基于来自恶性疟原虫的红细胞前期抗原的疟疾疫苗

摘要

本发明涉及用作疟疾疫苗的多肽或其片段。其还涉及编码本发明的多肽的核酸分子。其进一步涉及包含这些多肽或其片段或核酸分子、特别是这些多肽或其片段的组合的组合物，以及这些组合物作为疟疾疫苗的用途。

说明书

本发明涉及用作疟疾疫苗的多肽或其片段。其还涉及编码本发明的多肽的核酸分子。其进一步涉及包含这些多肽或其片段或核酸分子、特别是这些多肽或其片段的组合的组合物，以及这些组合物作为疟疾疫苗的用途。

发明背景

疟疾是感染性疾病，通过来自疟原虫寄生虫的感染性子孢子经由疟蚊叮咬的接种传播。全球目前估计每年有5亿疟疾病例，并且在流行地区，如撒哈拉以南的非洲每年在1-3百万人中感染是致命的。受影响最严重的是5岁以下的儿童，其中疾病包括几种综合症，例如急性呼吸疾病，严重贫血或脑型疟疾。导致人类疟疾最严重的形式的寄生虫，恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)的生命周期是复杂的和多方面的，具有宿主组织内的局部差异和对应差异的抗原表达的不同形态。子孢子接种后，寄生虫转化并在专性、临床无症状和单向阶段中在肝脏中扩增(Prudenco等，2006)。膜包裹的裂殖子(merozoite)(称为裂殖体)的包装的释放标志着疟疾的发生(Sturm等，2006)，尽管典型地通过其发烧和畏寒的循环模式被识别的疟疾的症状和病理学，专门是在红细胞内疟原虫寄生虫的快速无性繁殖阶段期间导致的(Haldar等，2007)。因此，只有靶向红细胞前期的预防性治疗具有预防疾病并提供有效保护的潜力。用伽马辐射的恶性疟原虫子孢子(RAS)对人和啮齿动物的接种是仅有的赋予基本上完全保护的实验性疫苗，并且是针对蚊传播的疟疾传播的保护性免疫的金标准(Nussenzweig等，1967；Hoffman等，2002)。辐射破坏寄生虫遗传指令(repertoire)并且寄生虫停滞在肝脏中，在那里它们感染后持续至多达6个月(Silvie等，2002)。但是，这些寄生虫在基因上是不明确的，并且直到今天，仅限于实验研究中。然而，此模型提供下列原理论证(proof-of-principle)：基于通过辐射获得的随机的基因减毒，人类中的无虫免疫(sterile immunity)是可能的。近期工作在啮齿动物模型中通过基因减毒的寄生虫(GAPs)已引发了无虫免疫(Mueller等，2005 a/b；van Dijk等，2005；Tarun等，2007；Aly等，2008；Silvie等，2008)。这些GAPs停滞在早期肝脏阶段并赋予持续的和阶段特异性的免疫(Mueller等，2007；Jobe等，2007)。

