一种抗HIV-1药物的筛选方法

摘要

本发明提供了一种抗HIV-1药物的筛选方法，将BST-2的氨基端连接生物发光共振能量转移供体蛋白，Vpu的羧基端连接生物发光共振能量转移受体蛋白，使BST-2和Vpu之间产生生物发光共振能量转移（BRET）信号，进而将两种融合蛋白共表达在细胞中，并建立稳定表达两种融合蛋白的细胞系，添加待检样品至此细胞中，检测细胞BRET信号的变化，若BRET值下降，则待检样品为抗HIV-1阳性药物。利用该方法能够方便、快速地筛选抗HIV-1的药物，为抗HIV-1药物的筛选提供了新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗HIV-1药物的筛选方 法。

背景技术

艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)为当前在全 球范围内流行的重大传染病之一，是由人免疫缺陷病毒(human  immunodeficiency virus,HIV)感染导致人体免疫机能缺陷,而易于发生 机会性感染和肿瘤的临床综合征。在过去的20多年里造成2000多 万人死亡，目前全世界艾滋病病毒感染者已达4000万左右，艾滋病 对人类健康，社会稳定造成严重威胁。在艾滋病疫苗尚未研制成功的 现阶段，药物治疗是艾滋病防治的主要手段。目前已经有4类24种 抗逆转录病毒药物应用于艾滋病的抗病毒治疗，包括11种核苷类逆 转录酶抑制剂(NRTI)，3种非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)，9种 蛋白酶抑制剂(PI)和1种融合抑制剂(FI)。但病毒的进化使得耐药性不 断产生，这就需要不断寻求针对新靶点的新型抗艾滋病病毒药物。

引起世界范围流行的艾滋病的病原体主要是人类免疫缺陷病毒1 （Human immunodeficiency virus type1,HIV-1），HIV-1的致病机理 及其与宿主因素的相互作用十分复杂。对抗病毒的宿主细胞因子 Tsg101、APOBEC3G等越来越受到关注。因此，了解病毒与宿主的 关系及其相互作用机制是寻找有效的抗病毒药物和治疗策略的新途 径。病毒在进化过程中需要不断的克服宿主细胞的限制作用才能得以 在宿主体内生存，其中HIV-1自身的辅助蛋白Vpu可克服宿主限制 因子BST-2（bone marrow stromal cell antigen2，又称CD317， HM1.24），从而促进病毒从宿主细胞的释放。

BST-2因最近发现能抑制HIV-1的释放而引起了科学界极大的关 注，它能将新生的病毒粒子粘附于病毒感染细胞表面又得名Tetherin。 BST-2是一种拓扑结构较为独特的膜蛋白，含有两个疏水区。该蛋白 质的氨基端位于胞质中，随后是一个约19个氨基酸的跨膜蛋白域 （TM）及胞外卷曲螺旋基序，其羧基端为约17个氨基酸的糖基磷脂 酰肌醇锚定点（GPI anchor）。位于细胞表面的BST-2，其GPI锚定 点位于病毒出芽部位-脂伐中，而跨膜区位于脂伐外，通过胞外的半 胱氨酸残基形成二聚体或多聚体的形式而将出芽的病毒和宿主细胞 连接，使病毒粒子束缚于细胞表面，从而抑制病毒的释放。

如前所述，BST-2的这种抑制病毒释放的作用可被HIV-1的辅助 蛋白Vpu拮抗。Vpu也为跨膜蛋白，具有两个主要的结构域：氨基 端的疏水跨膜域和羧基端的具有两个可磷酸化丝氨酸残基的胞质域。 Vpu可与BST-2共定位，两种蛋白通过各自的跨膜区产生相互作用， 进而通过胞质区的β-TrCP结合位点，将BST-2与细胞内的泛素化通 路相连，以内体-溶酶体途径或蛋白酶体途径降解BST-2，使其在细 胞表面的含量减少，从而促进HIV-1病毒粒子的释放。因此，可将 BST-2与Vpu跨膜区的相互作用作为新的药物靶标，破坏两者相互之 间的联系，抑制Vpu降解BST-2，从而恢复BST-2向细胞表面的运 输而达到病毒释放减少的目的。

