一种促进兰州百合组培鳞茎膨大发育的方法

摘要

本发明涉及一种促进兰州百合组培鳞茎膨大发育的方法，属于植物种苗繁育领域，具体来讲涉及一种促进兰州百合组织培养中诱导鳞茎发育的方法。本发明通过改善兰州百合组培快繁技术，即丛芽增殖、小鳞茎的诱导、小鳞茎的膨大、鳞茎的膨大与壮苗及完整植株的形成四个阶段促使其鳞茎膨大发育生长。操作过程与培养试管苗类似，培养完成后获得具有膨大鳞茎的完整植株，可作为生产用的繁殖原始材料直接移入大田种植，大幅度提高了繁殖系数，缩短了兰州百合的生长周期，有利于兰州百合的广泛种植和推广，具有良好的经济效益和社会效益。

说明书

技术领域

 本发明属于植物栽培领域，具体来讲是一种促进兰州百合组织培养中诱导鳞茎发育的方法。

背景技术

兰州百合属多年生草本植物，因其地下鳞茎由数十瓣鳞片相叠抱合，有百片合成之意而得名。兰州百合是全国四大百合品系之一，同时也是唯一味甜可食用的百合，作为食用百合，其风味甘美、无苦味，被称之为“甜百合”，其鳞片包合紧密，色泽洁白、肉质肥厚，有很高的食用、药疗和观赏价值。

兰州百合生长周期漫长，大田生产中，由鳞片萌发的小鳞茎生长至商品种球，需要六年时间。百合主要靠小鳞茎进行分株繁殖，一株百合每年只能得到1~3个小鳞茎，小鳞茎经自然发育成完整的植株，大概需要三年的时间，繁殖速度非常有限，并且容易造成鳞茎退化。

当前关于兰州百合组织培养技术报道其共同点如下：外植体多采用鳞片，主要培养阶段有增殖培养、鳞茎诱导培养、及生根培养；增殖培养中以基础培养基MS添加6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）、萘乙酸（NAA）生长调节剂为主，鳞茎诱导培养中以基础培养基MS添加6-BA、NAA、IBA、KT为主，并没有进行鳞茎的膨大培养；王丽艳等在《园林园艺》上的文章《兰州百合与川百合试管苗结鳞茎研究》，报道了通过配方为1/2MS+0.5mg/L IBA的培养基进行试管内结鳞茎培养可形成直径1cm的兰州百合鳞茎的方法。当前，研究兰州百合鳞茎膨大发育成为培育繁殖原始材料的研究热点，在应用组培鳞茎作为种球繁殖原始材料进行生产应用的方法，还未见报道。

专利CN03135142.5公开了一种兰州百合的快速繁殖方法，具体制备方法为：选取兰州百合鳞片、叶和根的切段，采用外植体消毒后，接入含不同植物激素的培养基，诱导产生芽，继代培养后移入生根培养基，当试管苗高约3-5厘米时移栽入种植练苗基质，鳞片不定芽的诱导和快殖培养基为MS、BA2mg/L、NAA0.2mg/L，根、叶诱导和繁殖培养基为MS、BA2mg/L、NAA0.4mg/L，试管苗生根培养基为1/2MS、NAA0.3mg/L，温度27±2℃，光照强度2000LX，光照时间12h/d，pH为5.8。该发明能使兰州百合鳞片繁殖发育成球茎为2~4mm的百合苗，但球茎较小，无法直接进入大田种植。

兰州百合组织培养体系中通常以初代诱导、继代培养、生根培养来获得组培苗，获得的组培苗可移栽到大田生长，难以发育成可生产用的繁殖原始材料，主要原因为组培苗不具备鳞茎或鳞茎太弱小，所以在兰州百合组培体系中，研究鳞茎的发育膨大成为了培育种球的主要热点。

发明内容

在上述背景下，本发明通过改善兰州百合组培快繁技术，促使其鳞茎膨大发育生长。操作过程与培养试管苗类似，培养完成后获得具有膨大鳞茎的完整植株，可作为生产用的繁殖原始材料直接移入大田种植，本发明缩短了兰州百合的生长周期，有利于兰州百合广泛种植和推广，具有良好的经济效益和社会效益。

本发明提供了一种促进兰州百合组培鳞茎膨大发育的方法，操作较为简单，对环境及设备要求低，具体实施方法如下：

1、获取兰州百合外植体：选择于10月中旬时挖取的兰州百合种球，剥去受伤的鳞片，选择外、中层干净的鳞片，用自来水冲洗后晾干备用。

2、消毒接种：将步骤1晾干的鳞片放到超净工作台上，使用75%乙醇浸泡20~30秒钟，再用0.1%的升汞溶液浸泡10~12分钟，然后用无菌水冲洗3次，将冲洗干净的鳞片置于超净工作台上晾干。