基于基因减毒的寄生虫的疟疾接种的挑战取决于将在啮齿动物疟疾模型中获得的结果到人疟疾的转化。这已经通过破坏恶性疟原虫中的p52成功进行，所述p52是啮齿动物寄生虫基因p36p的直向同源物，最近已显示其诱发针对子孢子引起的疟疾的无虫免疫(sterilising immunity)(van Schaijk等，2008；van Dijk等，2005；VanBuskirk等，2009)。赋予对减毒子孢子抗性的免疫机制被认为是依赖于免疫系统的体液和细胞武器两者。细胞凋亡的RAS感染的肝细胞导致疟原虫抗原到树突细胞的递呈，有可能引发赋予保护的免疫应答(Leiriao等，2005)。基本上，已认为保护依赖于作为细胞毒性效应细胞的CD8+ T细胞(White等，1996； Bongfen等，2007)和为抗体和最佳记忆CD8+细胞毒性T淋巴细胞活性提供帮助的CD4+ T细胞(Carvalho等，2002)。无虫免疫在不存在CD8+ T细胞的情况下可以获得，其仅仅由CD4+ T细胞和II类效应机制介导(Oliveira等，2008)。有趣的是，已经描述了最近发表的模型，其中磷酸伯氨喹，一种专门靶向疟原虫肝脏阶段的药物，不存在对这样的CD8 + T细胞应答必不可少的持续的代谢活跃肝脏阶段的情况下，已经被用于在体内引发针对随后的子孢子诱导的啮齿动物疟疾的疫苗样保护性免疫(Putrianti等，2009)。并且，野生型寄生虫连同预防化学治疗(例如氯喹)的使用导致对恶性疟原虫的保护性免疫(Roestenberg等，2009)。然而，已表明，长期持续的RAS的形式经由MHCⅠ类递呈寄生虫抗原，其诱导被感染的肝细胞的基于IFN-γ的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)产生(Klotz等，1995)。环子孢子蛋白(CSP)，子孢子主要的表面蛋白，历来被认为是与疟原虫肝脏阶段相关的主要抗原和疫苗候选。到目前已鉴定了几个CSP衍生的T细胞表位，一些与非常高水平的保护相关，如通过用正常子孢子攻击免疫的小鼠后肝脏阶段载量的减少所测量的。RTS,S/AS02A是基于恶性疟原虫CSP的红细胞前期疫苗候选，由葛兰素史克(GSK)和健康适用技术组织(PATH)的疟疾疫苗行动(malaria vaccine initiative，MVI)项目之间合作开发。但是，其结果相当令人失望，具有40和60%之间的效力(Alonso等，2004；Alonso等，2005；Bejon等，2008，Epstein等，2011)。这样的部分保护表明，CSP可能不是减毒模型中唯一的保护性抗原。的确，没有在C57Bl/6小鼠中描述的CSP表位，虽然在Balb/c中存在众所周知并表征的T细胞表位。有趣的是，最近的研究(其采用表达异源恶性疟原虫CSP的伯氏疟原虫(P. berghei)寄生虫系)表明，无虫免疫可以在不存在CSP特异性免疫应答的情况下获得，并且得出结论，迄今尚未被表征的抗原，而不是CSP，可能被靶向以诱导无虫免疫(Grüner等等，2007；Mauduit等，2010)。

本发明的一个目的是提供用于有效疟疾疫苗的手段。更具体地，本发明的一个目的是鉴定新的肝脏阶段抗原，其是保护性的(即，对免疫是关键的)，并从而可以用于接种。

发明概述

根据本发明，此目的通过组合物解决，所述组合物包含至少两种多肽，所述多肽选自包含SEQ ID NO.1-18的氨基酸序列的多肽和与任何上述多肽至少80％相同的多肽，优选进一步选自包含SEQ ID NO.19-23的氨基酸序列的多肽和与任何上述多肽至少80％相同的多肽，或包含上述多肽的至少两种片段。

根据本发明，此目的通过组合物解决，所述组合物包含至少两种核酸分子，所述核酸分子每种编码至少一种根据本发明的多肽或其片段，优选具有选自SEQ ID NO.41-63，更优选SEQ ID NO.41-65的核苷酸序列。

根据本发明，此目的通过提供本发明的组合物解决，其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

根据本发明，此目的进一步通过包含选自SEQ ID NO.1-23的氨基酸序列的多肽，和与任何上述多肽至少80%相同的多肽，或其片段来解决，其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

根据本发明，此目的进一步通过上述多肽的片段解决，所述片段包含或具有选自SEQ ID NO.26-36的氨基酸序列，其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

根据本发明，此目的进一步通过编码至少一种根据本发明的多肽或其片段的核酸分子解决，所述核酸分子优选具有选自SEQ ID NO.41-63的核苷酸序列，其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

本发明优选实施方案的描述

在下文更详细的描述本发明之前，应当理解此发明不限于本文所述的特定的方法学、方案和试剂，因为这些可以变化。还应当理解本文所用的术语学是仅用于描述特定的实施方案的目的，并且不意图限制本发明的范围，其仅被所附的权利要求所限制。除非另有说明，本文所用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员的通常理解具有相同的意思。为了本发明的目的，所有本文引用的参考文献通过引用整体并入。