BRET（Bioluninescence resonance energy transfer生物发光共振 能量转移）为一种在活细胞内实时监测两种蛋白质相互作用的方法。 此方法将两种目标蛋白各自与生物发光共振能量转移供体蛋白（如 Renilla的荧光素酶，Rluc）和受体蛋白(如EYFP)融合表达，当两种 目标蛋白产生相互作用时，距离会小于10nm，这时加入外源底物(如 Coelenterazine h)而使Rluc产生激发光，此激发光可由一对偶极子介 导向受体蛋白EYFP转移，从而激发EYFP产生发射光，通过仪器可 检测蛋白质发生作用前后的信号变化，是一种研究蛋白质之间相互作 用的良好方法。

目前国内关于艾滋病药物筛选的方法层出不穷，但方法不够简 便，或者作用机制不甚明确，因此，亟待推出新的简单高效，能够实 现高通量并且机制明确的药物筛选方法。

发明内容

针对上述不足，本发明提供一种抗HIV-1药物的筛选方法。

本发明提供的抗HIV-1药物的筛选方法，包括步骤：添加待检样 品至能稳定表达RB和VE的细胞系的细胞中，检测细胞BRET信号 的变化，若BRET信号下降，则待检样品为抗HIV-1阳性药物；所 述RB是将BST-2的氨基端与生物发光共振能量转移供体蛋白连接而 成的，所述VE是将Vpu的羧基端与生物发光共振能量转移受体蛋白 连接而成的，使BST-2和Vpu之间产生BRET信号。

其中，所述生物发光共振能量转移供体蛋白选自：海肾荧光素酶 Rluc。

其中，所述生物发光共振能量转移受体蛋白选自：增强型黄色荧 光蛋白EYFP。

其中，所述细胞系为293细胞系。

本发明提供了一种筛选稳定表达RB和VE的细胞系的方法，是 将双表达RB和VE的质粒转染细胞后，添加终浓度为1mg/ml的抗 生素G418，初筛10-14天，将细胞进行单克隆化操作，扩大培养后， 经观察和检测仪检测，两种蛋白表达均良好的细胞系确定为稳定表达 RB、VE的细胞系。

在本发明的实施例中，使用荧光显微镜观察和luciferase检测仪 进行检测。

其中，所述双表达RB和VE的质粒为pRB-VE，能在细胞内同 时表达RB和VE两种蛋白。

本发明还提供了上述方法筛选得到的稳定表达RB和VE的细胞 系。

本发明提供了一种用于筛选抗HIV-1药物的稳定表达RB和VE 的细胞系。

优选地，用于筛选抗HIV-1药物的稳定表达RB和VE的细胞系 为293细胞系。

本发明提供了一种真核双表达质粒，其为pRB-VE，其核苷酸序 列如SEQ ID NO.11所示。

本发明提供了一种构建上述真核双表达质粒的方法，包括以下步 骤：

1）质粒pRB构建：

a)以phBST-2为模板，以引物

F:AAATATGCGGCCGCCCATGGCTTCCAAGGTGTAC；

R:CTAGTCTAGATTACTGCTCGTTCTTCAG进行PCR扩增，得 到hBST-2片段；

b)以pRluc-N2为模板，以引物

F:CCCAAGCTTCCACCATGGCTTCCAAGGTGTAC，

R:CCGGAATTCCTGCTCGTTCTTCAGCAC进行PCR扩增，得 到Rluc片段；

c)将Rluc基因克隆到真核表达载体pcDNA^TM3.1/V5-His A中，酶 切位点为HindIII,EcoRI，然后在此载体中克隆进hBST-2基因，酶切 位点为NotI，XbaI，构建得到质粒pRB；