3、兰州百合组织培养诱导鳞茎膨大发育，采用四阶段培养的技术路线诱导鳞茎形成并发育膨大生长：

①第一阶段丛芽增殖：将步骤2晾干的鳞片接种到F1培养基进行培养，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000~4000Lux，光周期为9h Light/15h Dark，所述F1培养基包含MS培养基、0.2~0.4mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.04~0.06mg/L萘乙酸、20~40g/L蔗糖和4.5g/L琼脂，该阶段培养进行2次以上；

②第二阶段小鳞茎的诱导：将步骤3第①步骤所得的丛芽苗切割除去叶片，将余下的芽体转接到F2培养基，以培养基F2为鳞茎诱导发育培养基进行鳞茎的诱导形成及增殖，培养条件为：培养周期为30~40天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000~4000Lux，光周期为9h Light/15h Dark，所述F2培养基包含MS培养基、80~100g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

③第三阶段小鳞茎的膨大：将步骤3第②步骤所得的分化鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移植到F3培养基，以培养基F3为鳞茎膨大发育培养基进行小鳞茎的膨大生长，培养条件为：培养周期为30~40天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000~4000Lux，光周期为9h Light/15h Dark，所述F3培养基包含1.5倍MS培养基、0.12~0.18mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、0.12~0.18mg/L赤霉素、60~80g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

④第四阶段鳞茎的膨大与壮苗及完整植株的形成：将步骤3第③步骤所得的膨大鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移至到F4培养基，以培养基F4为鳞茎进一步膨大发育并生根壮苗的培养基，进行鳞茎的膨大生长及完整植株的形成，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000~4000Lux，光周期为9h Light/15h Dark，所述F4培养基包含MS、0.8~1.2mg/L多效唑、80~100g/L蔗糖和4.5g/L琼脂。

具体实施方式

实施例1

1、获取兰州百合外植体：选择于10月中旬时挖取的兰州百合种球，剥去受伤的鳞片，选择外、中层干净的鳞片，用自来水冲洗后晾干备用。

2、消毒接种：将步骤1晾干的鳞片放到超净工作台上，使用75%乙醇浸泡20秒钟，再用0.1%的升汞溶液浸泡10分钟，然后用无菌水冲洗3次，将冲洗干净的鳞片置于超净工作台上晾干。

3、将步骤2晾干的鳞片接种到由MS、0.3mg/ L 6-苄氨基嘌呤、0.05 mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F1培养基进行培养，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3000Lux，光周期为9h Light/15h Dark。

该阶段培养3次。

培育出的兰州百合球茎为2~4mm，无法直接置于大田种植。

实施例2

1、获取兰州百合外植体：选择于10月中旬时挖取的兰州百合种球，剥去受伤的鳞片，选择外、中层干净的鳞片，用自来水冲洗后晾干备用。

2、消毒接种：将步骤1晾干的鳞片放到超净工作台上，使用75%乙醇浸泡20秒钟，再用0.1%的升汞溶液浸泡10分钟，然后用无菌水冲洗3次，将冲洗干净的鳞片置于超净工作台上晾干。

3、兰州百合组织培养诱导鳞茎膨大发育，采用四阶段培养的技术路线诱导鳞茎形成并发育膨大生长：

①第一阶段丛芽增殖：将步骤2晾干的鳞片接种到由MS、 0.25mg/ L 6-苄氨基腺嘌呤、0.04 mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F1培养基进行培养，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000Lux，光周期为9h Light/15h Dark，该阶段培养2次；

②第二阶段小鳞茎的诱导：将步骤3第①步骤所得的丛芽苗切割除去叶片，将余下的芽体转接到由MS、80g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F2培养基，以培养基F2为鳞茎诱导发育培养基进行鳞茎的诱导形成及增殖，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000Lux，光周期为9h Light/15h Dark；

③第三阶段小鳞茎的膨大：将步骤3第②步骤所得的分化鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移植到由1.5倍MS、0.13mg/ L 6-苄氨基腺嘌呤、0.12 mg/L赤霉素、60g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F3培养基，以培养基F3为鳞茎膨大发育培养基进行小鳞茎的膨大生长，培养条件为：培养周期为35天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000Lux，光周期为9h Light/15h Dark；

④第四阶段鳞茎的膨大与壮苗及完整植株的形成：将步骤3第③步骤所得的膨大鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移至到由MS、0.9mg/L多效唑、85g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F4培养基，以培养基F4为鳞茎进一步膨大发育并生根壮苗的培养基，进行鳞茎的膨大生长及完整植株的形成，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为2000Lux，光周期为9h Light/15h Dark。