浓度、量、和其它数值数据可以以范围格式在本文中表达或表示。应当理解仅仅为了方便和简洁起见使用这样的范围格式，并且从而应灵活解释，以不仅包括作为范围的限制明确记载的数值，还包括该范围内包括的所有的单个数值或子范围，好像每个数值和子范围都是明确记载的。作为一个例子，“至少2到23”的数值范围应解释为不仅包括明确记载为2到23的值，还包括所指示的范围内的单独的值和子范围。因此，包括在此数值范围内的是单独的值例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22和23和子范围例如2到5，3到10，4到15，2到8，5到15，和6到10等。作为另一个例子，“5到50个氨基酸”的数值范围应解释为不仅包括明确记载为5到50个氨基酸的值，还包括所指示的范围内的单独的值和子范围。因此，包括在此数值范围内的是单独的值例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、……、49和50和子范围例如5到50，8到25，8到15，和28到40等。此同样的原理适用于记载仅一个数值的范围。并且，无须考虑该范围的广度或所描述的特征，这样的解释都应当适用。

具有疟疾减毒的肝脏阶段(MALS)抗原的组合物

此处我们提出用于疫苗开发的新方法，其利用寄生虫在肝脏阶段，病理学血液阶段发病前的临床无症状的孵育状态的免疫潜力。

除了在自然感染期间获得对疟疾的最终临床免疫的事实之外，上文所述现有技术的结果表明针对疟疾的有效的疫苗原则上可以是可生产的。然而，尽管针对疟疾的自然获得性免疫被认为是针对感染的红细胞期，但是直到今天，只有针对红细胞前期的疫苗已导致针对疟疾感染的保护。由于辐射的子孢子(减毒的寄生虫)难以技术性生产，并且鉴于基于恶性疟原虫CSP的红细胞前期疫苗候选已给出有效性令人失望的结果，新的候选疫苗抗原仍然是需要的。

发明人已发现独特的策略用于鉴定这些抗原。现在本发明公开了靶向肝脏中寄生虫的关键期的保护性抗原。这些新的有效的抗原分离自诱导保护的减毒的寄生虫——疟疾疫苗开发中的新颖性—可以进一步转化成疫苗原型，其通过在此重要的病理学前瓶颈处消除寄生虫来介导免疫。

最终，我们的技术可以进一步扩展，其通过组合本发明内所述的最有效的红细胞前期抗原和红细胞抗原用于形成多成分(阶段)亚单位疫苗，两者均模拟活的减毒寄生虫疫苗，并模拟自然获得性免疫的诱导并从而为下一代疫苗制剂的制备铺平了道路。

如上文所述，本发明提供组合物，包含：

- 新鉴定的MALS抗原(蛋白，多肽)

或

- 其片段

或

- 编码它们的核酸分子。

根据本发明的组合物包含多肽或编码它们的核酸分子中的至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至多达23种(至少2到23种)，例如2到5种，3到10种，4到15种，2到8种，5到15种，和6到10种。

根据本发明的组合物包含本发明多肽中的至少2种，至少3种，至少4种，至少5种，至少6种，至多达23种(至少2到23)的片段，例如2到5种，3到10种，4到15种，2到8种，5到15种，和6到10种的片段。

将要选择用于本发明组合物的蛋白或多肽是包含或具有下列氨基酸序列的蛋白或多肽

与任何上述多肽至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%相同的多肽。

它们进一步选自包含或具有下列氨基酸序列的蛋白或多肽

与任何上述多肽至少80%，优选至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%相同的多肽。

对于细节，参见表1。

上面的登录号是PlasmoDB/GeneDB登录号(www.plasmodb.org，version: 8.1，October 11，201；www.genedb.org，version: November，2010)。

如上文所述，本发明还提供与任何上述多肽至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%相同的多肽，或其片段。

如本文所用，术语“百分比(%)相同的”或“百分比(%)序列同一性”指两个氨基酸序列之间的序列同一性。同一性可以通过比较两个序列中的位置确定，所述位置可以进行比对用于比较目的。当在比较的序列中的等同位置被同样的氨基酸占据时，认为分子在该位置是相同的。

通常地，本领域技术人员知道下列事实，蛋白或肽的氨基酸序列中的一些氨基酸交换对蛋白或肽的(二级或三级)结构、功能和活性根本不具有任何影响。与本文公开的氨基酸序列相比具有该“中性”氨基酸交换的氨基酸序列落入本发明的范围。还包括的是在初始氨基酸序列中的突变，其允许或促进在不同于恶性疟原虫的生物体，例如大肠杆菌中多肽或其片段的产生。

优选地，本发明的组合物包含至少两种多肽，其选自包含或具有SEQ ID NO.1-23的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO.1-23中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽或其一种或多种片段。

