一种拟南芥花器官特异性启动子及其应用

摘要

本发明涉及一种新发现的DNA序列，它可以作为启动子调控目的基因特异性地表达在拟南芥的花器官中。本发明从模式植物拟南芥中克隆了

说明书

 

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体说是利用分子生物学技术获得一种拟南芥花器官特异性启动子及其在转基因植物中的应用。

背景技术

启动子是位于结构基因上游一段特定的核酸序列，能够控制其下游结构基因转录的起始时间和强度。启动子就像“开关”，决定结构基因的活动。高等植物基因的表达调控很多发生在转录水平上，并受多种顺式作用元件和反式作用因子的相互协调作用，植物基因启动子是重要的顺式作用元件(李杰等，2006)。

根据植物中启动子启动转录的模式和功能可将其分为三类：组成型启动子、组织或器官特异性启动子和诱导型启动子(王颖等，2003)。组成型启动子在所有组织中都能启动基因的表达，具有持续性，不表现时空特异性，RNA和蛋白质表达量也相对恒定；组织或器官特异性启动子调控下的基因转录一般只发生在某些特定器官或组织中；诱导型启动子是在某些物理或化学信号的诱导下，可以提高目的基因的表达水平(王颖等，2003；路静等，2004)。

在组成型启动子中，使用最广泛的是花椰菜花叶病毒的CaMV 35S启动子、来自根癌农杆菌Ti质粒T-DNA区域的胭脂碱合成酶基因Nos启动子和章鱼碱合成酶基因Ocs启动子等(王颖等，2003；李杰等，2006)。目前，虽然许多研究利用组成型启动子驱动目的基因的表达对于基因的功能研究取得了一定的进展，但是由于利用组成型启动子会导致所驱动的目的基因在植物所有组织中大量表达，过度消耗细胞内的物质和能量，并且不能从时空间上调控目的基因的表达，因此在应用中存在很多的弊端(Gittins et al., 2000)。如使用组成型启动子会导致目的基因在整体植株中表达，产生大量的代谢产物使原有的代谢失衡，阻碍了植物的正常生长发育，甚至导致死亡(Gilmour et al., 2004; Qin et al., 2004; Savitch et al., 2005; Thomashow, 2010)。另外，重复使用组成型启动子驱动多个外源基因的表达可能引起基因沉默(Kumpatla et al., 1998)。因此，亟待需要寻找更为有效的组织器官特异性启动子代替组成型启动子，以更好地调控植物基因的表达。组织器官特异性启动子由于其驱动目的基因的表达发生在某些特定的器官或组织部位并具有发育的调节性，所以在很大程度上可以克服利用组成型启动子在理论和应用研究中突显的种种缺陷。目前在许多种植物中已经发现了这类组织器官特异性启动子并得到了广泛的应用。如毛自朝等(2002)将番茄果实特异性启动子2A12和ipt目的基因构成的融合基因转入番茄，获得了无籽番茄果实，且果实采后的储藏保鲜时间大大被延长。Mariani等(1990; 1992)将烟草花药绒毡层特异表达基因的启动子TA29与Barnase基因融合后转化植物核酸酶基因在花药中特异表达，获得了烟草和油菜的雄性不育材料，随后基于TA29-Barnase雄性不育的转基因油菜获得商业化应用。

拟南芥属于十字花科，由于其个体形态小、生长周期短、繁殖能力强、基因组小和生物信息资源丰富等特点，成为植物遗传学、发育生物学和分子生物学研究的模式植物(张振桢等，2006)。花是种子植物的繁殖器官，一朵完全的花由花柄、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊等几部分组成。在理论研究方面，花作为植物重要的生殖器官，在利用植物杂种优势人工创建不育系、以花器官的表达元件研究参与花器官发育基因的功能等研究中起重要的作用；在应用方面，随着人们对花卉的需求日益增加，在观赏品质如花形、花色、花香和观赏寿命等方面具有优良特性的高档奇异花卉具有广阔的市场前景(郑少缘等，2011)。基因工程育种具有育种周期短、效率高、培育定向性等优点，在花卉基因工程研究中，植物花器官特异性启动子可使目的基因在花中特异表达具有时空性，为改良和创造优、新、特花卉品种提供了一条新的途径。

