Galectin-4蛋白在制备巨大肝癌术后预后评估试剂盒中的应用

摘要

本发明提供了Galectin-4蛋白在制备巨大肝癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测Galectin-4蛋白在巨大肝癌组织中的相对表达量，能够判断巨大肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了Galectin-4蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断巨大肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于巨大肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及Galectin-4蛋白在制备巨大肝癌术后预后评估试剂盒中的 应用。

（二）背景技术

肝癌是一种严重的肝脏疾病，其死亡率在恶性肿癌中排名第三。据研 究报道，仅在亚洲和非洲，每年就有50万人死于肝癌。而我国又是一个 肝癌发病率较高的国家，近几年来我国肝癌的发病率和死亡率都呈上升态 势，且发病人群呈现年轻化，致使每年国家用于治疗肝癌的支出大幅增加， 对人民群众的生命健康及财产安全构成了极大的威胁，影响社会的稳定。

巨大肝癌指的是直径大于10cm的肝癌亚型。目前手术切除治疗是巨 大肝癌患者的首选方案，但术后易转移复发、预后差是巨大肝癌治疗效果 差且致死率高的主要原因。统计数据表明，巨大肝癌术后5年之内复发的 概率达到70%。研究表明，巨大肝癌术后复发转移最早可在术后2个月 以内；术后1～2年为复发转移的高发期。Shimul等报道56例巨大肝癌 根治术后复发病人，1年内复发21例（38%），1年后复发31例（55%）； 并发现复发后生存率与复发时间密切相关：术后1年内复发者3年生存率 显著低于1年后复发者（参考文献：Shimul A Shah,Paul D Greig,Steven  Gallinger,et al.Factors associated with early recurrence after resection for  hepatocellular carcinoa and outcomes.J Am Coll Surg,2005,10 （5）:275-283.）。Hayashi等观察了肝癌术后复发时间与预后间的关系，1 年内复发患者1、3、5年生存率分别为75.7%、36.6%和28.3%，远低于2 年后复发的生存率（1、3、5年生存率分别为100%、92.2%和68.6%）（参 考文献：Hayashi M,Shimizu T,Hirokawa F,et al.Clinicopathological risk  factors for recurrence with one year after initial hepatectomy for  hepatocellular carcinoma.J Am Surg,2011,77（5）:572-578.）。可见肝癌术 后1年内复发的比例较高，且对生存率有明显影响。但复发转移的机制还 没有被明确阐明使临床缺少巨大肝癌预后判断指标和相应的治疗手段。

肝癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关 联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，肝癌早期复发 转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异 性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高肝癌术后总体治疗效 果。因此，探寻切实有效的肝癌肝切除术后早期复发相关预警分子标志， 阐明其与肝癌早期复发转移的关系，这对提高肝癌术后治疗效果、评估肝 癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。

半乳糖凝集素是一类含有能识别β半乳糖并结合碳水化合物保守结 构域（carbohydrate recognition domain,CRD）的家族蛋白，属于内源性凝 集素，它广泛存在于从线虫到人类各级动物组织中，并具有高度进化保守 性。迄今为止，已发现15个家族成员，根据结构不同，分3个亚型，即 原型（包括Galectin-1、-2、-5、-7、-10、-11、-13、-14、-15）、嵌合型 （Galectin-3），串联重复序列类型（Galectin-4、-6、-8、-9）。半乳糖凝集 素广泛参与肿瘤的抗凋亡、增殖、分化以及侵袭和转移等方面。部分凝集 素在肿瘤细胞侵袭和转移中的作用己经得到了证明，包括Galectin-1， Galectin-3，Galectin-8。凝集素介导的癌细胞侵袭和转移的调节，可能与 凝集素和整合素在细胞与细胞、细胞与基质之间紧密合作有关。

