一种柯萨奇病毒A16型鼠适应株及其应用

摘要

本发明提供了一种柯萨奇病毒A16型鼠适应株及其应用，所述柯萨奇病毒A16型鼠适应株mCA16V-1243，其保藏号为CGMCCNo.7860。该鼠适应株为柯萨奇A16型病毒疫苗的研发及高效抗病毒药物的筛选，为病原学及病毒感染机制的研究提供有力工具。

说明书

技术领域

本发明涉及病毒学和分子生物学领域，具体地说，涉及一种柯萨 奇病毒A16型鼠适应株及其应用。

背景技术

手足口病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报 导。1957年在新西兰首次报导，1958年首次分离出柯萨奇病毒，并于 1959年首次提出HFMD命名。早期发现的手足口病的病原体主要为 Cox A16型，手足口病与EV71感染有关的报导开始于20世纪70年代 初，1972年EV71首次在美国确认。此后EV71感染与Cox A16感染交 替出现，成为手足口病的主要病原体。其多发生于5岁以下儿童，可 引起手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑 膜脑炎等并发症。个别重症患儿如果病情发展快，导致死亡。其中柯 萨奇病毒(Coxasckievirus)A16型(Cox A16,CA16)是手足口病的主要 病原体之一，它是小RNA病毒科的单股正链RNA病毒，呈20面立体 对称球形。虽然重症和死亡病例主要由EV71病毒感染引起，但特别 值得关注的是Cox A16与心肌炎、心包炎、难治性休克等综合性疾病 相关。

我国自1981年在上海始见本病，以后北京、河北、天津、福建、 吉林、山东、湖北、西宁、广东等十几个省市均有该病的相关报道。 手足口病的爆发和流行严重影响了人们的日常生活，造成巨大的经济 损失和社会负担。研制CA16病毒疫苗及药物，有效控制手足口疫情 是目前全球手足口疫区面临的重大课题。同时因CA16病毒具有种属 限制，仅对宿主敏感，对其它动物不敏感，致使CA16病毒疫苗及药 物在上市之前所需进行的严格的安全性和有效性评价方法也成为世 界性的难题。因此获得稳定的CA16感染动物模型及CA16鼠适应株尤 为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种柯萨奇病毒A16型鼠适应株及其应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种柯萨奇病毒A16型鼠适应 株mCA16V-1243，现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微 生物研究所，邮编100101，保藏编号CGMCC No.7860，保藏日期2013 年7月10日。

上述柯萨奇病毒A16型鼠适应株的制备方法为：将分离的柯萨 奇病毒A16型病毒株经过离心获得上清后，按每只30μL（病毒滴度 为6.12lg CCID50/mL）进行新生乳鼠脑内传代3-6次，离心处理收集 的病毒液即为鼠适应株；末次传代接种6只4-6日龄BALB/c乳鼠， 5-9天后将收集的脑组织、骨骼肌进行匀浆，离心处理后即为柯萨奇 病毒A16型鼠适应株mCA16V-1243。

前述制备方法中，柯萨奇病毒A16型病毒株分离自CA16临床标 本，经分离、蚀斑克隆鉴别后，感染RD细胞，于37±1℃培养，传代 1-3次后，收获病毒液。

所述柯萨奇病毒A16型鼠适应株mCA16V-1243的鉴定方法：将 CA16鼠适应株毒种接种6只4-6日龄BALB/c乳鼠，所有接种病毒 乳鼠在7天后均呈现1-3条肢体麻痹症状，即为成功制备CA16鼠适 应株。

本发明还提供所述柯萨奇病毒A16型鼠适应株mCA16V-1243在 研究柯萨奇A16型病毒致病机理中的应用。

本发明还提供一种柯萨奇病毒A16型感染动物模型，用所述柯萨 奇病毒A16型鼠适应株mCA16V-1243接种4-6日龄BALB/c乳鼠脑，接 种量为每只乳鼠50μL（病毒滴度为3.0-7.0LD50/mL），即得。

本发明还提供上述动物模型在评价用于预防或治疗由柯萨奇 A16型病毒所致传染病的疫苗安全性和有效性中的应用。

本发明还提供上述动物模型在评价治疗由柯萨奇A16型病毒所 致传染病的抗病毒药物安全性和有效性中的应用。

本发明具有以下优点：

（一）通过病毒培养和动物试验技术，获得了柯萨奇病毒A16型 BALB/c乳鼠适应株mCA16V-1243，该鼠适应株为柯萨奇A16型病毒 疫苗的研发及高效抗病毒药物的筛选，为病原学及病毒感染机制的研 究提供有力的工具。