2）质粒pVE的构建：

a)以pVpu为模板，以引物

F:CTAGCTAGCCACCATGGTGCCCATTATTGT，

R:CCCAAGCTTCAGGTCGTCAATGTCCCA进行PCR扩增，得 到Vpu片段；

b)将Vpu基因克隆进载体pEYFP-N1中，酶切位点NheI，HindIII， 构建质粒pVE；

3)质粒pRB-VE的构建：

a)以质粒pRB为模板，以引物

F:CGCGGATCCCCACCATGGCTTCCaAGGTGTAC，

R:AGCTTTGTTTAAACTCACTGCAGCAGAGCGCT进行PCR 扩增得到RB片段，

b)以质粒pVE为模板，以引物

F:CGGGGTACCCCACCATGGTGCCCATTATTGTC，

R:CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTC进行PCR扩增得到 VE片段；

c)将RB,VE分别克隆进载体pYr-adshuttle-3中，RB克隆位点为 MCSI:BamHI,PmeI,VE克隆位点为MCSII:KpnI,HindIII，构建质粒 pRB-VE。

本发明提供了上述方法在筛选抗HIV-1药物中的应用。

本发明提供了真核表达质粒pRB和pVE或真核表达质粒 pRB-VE在筛选抗HIV-1药物中的应用。

本发明提供了293细胞系在筛选抗HIV-1药物中的应用。

本发明运用生物发光共振能量转移(Bioluminescence resonance  energy transfer1，BRET)技术，以人类宿主细胞因子BST-2和HIV-1 病毒辅助蛋白Vpu之间的相互作用为药物靶点，应用BRET方法， 针对双表达BST-2和Vpu的稳定表达细胞系，筛选出破坏两种蛋白 质相互作用的小分子化合物，建立了细胞水平的抗HIV-1药物筛选模 型。进而提供了一种筛选抗HIV-1药物的方法。在此方法中，将待测 化合物直接加入到此稳定表达蛋白的细胞中，观察BRET信号较对照 组（只加溶剂DMSO）是否降低，如若降低，说明两种蛋白间的相互 作用受到了化合物的抑制，可作为初筛阳性结果。本发明中的药物筛 选方法操作简单，避免了每次实验前转染细胞的繁琐程序，只需加药 -再培养-测定几个简单的步骤，有效地实现快速、高通量。利用该方 法能够方便、快速地筛选抗HIV-1药物，为HIV-1的治疗药物的筛选 提供了新途径。

附图说明

图1是质粒pRB的图谱。

图2是质粒pVE的图谱。

图3是质粒pRB-VE图谱。

图4是稳定表达细胞株中RB和VE蛋白表达western检测图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的 限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或 条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟 知的常规手段。

实施例1

1、构建表达载体

以phBST-2（购自NIH AIDS Reagent Program）为模板，以引物 F:AAATATGCGGCCGCCCATGGCTTCCAAGGTGTAC， R:CTAGTCTAGATTACTGCTCGTTCTTCAG扩增，得到hBST-2片 段。

以pRluc-N2（购自PerkinElmer公司）为模板，以引物 F:CCCAAGCTTCCACCATGGCTTCCAAGGTGTAC， R:CCGGAATTCCTGCTCGTTCTTCAGCAC扩增，得到Rluc片段，

以pVpu（购自NIH AIDS Reagent Program）为模板，以引物 F:CTAGCTAGCCACCATGGTGCCCATTATTGT， R:CCCAAGCTTCAGGTCGTCAATGTCCCA扩增，得到Vpu片段。

将Rluc基因（酶切位点为HindIII,EcoRI）克隆到真核表达载体 pcDNA^TM3.1/V5-His A(购自Invitrogen公司)中，继而在此载体中克 隆进人源的BST-2基因（酶切位点为NotI，XbaI），构建质粒pRB； 将HIV-1的辅助蛋白Vpu克隆进载体pEYFP-N1（购自Clontech公 司）中，酶切位点为NheI，HindIII，构建质粒pVE。