Galectin-4是第一个从线虫中发现且一条多肽链上含有两个CRD保 守结构域的半乳糖凝集素亚家族成员，分子量大小为36kDa，在细胞内主 要位于细胞质。近几年，研究发现Galectin-4通过Wnt，IL-6/NF-kB/STAT3 等多个信号通路参与肿瘤的发生发展过程，且在不同肿瘤发生发展中的作 用不同（参考文献：Satelli A,Rao PS,Thirumala S,et al.Galectin-4 functions as  a tumor suppressor of human colorectal cancer.Intern J Cancer,2011,129 （4）:799-809.；Kim SW,Park KC,Jeon SM,et al.Abrogation of galectin-4 expression promotes tumorigenesis in colorectal cancer.Cell Oncol,2013,36 （2）:169-178.）。文献报道Galectin-4在包括舌及结直肠在内的正常消化 道组织中表达，在结直肠肿瘤组织中表达下调；而在回肠类癌瘤，粘液性 上皮卵巢癌，鼻腔鼻窦未分化癌，膀胱癌等肿瘤组织中上调（参考文献： Rumilla KM,Erickson LA,Erickson AK,et al.Galectin-4 expression in  carcinoid tumors.Endocr Pathol,2006,17（3）:243-249.；Heinzelmann-Schwarz  VA,Gardiner-Garden M,Henshall SM,et al.A distinct molecular profile associated with mucinous epithelial ovarian cancer.Br J Cancer,2006,96 （4）:904-913.；Tripodi D,Quemener S,Renaudin K,et al.Gene expression profiling in sinonasal adenocarcinoma.BMC Med Genomics,2009,2 （65）:1-12.）。而Galectin-4在肝癌肿瘤方面的表达情况相对比较复杂， 有报道指出Galectin-4在肝细胞癌中特异性高表达，而本发明研究发现在 巨大肝癌中的Galetin-4表达与病人术后预后存在显著的关系，原发性肝 癌中的Galectin-4表达量显著高于易复发转移肝癌，暗示Galentin-4可作 为巨大肝癌的术后预后的有效预警蛋白。

肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍 不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而Galectin-4做为十分重 要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道Galectin-4蛋白与判断巨大肝癌（即 巨大肝细胞癌）预后或巨大肝癌转移相关。

（三）发明内容

本发明目的是提供Galectin-4蛋白在制备巨大肝癌术后预后评估试剂 盒中的新应用。

本发明采用的技术方案是：

Galectin-4蛋白在制备巨大肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测 Galectin-4蛋白在巨大肝癌组织中的相对表达量，能够判断巨大肝癌患者 出现肝癌复发转移的风险。基于Galectin-4蛋白表达量与肝癌复发转移的 相关性，以该蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌 的预后判断，因此可将Galectin-4蛋白作为分子标记，利用Galectin-4单 克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测Galectin-4蛋白在 肝癌组织中的相对表达量。

所述试剂盒主要包括：人源Galectin-4单克隆抗体或多克隆抗体、免 疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用 试剂。

发明人在蛋白组学研究中发现，Galectin-4在复发转移巨大肝癌组织 中表达低于未复发转移巨大肝癌组织，并且在后续的验证实验中通过蛋白 水平和基因水平证实了Galectin-4在巨大肝癌术后复发转移组中表达下 调，可以推测Galectin-4在巨大肝癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国 内外文献，Galectin-4与肝癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本实 验中，Galectin-4在肝癌组织中的表达下调，而在癌旁和正常肝组织中则 表达上调，这与文献报道较多的Galectin-4在结直肠肿瘤中表达下调相符， 且与未复发转移组相比，Galectin-4在复发转移组中表达也下调，表明 Galectin-4可能作为抑制因子参与肝癌发生发展过程。研究表明，肝癌术 后早期复发转移与原发癌细胞内肝内转移、微血管侵犯有关，在研究中发 现Galectin-4阴性表达与巨大肝癌患者的年龄、性别、有无合并肝硬化、 合并乙肝病毒感染、包膜以及癌细胞分化程度无关（P均>0.05）；而与术 前血清AFP值、血管侵犯有关（P<0.05），表明Galectin-4低表达可能通 过影响肝癌血管形成途径而促进巨大肝癌的早期复发转移。通过 Kaplan-Meier生存曲线分析，Galectin-4表达程度与巨大肝癌患者的预后 有关，Galectin-4低表达的患者预后不良（P<0.05）。