在优选的实施方案中，本发明的组合物进一步包含

- 恶性疟原虫Ferlin，

- 恶性疟原虫Ferlin样蛋白和/或

- 另一种恶性疟原虫包含C2结构域的蛋白，或

- 或其片段。

恶性疟原虫Ferlin(Pf FER；PF14_0530)具有SEQ ID NO.24的氨基酸序列，恶性疟原虫Ferlin样蛋白(Pf FLP；MAL8P1.134)具有SEQ ID NO.25的氨基酸序列。

本发明的组合物可以进一步包含一种或多种多肽，所述多肽包含或具有选自下列的氨基酸序列

与SEQ ID NO.24和25的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一种或多种片段。

优选地，本发明的组合物包含至少两种多肽，所述多肽选自包含或具有SEQ ID NO.1-25的氨基酸序列的多肽或与SEQ ID NO.1-25中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽或其一种或多种片段。

- 优选的组合物

本发明的优选的组合物包含下列中的至少两种：

和与SEQ ID NO.1到4中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一种或多种片段。

本发明的优选的组合物包含下列中的至少两种：

和与SEQ ID NO.1到4、15或24中的任何氨基酸序列具有至少80%序列同一性的多肽，或其一种或多种片段。

- 片段

在本发明的一个实施方案中，组合物包含本发明的多肽的片段。

优选地，本发明的一种或多种多肽、即包含或具有SEQ ID NO.1-23(或SEQ ID NO.1-25)的氨基酸序列的多肽的片段，包含多肽的至少一个抗原决定簇或表位。

在一个实施方案中，抗原决定簇或表位的氨基酸序列具有至少8个氨基酸的长度。因此，在优选的实施方案中，片段具有至少8个氨基酸的长度。在一个实施方案中，片段或肽具有在5到50个氨基酸、优选地8到25个氨基酸、更优选地8到15个氨基酸范围内的长度。在一个实施方案中，片段或肽具有在28到40个氨基酸范围内的长度。

在一个实施方案中，抗原决定簇或表位是CD8+ T细胞表位，CD4+ T细胞表位或B细胞表位，优选地CD8+ T细胞表位。优选地，CD8+ T细胞表位是恶性疟原虫特异性的CD8+ T细胞表位，例如HLA-A 0201-限制的CD8+ T细胞表位。本领域技术人员知道在给定的氨基酸序列中如何鉴定/预测CD8+ T细胞表位，例如通过表位预测程序，例如SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de)。

在优选的(至少两种片段的)组合物中，片段选自包含或具有下列氨基酸序列的片段

。

它们可以进一步选自包含或具有下列氨基酸序列的片段

。

在优选的(至少两种片段的)组合物中，片段选自MALS_A (SEQ ID NO. 1)、MALS_B (SEQ ID NO. 2)、MALS_C (SEQ ID NO. 3)、MALS_F (SEQ ID NO. 4)和任选地MALS_Cal (SEQ ID NO. 15)和MALS_E (SEQ ID NO. 24)的片段。

下列片段的混合物/合并物(抗原的肽合并物)是优选的：

MALS_A的片段       SEQ ID NO. 26 到 28，

MALS_B的片段       SEQ ID NO. 29 和 30，

MALS_C的片段       SEQ ID NO. 31 到 33，

MALS_F的片段       SEQ ID NO. 34 和 35，

MALS_Cal的片段     SEQ ID NO. 36，

MALS_E的片段       SEQ ID NO. 37 到 40。

优选的组合物包含含有或具有下列氨基酸序列的片段

SEQ ID NO. 26 到 28，和/或

SEQ ID NO. 29 和 30，和/或

SEQ ID NO. 31 到 33，和/或

SEQ ID NO. 34 和 35，和/或

优选地进一步

SEQ ID NO. 36，和/或

SEQ ID NO. 37 到 40。

在WO 2011/066995中还公开了Ferlin、Ferlin样蛋白和其它包含C2结构域蛋白的抗原片段用于疟疾疫苗的用途。

- 修饰

在一个实施方案中，本发明的一种或多种多肽或其一种或多种片段包含一种或多种进一步的成分，例如一种或多种标记，一种或多种N-和/或C-末端修饰，一种或多种进一步药物或试剂。技术人员将能够选择合适的进一步的成分。