PCR反应体系：

补加去离子水至20μl。PCR参数：94℃预变性5min后，再以94℃ 变性30sec、54℃退火30sec、72℃延伸30sec的条件进行30次循环， 最后72℃延伸10min，4℃持续。

2、细胞培养

取293细胞进行培养，待细胞在T75培养瓶中长成致密单层，已 基本上饱和后，吸除培养瓶内旧培养液，5毫升PBS洗一遍，以去除 残余的血清，向瓶内加入0.25%胰蛋白酶3毫升，覆满瓶底，室温消 化90秒，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，吸除胰蛋白酶，向 瓶内注入完全培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml 链霉素的DMEM），轻轻反复吹打，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液， 并将细胞团打散成单细胞,部分用来传至新T75中继续于37℃、 5%CO₂培养箱中培养，部分用于铺六孔板（每孔3×10⁵个细胞）待转 染质粒。

3、细胞转染

铺细胞后16-20h，将细胞更换无血清无抗生素的新鲜的 1×DMEM，置37℃，5%CO₂培养箱培养1-2h。质粒pRB和pVE(或 单独pRB)各2μg混入300μl1×DMEM中，轻轻混匀成质粒混合液， 室温放置5min；取PEI2μl,加入300μl1×DMEM中，轻轻混匀成PEI 混合液，室温放置5min。将上述质粒混合液与PEI混合液轻轻混匀 成转染混合液，室温放置20-25min；将六孔板中培养液吸出，将上述 转染混合液轻轻加入，轻晃，置37℃，5%CO₂培养箱培养。4-6h后 吸出转染液，换成完全培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素， 100μg/ml链霉素的DMEM），继续培养24-48h。

4、生物发光共振能量转移（BRET）测定:

转染后的细胞PBS清洗一遍，以PBS吹散，调整细胞数为1×10⁶个/ml，分至底部和周围均不透光的96孔白板（Costar）中，毎孔90μl， 海肾荧光素酶底物Coelenterazine h(50μmol/L，Promega公司)10μl， （终浓度5μmol/L），立即上机（Pekin Elmer reader）测定475nm和 530nm两处发射光强度。

以公式530nm发射光强度/475nm发射光强度(同时表达RB和 VE)-530nm发射光强度/475nm发射光强度（只表达RB）计算BRET 比值。结果显示，转染的细胞中产生了较强的BRET信号，说明将单 独表达RB的质粒pRB和单独表达VE的质粒pVE共同转染宿主细 胞，能够实现同时表达RB和VE，并在RB和VE之间产生了生物发 光共振能量转移。

实施例2

1、构建双表达载体

以质粒pRB为模板， 以F:CGCGGATCCCCACCATGGCTTCCaAGGTGTAC， R:AGCTTTGTTTAAACTCACTGCAGCAGAGCGCT为引物扩增RB 片段，

以质粒pVE为模板，

以F:CGGGGTACCCCACCATGGTGCCCATTATTGTC,R: CCCAAGCTTTTACTTGTACAGCTCGTC为引物扩增VE片段，将 RB,VE分别克隆进载体pYr-adshuttle-3(购自湖南赢润生物公司)中， 克隆位点分别为RB(MCSI:BamHI,PmeI),VE(MCSII:KpnI,HindIII)， 构建质粒pRB-VE。

PCR反应体系：

补加去离子水至20μl。PCR参数：94℃预变性5min后，再以94℃ 变性30sec、54℃退火30sec、72℃延伸1min的条件进行30次循环， 最后72℃延伸10min，4℃持续。

2、细胞培养

取293细胞进行培养，待细胞在T75培养瓶中长成致密单层，已 基本上饱和后，吸除培养瓶内旧培养液，5毫升PBS洗一遍，以去除 残余的血清，向瓶内加入0.25%胰蛋白酶3毫升，覆满瓶底，室温消 化90秒，当发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，吸除胰蛋白酶，向 瓶内注入完全培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml 链霉素的DMEM），轻轻反复吹打，使之从瓶壁脱离形成细胞悬液， 并将细胞团打散成单细胞,部分用来传至新T75中继续于37℃、 5%CO₂培养箱中培养，部分用于铺六孔板（每孔3×10⁵个细胞）待转 染质粒。