目前还没有一种在分子生物学模式植物拟南芥花器官特异性表达的启动子，因此本领域迫切需要筛选和开发有利于拟南芥或其他植物花器官特异性表达的启动子。获得并有效利用植物花器官特异性启动子不仅有助于阐明植物花器官发育的基础理论问题，更可以有针对性地调控名贵花卉的花形、花色、花香和观赏寿命，势必将成为花卉性状改良和新品种培育的强有力工具，具有广泛的应用价值。

发明内容

本发明目的是解决现有植物基因工程技术技术中，因使用组成型启动子，外源基因在转基因植物中过量表达异源蛋白或代谢产物，使植物原有的代谢失衡，阻碍了植物的正常生长发育，甚至导致死亡，以及重复使用同一种组成型启动子驱动多个外源基因的表达可能引起基因沉默的问题。同时为深入研究参与植物花器官发育基因的功能，有效调控花卉的花形、花色、花香和观赏寿命等观赏品质，提供一种分子生物学模式植物拟南芥花器官特异性的启动子及其在转基因植物中的应用。

本发明提供了一种新的、2085bp的拟南芥花器官特异性启动子，该启动子核酸序列选自：

(a)如序列表1所示的核酸序列；

(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有80％以上的同源性的核酸序列。作为具体应用的实例，本发明提供了一种拟南芥花器官特异性启动子的克隆方法，具体操作步骤如下：

第一、以拟南芥基因组DNA为模板，用PCR方法扩增花器官特异性启动子；

第二、回收PCR扩增产物；

第三、将上述第二步回收的扩增产物，与pMD-18载体(购自TaKaRa公司)在连接酶催化下进行连接反应；

第四、将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

第五、通过氨苄霉素抗性筛选，获得该启动子的阳性TA克隆。

本发明同时提供了拟南芥花器官特异性启动子的应用，即：利用获得的花器官特异性启动子，构建“启动子-目的基因”的融合基因，进行植物转化，从而获得基因组中含有以上所述启动子核酸序列的、可在拟南芥花器官特异性表达目的基因的转基因植物。其中所述的融合基因中的目的基因可以是任何针对基础研究、转化技术、花卉或者农作物性状改良需要的目的基因。

作为具体应用的实例，本发明提供了一种“启动子-GUS报告基因”融合基因的构建及其在转基因拟南芥花器官中进行特异性表达。具体操作过程如下：

第一、用Xba I /Nco I双酶切含有拟南芥花器官特异性启动子的TA克隆质粒，回收花器官特异性启动子片段；

第二、用Xba I /Nco I双酶切pCAMBIA 1301(购自CAMBIA公司) 质粒，回收大的载体片段(其中含有GUS报告基因的编码序列)；

第三、混合上述第一步得到的花器官特异性启动子片段和第二步得到的pCAMBIA 1301载体大片段，在连接酶催化下进行连接反应，完成在pCAMBIA 1301载体上的“花器官特异性启动子-GUS”融合基因的构建。

其中所设计的拟南芥花器官特异性表达启动子的PCR扩增引物如下，其中上游引物引入了Xba I酶切位点，下游引物引入了Nco I酶切位点：

上游引物：5’-TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3’

下游引物：5’-CCATGGCCTTATCCTTCTTCTCCTTC-3’。

所述应用中的“花器官特异性启动子-GUS报告基因”在转基因拟南芥花器官中特异表达，操作过程如下：

拟南芥转化的具体方法，采用农杆菌介导的Floral dip的方法(Clough and Bent, 1998)，获得的种子经过50 mg l^-1 潮霉素抗性筛选，生长正常的抗性植株转土培养，利用组织化学染色的方法(Blume and Grierson, 1997)，检测转基因拟南芥整个生长发育过程中各个组织器官中GUS报告基因表达的花器官特异性。

