg，pH约为7.0。

二、管碟法检测发酵液抑菌活性

将各菌株发酵液过滤后，用管碟法测发酵液抑菌活性。以可被武夷菌素抑制生长 的深红酵母AS2.282（Rhodotorula rubra）作为指示菌，从而检测各菌株发酵液的抑菌 活性。具体操作如下：

(1)将深红酵母AS2.282接种于PDA斜面培养基，28℃恒温培养5天，待斜面上 均匀地长满一层菌后用50mL无菌水洗下菌苔，制成菌悬液备用；

(2)将所得菌悬液以2%（体积比）接种量接种于冷却至约40℃的PDA培养基中， 混匀后将此含深红酵母AS2.282的PDA培养基按每皿12.5mL吸入直径为9cm的无菌 培养皿中，待培养基凝固后在培养基表面对称放置4个牛津杯；

(3)将待测的经过滤的各菌株发酵液300μL加入到牛津杯，28℃培养18h后用 游标卡尺测定抑菌圈直径。

实验重复3次，结果取平均值。

结果如图5所示，原始菌株CK-15跟wysR基因互补菌株以及转入pSETC空载体 的对照菌株CK-15/pSETC的抑菌圈直径没有太大差别，而wysR转基因菌株的抑菌圈 直径明显大于前面三个菌株的直径，△wysR缺失突变株没有抑菌活性，抑菌圈直径为 0。

进一步，各菌株发酵液的抑菌圈直径测定结果如表2所示。

表2各菌株发酵液的抑菌圈直径测定结果（单位：cm）

  重复1 重复2 重复2 平均值 出发菌株CK-15 2.5 2.4 2.6 2.5 wysR转基因菌株ooR7 3.2 3.4 3.3 3.3 wysR转基因菌株ooR12 3.1 3.3 3.4 3.27 △wysR缺失突变株△wysR271 0 0 0 0 △wysR缺失突变株△wysR293 0 0 0 0 wysR基因互补菌株com-R1 2.3 2.2 2.4 2.3 wysR基因互补菌株com-R2 2.5 2.1 2.4 2.33