- 编码本发明的一种或多种多肽的核酸分子

在本发明的一个实施方案中，组合物包含编码本发明的多肽的核酸分子。

优选的核酸分子具有选自SEQ ID NO.41-63或SEQ ID NO.41-65的核苷酸序列。

优选的本发明的组合物包含至少两种核酸分子，所述核酸分子每个编码至少一种本发明的多肽或其片段，其优选具有选自SEQ ID NO.41-63，更优选SEQ ID NO.41-65的核苷酸序列。

核酸分子可以是分离的核酸分子、包含它们的质粒、包含它们的表达构建体，例如用于DNA疫苗的表达系统。

- 组合物的进一步成分

根据本发明的组合物可以进一步包含

- 载体

和/或

- 佐剂。

在一个实施方案中，载体融合到一种或多种多肽或其一种或多种片段或编码它们的一种或多种核酸分子(即，如上文所述组合物的成分)上。

在一个实施方案中，载体是病毒颗粒或其部分，病毒载体或病毒颗粒的包膜蛋白，纳米载体。

在一个实施方案中，病毒颗粒是乙型肝炎病毒颗粒或其部分。

在这样的实施方案中，载体，例如乙型肝炎病毒颗粒或其部分，适合用于多肽或其片段的肝脏靶向。

在一个实施方案中，纳米载体是细胞靶向的纳米载体，例如可以从Rodos BioTarget GmbH，Hannover (www.biotargeting.org)获得的细胞靶向的纳米载体，例如 TargoSphere? 递送系统。这些纳米载体可以与所希望的多肽或其片段组合并且特异性地导向至抗原递呈免疫细胞(像APCs，DCs，巨噬细胞等)。

在一个实施方案中，佐剂通常引发CD8 T细胞应答。优选地，佐剂是可商购获得的佐剂系统，例如IC31(Intercell company，Vienna)，因为佐剂系统引发CD8 T细胞应答而非抗体介导的免疫。

组合物作为疟疾疫苗的用途

如上文所述，本发明提供用作疟疾疫苗的组合物。

组合物优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

相比于基于减毒的全生物体的疫苗(活的减毒疫苗)，“亚单位疫苗”由分别的病原体的至少一种成分(蛋白，蛋白片段)组成。

“多成分疫苗”指包含分别的病原体的超过一种成分(蛋白，蛋白片段)的疫苗，其优选地来自不同的发育和疾病诱导的生命周期阶段(多成分(-阶段)疫苗)。

“模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疫苗”指衍生自诱导保护的减毒的疟疾肝脏阶段寄生虫的免疫原性蛋白成分的最小组合。

如上文所讨论，本发明提出用于疫苗开发的新方法，其利用寄生虫在肝脏阶段，病理学血液阶段发病前的临床无症状的孵育状态的免疫潜力。

本文公开并新鉴定的保护性抗原靶向肝脏中寄生虫的关键期。这些新的确认的抗原分离自诱导保护的减毒的寄生虫——疟疾疫苗开发中的新颖性—可以进一步转化成疫苗原型，其通过在此重要的病理学前瓶颈处消除寄生虫来介导免疫。

本发明可以进一步扩展，其通过组合本发明所述的最有效的红细胞前期抗原和红细胞抗原用于形成多成分(阶段)亚单位疫苗，两者均模拟活的减毒寄生虫疫苗，并模拟自然获得性免疫的诱导并从而为下一代疫苗制剂的制备铺平了道路。

MALS抗原、片段、核酸分子作为用于疟疾疫苗的目标

如上文所述，本发明进一步提供多肽，所述多肽包含或具有选自下列的氨基酸序列：

与任何上述多肽至少80%、优选至少85%、更优选至少90%、甚至更优选至少95%相同的多肽，或其片段，其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

如上文所述，本发明进一步提供本发明多肽的片段，所述片段包含或具有选自下列的氨基酸序列

其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

如上所述，本发明进一步提供编码本发明的至少一种多肽或其片段的核酸分子，其优选具有选自SEQ ID NO.41-63的核苷酸序列，其用作疟疾疫苗，优选用作模拟疟疾活的减毒生物体的亚单位疟疾疫苗或多成分疟疾疫苗。