通过四阶段的培养后，获得的兰州百合鳞茎参数如下：

生根数量根长度cm围茎cm直径cm鳞茎重量g5.26±0.391.27±0.253.73±0.410.85±0.261.07±0.21

经过四阶段培养的兰州百合鳞茎可直接作为种球繁殖原始材料进行生产应用。

实施例3

1、获取兰州百合外植体：选择于10月中旬时挖取的兰州百合种球，剥去受伤的鳞片，选择外、中层干净的鳞片，用自来水冲洗后晾干备用。

2、消毒接种：将步骤1晾干的鳞片放到超净工作台上，使用75%乙醇浸泡20秒钟，再用0.1%的升汞溶液浸泡10分钟，然后用无菌水冲洗3次，将冲洗干净的鳞片置于超净工作台上晾干。

3、兰州百合组织培养诱导鳞茎膨大发育，采用四阶段培养的技术路线诱导鳞茎形成并发育膨大生长：

①第一阶段丛芽增殖：将步骤2晾干的鳞片接种到由MS、0.3mg/ L 6-苄氨基嘌呤、0.05 mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F1培养基进行培养，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3500Lux，光周期为9h Light/15h Dark该阶段培养进行3次；

②第二阶段小鳞茎的诱导：将步骤3第①步骤所得的丛芽苗切割除去叶片，将余下的芽体转接到由MS 、95g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F2培养基，以培养基F2为鳞茎诱导发育培养基进行鳞茎的诱导形成及增殖，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3500Lux，光周期为9h Light/15h Dark；

③第三阶段小鳞茎的膨大：将步骤3第②步骤所得的分化鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移植到由1.5倍MS、0.17mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.18mg/L赤霉素、80g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F3培养基，以培养基F3为鳞茎膨大发育培养基进行小鳞茎的膨大生长，培养条件为：培养周期为40天，培养温度为25℃，培养光照强度为3500Lux，光周期为9h Light/15h Dark；

④第四阶段鳞茎的膨大与壮苗及完整植株的形成：将步骤3第③步骤所得的膨大鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移至到由MS、1.1mg/L多效唑、95g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F4培养基，以培养基F4为鳞茎进一步膨大发育并生根壮苗的培养基，进行鳞茎的膨大生长及完整植株的形成，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3500Lux，光周期为9h Light/15h Dark。

通过四阶段的培养后，获得的兰州百合鳞茎参数如下：

生根数量根长度cm围茎cm直径cm鳞茎重量g6.03±0.541.76±0.254.07±0.331.05±0.191.28±0.27

经过四阶段培养的兰州百合鳞茎可直接作为种球繁殖原始材料进行生产应用。

实施例4

1、获取兰州百合外植体：选择于10月中旬时挖取的兰州百合种球，剥去受伤的鳞片，选择外、中层干净的鳞片，用自来水冲洗后晾干备用。

2、消毒接种：将步骤1晾干的鳞片放到超净工作台上，使用75%乙醇浸泡20秒钟，再用0.1%的升汞溶液浸泡10分钟，然后用无菌水冲洗3次，将冲洗干净的鳞片置于超净工作台上晾干。

3、兰州百合组织培养诱导鳞茎膨大发育，采用四阶段培养的技术路线诱导鳞茎形成并发育膨大生长：

①第一阶段丛芽增殖：将步骤2晾干的鳞片接种到由MS、0.3mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.05mg/L萘乙酸、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F1培养基进行培养，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3000Lux，光周期为9h Light/15h Dark，该阶段培养3次；

②第二阶段小鳞茎的诱导：将步骤3第①步骤所得的丛芽苗切割除去叶片，将余下的芽体转接到由MS、100g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F2培养基，以培养基F2为鳞茎诱导发育培养基进行鳞茎的诱导形成及增殖，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3000Lux，光周期为9h Light/15h Dark；

③第三阶段小鳞茎的膨大：将步骤3第②步骤所得的分化鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移植到由1.5倍MS、0.15mg/L 6-苄氨基嘌呤、0.15mg/L赤霉素、75g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F3培养基，以培养基F3为鳞茎膨大发育培养基进行小鳞茎的膨大生长，培养条件为：培养周期为40天，培养温度为25℃，培养光照强度为3000Lux，光周期为9h Light/15h Dark；

④第四阶段鳞茎的膨大与壮苗及完整植株的形成：将步骤3第③步骤所得的膨大鳞茎切割下来，并切除叶片，将其移至到由MS、1.0 mg/L多效唑、80g/L蔗糖和4.5g/L琼脂组成的F4培养基，以培养基F4为鳞茎进一步膨大发育并生根壮苗的培养基，进行鳞茎的膨大生长及完整植株的形成，培养条件为：培养周期为30天，培养温度为25℃，培养光照强度为3000Lux，光周期为9h Light/15h Dark。

通过四阶段的培养后，获得的兰州百合鳞茎参数如下：

生根数量根长度cm围茎cm直径cm鳞茎重量g5.92±0.471.63±0.214.27±0.471.33±0.221.43±0.32

经过四阶段培养的兰州百合鳞茎可直接作为种球繁殖原始材料进行生产应用。