综上所述，Galectin-4在巨大肝癌组织中低表达，Galectin-4的低表达 与巨大肝细胞癌患者术后复发转移有关。Galectin-4可以作为巨大肝癌预 后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源Galectin-4多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示 的Galectin-4蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

具体的，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3%H₂O₂（水 溶液）、3%BSA封闭液（以PBS配制）、DAB显色试剂、苏木素、辣根 过氧化物酶（用于标记二抗）、PBS（pH7.4）、0.01M EDTA修复液。

本发明所述试剂盒的使用方法如下：

（a）病理标本来自于巨大肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取 材。

（b）免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：

（c）制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

（d）切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min； 二甲苯III：10min。

（e）切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90%（v/v）乙醇：3min； 80%乙醇：3min；75%乙醇：3min。

（f）PBS清洗3次，每次5min。

（h）EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸 水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。

（I）加入300μL的3%（w/w）过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS 清洗3次，每次5min。

（J）加入300μL的3%（w/w）BSA封闭液（PBS配制），37℃1h。 PBS清洗3次，每次5min。

（K）加入一抗：Galectin-4抗体浓度：1：500（abcam公司：ab154309）， 4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。

（L）滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（购 自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释），37℃45min。PBS洗4次， 每次5min。

（M）PBS洗3次，每次5min。DAB（DAB显色试剂盒，购自上 海生工）显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s， 用自来水冲洗浸泡。

（N）脱水。依次浸泡：75%乙醇:2min；80%乙醇：2min；90%乙醇： 2min；无水乙醇：2min。

（O）用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

（P）利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野 拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后 采用该软件的Algorithms（Positive Pixel Count V9）程序对每个样本进 行阳性强度计算，计算数据如下：

（Q）每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity× Log10[255/Iavg]，其中Positivity=NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法 为阳性象素数量/显色总数量；Iavg=（Iwp+Ip+Isp）/（Nwp+Np+Nsp），即 阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度=（弱阳性象素总强度+阳性象 素总强度+强阳性象素总强度）/（弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性 象素数量），即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。

（L）采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计 数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预 后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验（log-ranktest）比较 生存曲线的差别。本发明显示Galectin-4蛋白与巨大肝癌的预后具有显著 的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对 巨大肝癌患者的预后有重要作用。当癌组织Galectin-4免疫组化评分低于 于0.1545时，肝细胞癌易出现复发转移，巨大肝癌患者术后易死亡。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了Galectin-4蛋白在制备 巨大肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断巨大 肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于巨大肝细胞癌病人术后监控和序贯 治疗也具有重要的指导意义。

（四）附图说明

图1为在146例巨大肝癌样品中癌组织的Galectin-4表达量显著低于癌旁 组织；

图2为Galectin-4在巨大肝癌患者术后1年内复发转移的组织样本中弱表 达（EliVision^TM plus二步法DAB显色×40）；

图3为Galectin-4在巨大肝癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中强 表达（EliVision^TM plus二步法DAB显色×40）；

图4为Galectin-4在癌旁肝组织中高表达（EliVision^TM plus二步法DAB 显色×40）；

图5为巨大肝癌组织中Galectin-4低表达组与高表达组生存曲线；

图6为巨大肝癌组织中Galectin-4低表达组与高表达组无瘤生存曲线。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：

（a）病理标本来自于巨大肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取 材。

（b）免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：

（c）制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

（d）切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min； 二甲苯III：10min。

（e）切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90%（v/v）乙醇：3min； 80%乙醇：3min；75%乙醇：3min。

（f）PBS清洗3次，每次5min。

（h）EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸 水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。

（I）加入300μL的3%（w/w）过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS 清洗3次，每次5min。

（J）加入300μL的3%（w/w）BSA封闭液（PBS配制），37℃1h。 PBS清洗3次，每次5min。

（K）加入一抗：Galectin-4抗体浓度：1：500（abcam公司：ab154309）， 4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min。PBS洗4次，每次5min。

（L）滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG（购 自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释），37℃45min。PBS洗4次， 每次5min。