（二）本发明建立了稳定的柯萨奇病毒A16型感染动物模型。

（三）为柯萨奇A16型病毒疫苗的研发及高效抗病毒药物的筛 选，为病原学及病毒感染机制的研究提供技术支持。

附图说明

图1为本发明实施例1中临床分离病毒株的RT-PCR检测结果；其 中，1为CA16病毒株，2为阴性细胞对照，3为EV71阳性对照，4为空 白试剂对照，5为DNA分子量标准。

图2为本发明实施例2中CA16鼠适应株的鉴定结果，图示为注射 病毒组乳鼠四肢瘫痪示意图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未 特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验 手册（Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratory manual, 2001），或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1CA16病毒株的分离、培养和鉴定

（一）病毒分离、培养

自2010年浙江省手足口疫区（手足口累计发病人数达111783）收 集CA16病毒PCR结果阳性的病人粪便标本，经处理后接种至非洲绿猴 肾传代细胞（Vero）上，培养三代进行病毒分离，得到CA16病毒株。

（二）病毒鉴定

1、RT-PCR检测

对该毒株进行CA16基因组RNA提取，逆转录成cDNA，采用VP1 保守区引物（上游引物：5’-TTGCAGACATGATTGACCAG-3’，下游 引物：5’-GAGTGATGGTTCAACACACA-3’）对其进行鉴定，结果表 明分离毒株在212bp处有单一条带出现（图1），可证明经临床标本分 离的毒株为CA16病毒。

2、病毒滴度检测结果

采用微量滴定法测定该株病毒收获液的病毒滴度，病毒滴度可达 6.12lg CCID50/mL。方法如下：采用Vero细胞进行病毒滴度测定。用 96孔细胞培养板培养Vero细胞，细胞成片后将病毒用细胞维持液从 10-1倍比稀释至10-8，弃去Vero细胞上清，分别加入每个稀释度的病毒 液，接种50μL/孔，每个稀释度接种8孔，同时设细胞对照。置37±1 ℃，5%CO2培养箱培养，6-8d观察细胞感染病毒情况，计算病毒滴度。

3、抗原含量检测

采用酶联免疫法对该株CA16病毒抗原含量进行检测，抗原含量不 低于200U/mL。采用双抗体夹心法定量测定样品中CA16抗原含量。首 先将特异性CA16多克隆抗体（购自北京科兴生物制品有限公司）包被 于酶标板形成固相抗体；然后加入CA16样品，与固相抗体形成固相抗 原抗体复合物；最后加入酶标记抗体，样品中的CA16抗原可与酶标抗 体发生特异性结合，当加入底物时出现成色反应，用酶标仪在适当波长 测定OD值，通过EXCEL统计分析结果，抗原含量为400U/mL。

实施例2CA16鼠适应株的制备

病毒液：将上述CA16病毒株感染RD细胞，7天收获病毒液，冻 融三次后，离心取上清病毒液备用。

动物：购买清洁级BALB/c孕鼠，提供充足的食物和饮水，每周 清洁笼舍更换垫料。

CA16鼠适应株的制备与建库：乳鼠出生后将准备好的CA16病毒 液接种乳鼠脑内，接种量为30μL/只（病毒滴度为6.12lg CCID50/mL）， 同时设正常乳鼠对照。接种病毒后每天观察乳鼠状态。收集病态鼠的 脑组织进行匀浆，离心处理后，依上法继续传代4次获得鼠适应株。

CA16鼠适应株鉴定与扩增：

1、将CA16鼠适应株毒种接种6只5日龄BALB/c乳鼠，所有接种 病毒乳鼠在7天后均呈现1-3条肢体麻痹症状（图2），将收集的脑组织、 骨骼肌进行匀浆处理，离心收集上清继续传代1-2次后将收集的脑组 织、骨骼肌进行匀浆处理，离心收集上清分装后即为CA16病毒鼠适 应株毒种库，命名为mCA16V-1243，其保藏号为CGMCC No.7860。

2、病毒滴度检测结果

采用微量滴定法测定该鼠适应株病毒收获液的病毒滴度，病毒滴 度可达5.29lg CCID50/mL（Vero细胞检测）。

实施例3CA16鼠适应株的应用

将标定后的鼠适应株稀释至20LD50/0.1mL，与CA16病毒免疫羊 血清和人感染CA16病毒恢复期血清等量混合，37℃，中和后，注射5 日龄乳鼠，初步评价CA16病毒免疫后血清和自然感染后人血清的保 护效果。结果如表1所示：

表1攻毒保护结果

结果显示，制备的鼠适应株可以有效的评价CA16病毒免疫血清 和自然感染CA16人血清的保护性。可进一步为研究柯萨奇A16型病原 学、发病机制及高效药物的筛选和疫苗的研制奠定基础。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详 尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本 领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础 上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。