在另一个方面，本发明涉及包含如上定义的至少一种核酸分子或序列的质粒。

在另一个方面，本发明涉及针对如上定义的多肽或其片段的抗体。

在另一个方面，本发明涉及产生如上定义的组合物的方法，包括混合如上定义的至少两种多肽或其片段或如上定义的至少两种核酸分子的步骤。

在又另一个方面，本发明涉及预防疟疾的方法，包括向需要其的人施用如上定义的多肽或其片段，或如上定义的核酸分子或质粒，或如上定义的组合物的步骤。

表1 疟疾减毒的肝脏阶段(MALS)中24个最丰富地上调的转录物概览

下列实施例和附图阐释本发明，然而不限制本发明。

附图简述

图1 显示用于比较恶性疟原虫WT和RAS寄生虫在中肝脏阶段发育后的转录物的改良的抑制消减杂交(SSH)测定的实验设置。

图2 显示通过SMART算法 (www.smart.embl-heidelberg.de，version 7.0，2011年11月)、Pfam、EMBL和PlasmoDB.org预测的所指示的恶性疟原虫蛋白的预测的一级结构。

图3 通过定量RT-PCR对RAS特异性抗原上调的确认

从野生型和RAS的恶性疟原虫肝脏阶段(感染后2天)分离总RNA，然后进行第一链cDNA合成。然后cDNA进行基因特异性qRT-PCR。通过t-检验进行统计学分析。

图4 在暴露于疟疾的肯尼亚成人中检测抗原特异性CD8+ T细胞的培养的ELISpot分析。

从暴露于疟疾(13份血液样品)和未暴露的(未暴露于疟疾的)个体(8份血液样品)的血液中新鲜分离的PBMCs用下列抗原的肽合并物刺激：

。

对于统计学分析，我们进行了曼-惠特尼(Mann-Whitney)U-检验。

图5 在暴露于疟疾的加纳成人中检测抗原特异性CD8+ T细胞的培养的ELISpot分析。

从暴露于疟疾(26份血液样品)和未暴露的(未暴露于疟疾的)个体(8份血液样品)的血液中新鲜分离的PBMCs用下列抗原的肽合并物刺激：

以及衍生自所述血液阶段抗原MSP1的肽(D) (裂殖子表面蛋白 1) (YLIDGYEEI、KLLDKINEI、KLKEFIPKV)。

IFN-γ的分泌已通过培养的ELISpot测定来分析。对于统计学分析，我们进行了曼-惠特尼(Mann-Whitney)U-检验。

图6 在暴露于疟疾的加纳成人中检测抗原特异性CD8+ T细胞的培养的ELISpot分析。

从暴露于疟疾(26份血液样品)和未暴露的(未暴露于疟疾的)个体的血中新鲜分离的PBMCs用下列抗原的肽合并物刺激：

(E) 所述血液阶段抗原MSP1 (裂殖子表面蛋白1)的肽(YLIDGYEEI，KLLDKINEI，KLKEFIPKV)。

IFN-γ的分泌已通过培养的ELISpot测定来分析。对于统计学分析，我们进行了曼-惠特尼(Mann-Whitney)U-检验。

实施例

实施例1 通过SSH筛选在恶性疟原虫肝脏阶段中对潜在免疫原性抗原的鉴定

已经显示了在小鼠(RAS和GAP)中并且也在人(RAS)中用减毒的寄生虫免疫以赋予无虫保护(sterile protection)。通过应用SSH(抑制消减杂交)技术以分析差异表达的基因，发明人鉴定了保护性的肝脏阶段免疫的关键/潜在目标。为了该目的，他们比较了来自野生型和减毒的(RAS)寄生虫的肝脏阶段的转录谱，即保护的RAS形式和未保护的WT形式的cDNA群体。他们修饰的抑制消减杂交(SSH)筛选(图1)允许选择性富集在一个群体中专门存在的高和低丰度的差异调节的cDNA。杂交和PCR扩增步骤的组合允许cDNA群体的同时归一化和消减。由于保护性抗原表达非常早，感染疟疾的肝细胞在宿主细胞侵入后的早期时间点收获。使用SMART PCR cDNA合成和PCR选择cDNA消减试剂盒以鉴定两个群体之间差异表达的基因。

通过测序公司GATC，Konstanz进行鉴定的差异表达的基因的测序，并且所获得的数据用BLAST算法(PlasmoDB version: 8.1，October 8，2011，NCBI，Sanger/GeneDB as of November，2010，SMART)进行评价。对672个RAS特异性克隆的测序和生物信息学分析后，本发明人能够描述如表1所列的24种最丰富地转录的抗原。