3、细胞转染

铺细胞后16-20h，将细胞更换无血清无抗生素的新鲜的 1×DMEM，置37℃，5%CO₂培养箱培养1-2h。质粒pRB-VE(或pRB) 2μg，混入300μl1×DMEM中，轻轻混匀成质粒混合液，室温放置 5min；取PEI2μl,加入300μl1×DMEM中，轻轻混匀成PEI混合液， 室温放置5min。将上述质粒混合液与PEI混合液轻轻混匀成转染混 合液，室温放置20-25min；将六孔板中培养液吸出，将上述转染混合 液轻轻加入，轻晃，置37℃，5%CO₂培养箱培养。4-6h后吸出转染 液，换成完全培养基（含10%胎牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml 链霉素的DMEM），继续培养24-48h。

4、筛选稳定表达细胞系

将铺有293细胞的24孔板加入不同浓度的G418（购自Merke公 司），确定最佳筛选浓度为1mg/ml。将双表达质粒pRB-VE在六孔 板中转染293细胞，转染后24小时将细胞传至T75培养瓶中，加入 G418（浓度为1mg/ml）筛选稳定表达RB-VE的细胞系，初筛10-14 天左右，将细胞分至96孔板（每孔1-2个细胞）进行单克隆化操作， 将长成细胞团的孔在荧光显微镜下观察，若有荧光则继续扩大培养， 并通过luciferase检测仪检测RB的表达，并进一步通过Western  Blotting验证两种蛋白的表达情况（图4）。两种蛋白表达均良好的 确定为筛选成功的细胞系。

5、样品制备

化合物样品：DMSO稀释纯品化合物到2mmol/L，取1μl作用于 100μl细胞体系，使其终浓度为20μmol/L。

阳性对照短肽BST-2-TM样品：

干粉状态BST-2跨膜区模拟短肽（BST-2-TM）（购自中国医学 科学院医药生物技术研究所）以双蒸水溶解至500μmol/L，取10μl 加至100μl细胞体系，使其终浓度为50μmol/L。此短肽模拟BST-2 跨膜区结构合成，同BST-2一样，也可与Vpu的跨膜区相互作用， 从而与RB竞争和VE的作用，减少了RB到VE之间的能量转移， 从而降低BRET信号。

6、加药筛选与生物发光共振能量转移（BRET）测定

将步骤4中建系成功的细胞扩大培养后，调整细胞数为5×10⁵个 /ml，分至周围白色不透明，底部为平底透明的96孔细胞培养板 （Costar）中，毎孔100μl，同时将化合物样品加入到细胞液中，毎 孔1μl，使其终浓度为20μmol/L，阴性对照组加溶剂DMSO做对照， 阳性对照组加BST-2-TM做对照，置37℃，5%CO₂培养箱中继续培 养24小时。而后吸去96孔板中的培养基，每孔加入100μL PBS洗1 遍，再加入PBS90μl，海肾荧光素酶底物Coelenterazine h(50μmol/L， Promega公司)10μl，至终浓度为5μmol/L立即上机（Pekin Elmer  reader）测定475nm和530nm两处发射光强度。

以公式530nm发射光强度/475nm发射光强度(同时表达RB和 VE)-530nm发射光强度/475nm发射光强度（只表达RB）计算BRET 比值。

结果：阳性对照组BRET比值明显低于阴性溶剂对照组，表明 BST-2-TM明显抑制了BST-2和Vpu之间的相互作用。从组合化学库 中共筛选12000个样品，其中初筛阳性化合物27个，阳性率为 0.225%。经过本系统筛选出的初筛阳性结果BRET比值显示大大降 低，说明本发明提供的抗HIV-1药物的筛选方法具备可行性。