（M）PBS洗3次，每次5min。DAB（DAB显色试剂盒，购自上海 生工）显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用 自来水冲洗浸泡。

（N）脱水。依次浸泡：75%乙醇：2min；80%乙醇：2min；90%乙 醇：2min；无水乙醇：2min。

（O）用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

（P）利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野 拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的照片进行扫描，扫描后 采用该软件的Algorithms（Positive Pixel Count V9）程序对每个样本进行 阳性强度计算，计算数据如下：

（Q）每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity× Log10[255/Iavg]，其中Positivity=NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法 为阳性象素数量/显色总数量；Iavg=（Iwp+Ip+Isp）/（Nwp+Np+Nsp）， 即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度=（弱阳性象素总强度+阳性 象素总强度+强阳性象素总强度）/（弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳 性象素数量），即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。Galectin-4 高低表达标准以146例巨大肝癌组织中Galectin-4表达评分的中位数 （0.1545）为界。

（L）采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资 料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的 分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验（log-ranktest）比较生存 曲线的差别。

按照上述方法，本发明在146例巨大肝癌病人的肿瘤组织中检测结果 如图1所示：Galectin-4在巨大肝癌中的表达量显著低于癌旁组织的表达 量。Galectin-4在1年内复发转移组中低表达（图2），在无复发转移组中 高表达（图3），在癌旁组织中高表达（图4）。在1年内复发转移组中， Galectin-4蛋白59例低表达，14例高表达，高表达率19.1%（14/73）；1 年内无复发转移组的患者中，30例低表达，43例高表达，高表达率为58.9% （43/73）（表1）。Galectin-4在1年内复发转移组中的高表达率明显低于 未复发转移组，差异具有统计学意义（χ²=24.20，p<0.001）

表1：Galectin-4在复发转移组和未复发转移组巨大肝癌组织中的表达情况

Galectin-4蛋白表达与巨大肝细胞癌患者临床病理特征的关系：

由表2可以看出Galectin-4低表达与患者性别、年龄、是否伴有肝硬 化、是否合并乙肝感染、癌细胞分化程度、包膜情况均无明显相关性 （p>0.05），与术前血清AFP值、术中肉眼癌栓和镜下脉管癌栓有关（均 p<0.05）。

表2：Galectin-4蛋白表达与巨大肝细胞癌患者临床病理特征的关系

Galectin-4与巨大肝细胞癌患者预后的关系：

通过Kaplan-Meier生存曲线分析，Galectin-4的表达程度与巨大肝细 胞癌患者的预后相关。Galectin-4高表达组平均生存期36.61个月，术后 存活时间最长为61个月，3年生存率为34.8%；Galectin-4低表达组平均 生存期为27.92个月，术后存活时间最长的为42个月，3年生存率为 24.0%，差异具有统计学意义（χ²=5.836，P=0.015）（图5）。Galectin-4高 表达组无瘤生存期为26.08个月，累积无瘤生存率1年、2年、3年分别 为83.6%、41.8%、21.5%；Galectin-4低表达组无瘤生存期为18.28个月， 累积无瘤生存率1年、2年、3年分别为53.1%、25.9%、13.4%（图6）， 两组比较差异有统计学意义（χ²=5.836，P=0.016）。

实施例2：

取某巨大肝癌术后肝细胞癌肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上 所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的Galectin4免疫 组化组织评分为0.085。经过术后随访发现，该患者在术后第5个月发生 肝癌复发转移，术后七个月死亡。

实施例3：

取某巨大肝癌术后肝细胞癌肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以 上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的Galectin4免 疫组化组织评分为0.215。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发 现转移复发，健在。

由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测Galectin-4蛋 白分子相对表达量能预测巨大肝细胞癌远处转移风险以及患者术后的生 存或死亡。当癌组织Galectin-4的免疫组化评分低于0.1545时，巨大肝 细胞癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。显然Galectin-4蛋白与巨 大肝细胞癌具有相关性，因此，以Galectin-4蛋白作为蛋白质分子标记对 其表达量进行检测能预测巨大肝细胞癌手术后复发转移等事件，并判断预 后。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本 行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和 说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前 提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本 发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。