它们的预测的一级结构显示于图2中。

实施例2 通过定量RT-PCR对RAS特异性抗原上调的确认。

从差异表达分析(抑制消减杂交筛选)获得的结果已经通过对所选择的抗原进行定量实时PCR(qRT-PCR)来确认。分离自恶性疟原虫野生型和辐射减毒的(RAS)肝脏阶段寄生虫的总RNA已用于定量两个群体中各自的转录物。通过用恶性疟原虫唾液腺子孢子(NF54株，Robert Sauerwein教授，Nijmegen，Netherlands；Delemarre BJM & Van der Kaay HJ，Ned. T. Geneesk 123 (1979))感染培养的原代人肝细胞而获得疟原虫肝脏阶段。

与D. Mazier教授在巴黎INSERM的实验室密切合作进行宿主细胞的感染(Semblat等，2002)。纯化的人肝细胞铺板到胶原I包被的孔上(在6孔板中2.5x10⁶个细胞/孔)并保持直至用唾液腺子孢子感染。细胞已用每孔1.5x10⁶个子孢子感染。为了从辐射减毒的寄生虫获得肝脏阶段，子孢子在肝细胞感染前在150 戈瑞辐射。感染后两天，收获细胞并使用TRIZOL纯化总RNA。用基因特异性引物(Invitrogen)在嵌套式第一链反应中进行第一链cDNA合成(Superscript III第一链合成试剂盒，Invitrogen)。

随后，cDNA用于扩增相应的转录物。SYBR Green已经用于定量(粉末SYBR Green预混合物(Mastermix)，Applied Biosystems)。对于归一化，已经使用寄生虫特异性GAPDH。我们在此分析中还包括作为阳性对照的候选抗原Pf Ferlin(PF14_0530；MALS_E)和Pf Ferlin样蛋白(Mal8P1.134；MALS_G)(如WO 2011/066995中所述和公开的)。

下列寡核苷酸已用于嵌套式第一链cDNA合成：

。

下列寡核苷酸已用于相应转录物的扩增：

。

转录物拷贝的定量清楚地显示在辐射减毒的寄生虫的肝脏阶段中相比野生型肝脏阶段所测试的抗原的1.2到6.5倍的上调(参见图3)。

实施例3 在暴露于疟疾的肯尼亚成人中识别衍生自所选择的抗原候选的肽的抗原特异性T细胞的存在。

为了在暴露于疟疾的个体中研究抗原特异性T细胞的存在，与在肯尼亚医学研究院/韦尔科姆基金会研究项目(KEMRI)的Britta Urban博士合作在半免疫的肯尼亚成人中测试对来自抗原

的第一次选择的肽的T细胞应答。所有成人居住于Junju区，在肯尼亚海岸蒙巴萨以北约60 km。该区域具有两个高传播季节，但是全年发生低水平的传播(每年感染性叮咬：23-53)(Mwangi等，2005)。

为了通过活化的外周血单核细胞(PBMC)确定抗原特异性的IFN-γ的产生，在10天期间进行培养的ELISpot分析。使用Lymphoprep通过梯度离心从新鲜的血液样品纯化外周血单核细胞(PBMCs)，并重悬浮在含10％热灭活的FCS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100U/ml)/链霉素(100μg/ml)的RPMI1640培养基中。用10μg/ml的肽以500μl的体积培养1x10⁶个细胞。在第3天和第7天，移除250μl培养基并用含人IL2(终浓度20U/ml)的新鲜培养基替换。在第9天，细胞清洗3次，重悬浮在500μl培养基中，并放置过夜，然后进行IFN-γ ELISpot分析(IFN-γ ELISpot试剂盒，Mabtech)。细胞(100.000个细胞/孔)转移到用10μg/ml抗人IFN-γ抗体包被的MultiScreen滤膜板，并与指示的肽合并物或培养基(未刺激的对照)孵育过夜(在每个情况下，一式三份)。在移除细胞和几个清洗步骤后，通过使用偶联生物素(1μg/ml)的针对人IFN-γ的二抗和随后添加链霉抗生物素蛋白-ALP和随后的底物溶液来检测分泌的IFN-γ。