本发明的优点和积极效果：

本发明利用有效的拟南芥花器官特异性启动子代替组成型启动子，可以用于构建在分子生物学模式植物拟南芥花器官特异性表达目的基因的融合基因。利用遗传转化技术将其转入拟南芥或其他植物的基因组中，可以实现对目的基因的定向操作，获得花器官特异性表达目的基因的转基因植物。这种拟南芥花器官特异性表达启动子不仅有助于阐明植物花器官发育的基础理论问题，更可以有针对性地调控名贵花卉的花形、花色、花香和观赏寿命，势必将成为花卉或者农作物性状改良和新品种培育的强有力工具，具有广泛的应用价值。

附图说明

图1 是拟南芥花器官特异性启动子克隆的电泳检测图。

图2 是拟南芥“花器官特异性启动子-GUS”转基因拟南芥植株的PCR鉴定。

图3 是“花器官特异性启动子-GUS”转基因拟南芥植株的GUS染色结果。

具体实施方式

实施例1：拟南芥花器官特异性的启动子克隆

第一、以拟南芥基因组DNA为模板，利用PCR方法扩增2085bp的花器官特异性启动子，回收扩增产物并进行TA克隆。

(1)PCR扩增目的片段：

①根据已知的拟南芥AtcpSecY1基因启动子区的序列设计特异引物，在上游引物中引入Xba I酶切位点，在下游引物中引入Nco I酶切位点。

上游引物：5’-TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3’ (引入Xba I酶切位点)

下游引物：5’-CCATGGCCTTATCCTTCTTCTCCTTC-3’ (引入NcoI酶切位点)

②按常规方法提取拟南芥基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物进行PCR扩增，制备花器官特异性启动子片段。

PCR 反应程序：

94℃ 3分钟；

94℃ 30秒，56℃ 30秒，72℃ 2分30秒，32个循环；

72℃ 10分钟；

4℃保温。

PCR 反应体系：

(2)目的片段的克隆和阳性克隆的鉴定：

①目的片段的回收：

通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段，回收方法采用大连宝生物公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤见商品说明书。

②连接：

加入下列反应体系的试剂，16℃反应过夜，实现目的片段与pMD18-T(购自TaKaRa公司) 载体的连接。

连接体系：

③转化和阳性克隆的鉴定：

按常规的CaCl₂诱导和转化方法，制备大肠杆菌DH5α 感受态细胞，用10 μl连接产物转化感受态细胞，然后均匀涂布到含有Amp、X-gal和IPTG的平板上，37℃倒置培养12-14小时。挑选转化平板上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Xba I和Nco I双酶切，产生含有花器官特异性启动子的2095 bp片段。按前面所述的PCR引物和扩增条件，以质粒提取物为模板，进行PCR 扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测产生2097 bp的拟南芥花器官特异性启动子片段，即为含有花器官特异性启动子序列的阳性克隆。如图1所示，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1：以H₂O为模板的PCR体系负对照；泳道2：拟南芥花器官特异性启动子克隆的PCR产物。

 

④测序验证

经过鉴定的阳性克隆，送交菌穿刺培养物到Sangon上海生工生物技术有限公司)进行DNA测序，其核酸序列如序列表1所示。

实施例2：利用pCAMBIA1301载体(含有GUS报告基因)构建“拟南芥花器官特异性启动子-GUS”融合基因

(1)从大肠杆菌中提取载体pCAMBIA 1301质粒(购自CAMBIA公司)，用Xba I/Nco I双酶切后回收大的载体片段(其中包含有GUS报告基因序列)。

(2)从实施例1所制备的TA克隆中提取质粒，用Xba I/ Nco I双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳回收(同实施例1)拟南芥花器官特异性启动子片段。

(3)将上述2个片段在连接酶催化下于16℃连接过夜，完成pCAMBIA 1301载体上的“拟南芥花器官特异性启动子-GUS”融合基因构建。

连接体系：

试剂加入量(μl)花器官特异性启动子片段(50 ng μl^-1)2.0pCAMBIA1301载体大片段(50 ng μl^-1)3.0Solution I连接酶5.0