所检测的IFN-γ应答显示为计数点/每百万个细胞。图4总结了针对来自抗原Mal13P1.13、PF14_0840、Mal13P1.258 (高应答者)以及PF14_0435 (中度应答者)的各自的肽合并物的特异性T细胞应答，其从而可以被认为是用于针对疟疾的潜在亚单位疫苗的有价值的候选抗原。

实施例4 在半免疫的加纳成人中识别衍生自所选择的抗原候选的肽的抗原特异性T细胞的存在。

我们已经能够将我们的研究扩展到在加纳的超高疟疾区(malaria holo-endemic region)测试T细胞对我们关键的目标抗原的反应性。

在与Achim Hoerauf博士教授(德国波恩大学)和加纳库马西的库马西协作研究中心(KCCR)密切合作中，我们在半免疫加纳成人中研究识别衍生自所选抗原候选的肽的抗原特异性T细胞的存在。作为本发明的一部分所述，大部分所分析的肽已在肯尼亚的Kilifi的研究中进行测试。在此研究中，使用下列抗原候选和相应的肽：

。除此之外，我们还包括衍生自候选抗原Pf Ferlin (PF14_0530)的肽，如下文所述(和在WO 2011/066995中所公开)。

为了通过活化的外周血单核细胞(PBMC)确定抗原特异性IFN-γ的产生，在10天期间内进行培养的ELISpot分析。简而言之，使用Lymphoprep通过梯度离心从新鲜的血液样品纯化外周血单核细胞(PBMCs)，并重悬浮在含10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺和青霉素(100U/ml)/链霉素(100μg/ml)的RPMI1640培养基中。用10μg/ml(除了所测试的抗原混合物，如下文所述)的肽以800μl的体积培养1x10⁶个细胞。在第3天和第7天，移除400μl培养基并用含人IL2(终浓度20U/ml)的新鲜培养基替换。在第9天，细胞清洗3次，重悬浮在500μl培养基中，并放置过夜，然后进行IFN-γ ELISpot分析(IFN-γ ELISpot试剂盒，Mabtech)。细胞(100.000个细胞/孔)转移到用10μg/ml抗人IFN-γ抗体包被的MultiScreen滤膜板，并与指示的肽合并物或培养基(未刺激对照)孵育过夜(在每个情况下，一式三份)。在移除细胞和几个清洗步骤后，通过使用偶联生物素(1μg/ml)的针对人IFN-γ的二抗和随后添加链霉抗生物素蛋白-ALP和随后的底物溶液来检测分泌的IFN-γ。所检测的IFN-γ应答显示为计数点/每百万个细胞。除分析来自个体抗原的肽合并物以外，我们还研究了对抗原混合物(肽合并物)应答的T细胞活化。在此实验设置中，衍生自抗原候选

的肽以每种肽1.25 μg/ml的浓度组合(视作肽合并物)。

已使用暴露于疟疾的个体(半免疫成人)的26个血液样品各自进行两组不同实验(分别为图5和图6)。已经确定了对衍生自已知血液阶段疫苗候选MSP-1(裂殖子表面蛋白1)的肽的平行CD8+ T细胞应答(Goodman等，2010)。与我们的下列假说相当一致：从介导保护的减毒寄生虫系分离的寄生虫转录物可充当抗肝脏阶段免疫的关键目标，我们可以很好地确认这些候选抗原与宿主的免疫系统的显著的相互作用。如通过对于目标抗原MALS_A (Mal13P1.13)、MALS_C (Mal13P1.258)、MALS_E (PF14_0530)和MALS_F (PF14_0435)的IFN-γ分泌所测量的，培养的ELISpot分析因此揭示显著的T细胞活化。

关于显示在图5中的结果：与预期的相反，我们在来自未暴露的组的一些个体中测量到针对MALS_A的IFN-γ应答。针对人和其它顶复虫(apicomplexan)寄生虫(包括弓形虫)序列的特异性肽序列的BLAST搜索之后，我们排除了MALS_A衍生的肽对来自未暴露的个体的PBMCs的特异性再刺激。来自文献的证据表明疟原虫抗原被认为模拟来自其它微生物的抗原，从而诱发交叉反应性引发的记忆T细胞快速再活化(Riley等，1999)。

在以上说明书中、权利要求中和/或附图中所公开的特征，单独和以其任意组合，可以是以其不同形式实现本发明的材料。