(4)用连接混合物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，方法同实施例1。

(5)挑选转化平板(卡那霉素抗性)上的白色菌落，按常规方法提取质粒，用Xba I和BstE II双酶切质粒DNA产生两个片段，一个是9002 bp 的pCAMBIA1301 载体片段，另一个是4135 bp的“拟南芥花器官特异性启动子-GUS”融合基因。

(6)以质粒为模板进行PCR反应，鉴定质粒中的“拟南芥花器官特异性启动子-GUS”融合基因，扩增片段的大小是2890 bp。所用引物如下：

上游引物：5’-TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3’

下游引物：5’-TACAGTCTTGCGCGACATGCG-3’

(7) 经过酶切和PCR鉴定的阳性克隆，送交测序公司测序。

(8)从阳性克隆中提取质粒，用常规方法转化农杆菌GV3101，获得工程化农杆菌，用于植物转化。

实施例3：转基因拟南芥植株的制备

(1)用实施例2构建的“拟南芥花器官特异性启动子-GUS”融合基因转化拟南芥，具体转化方法采用农杆菌介导的Floral dip的方法(Clough and Bent, 1998)，获得的种子经过50 mg l^-1潮霉素抗性筛选，生长正常的植株转土培养。

(2) 转基因植株的PCR检测：分别剪取转基因植株和野生型植株的叶片，参考《分子克隆实验指南(第三版)》(黄培堂等，2002) 方法提取叶片基因组DNA，用如下引物进行PCR反应，反应体系如同实施例1：

上游引物：5’-TCTAGAGAACCATTGGCCATGTCGCTCA-3’

下游引物：5’-TACAGTCTTGCGCGACATGCG-3’

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，转基因植株出现2890 bp的“拟南芥花器官特异性启动子-GUS”融合基因条带，非转基因植株未出现融合基因条带，证明目的片段已整合到植物基因组中。如图2所示，泳道M：DL2000 DNA Marker；泳道1-2：以转化拟南芥花器官特异性启动子-GUS融合基因的转化植株DNA为模板的PCR产物；泳道3：以拟南芥花器官特异性启动子-GUS质粒为模板的PCR正对照；泳道4：以野生型拟南芥的基因组DNA为模板的PCR的负对照。

实施例4：转基因拟南芥中各个器官组织的GUS化学染色

利用组织化学染色(Blume and Grierson, 1997)的方法，检测在T1代转基因拟南芥中花器官特异性启动子驱动下GUS表达的器官特异性和发育特异性。在转基因植物各个器官、组织或细胞中的蓝色为报告基因GUS的组织化学染色，代表着花器官特异性启动子在这些部位具有表达活性。染色时间为10小时，将材料的染色结果扫描成图片后保存。

染色结果如图3所示：其中， a：幼苗；b：成熟苗；c：主茎（包括茎生叶）d：花序；e：完全花；f：成熟种荚。光周期16 h光/8 h暗条件下，在“花器官特异性启动子-GUS”转基因拟南芥的花中都有很强的GUS活性，包括花柄、萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊。而在莲座叶、根、主茎、茎生叶和成熟的种荚中则没有GUS表达(图3)。结果证明：花器官特异性启动子可以驱动GUS报告基因在转基因拟南芥的花器官中特异性表达，说明该启动子在转基因拟南芥中具有很好的花器官特异性，可以驱动目的基因在转基因植物的花器官中进行特异表达。

上述的实施例结果表明并且确证，本发明所提供的拟南芥AtcpSecY1基因启动子不仅具有强的活性，而且还具备很好的花器官特异性，并且该启动子强的活性和花器官特异性能够稳定地遗传给后代。因此，本发明所提供的拟南芥AtcpSecY1基因启动子是一个稳定、活性强和花器官特异性高的启动子。获得并有效利用该启动子，不仅有助于阐明植物花器官分化、形成、生长和发育的分子机制等理论研究提供重要的分子元件，还为植物基因工程育种，特别是名贵花卉的花形、花色、花香和观赏寿命等调控的基因工程育种提供了重要的分子调控元件，具有广泛的应用价值。