快速获得转基因小麦纯合植株的方法

摘要

本发明涉及一种转基因小麦的快速纯合方法，采用目的基因取代基础质粒pAHC25的gus基因,使目的基因与抗除草剂bar基因紧密连锁；将获得的重组质粒通过小麦基因枪转化方法导入小麦；对小麦转基因植株及其后代开花15天后的幼胚置于含1mg/LL-PPT除草剂的1/2MS培养基上连续培养和筛选，直至转基因植株抗除草剂bar基因纯合，后代不再分离；通过对抗除草剂bar基因纯合的转基因植株的目的基因PCR检测和验证而获得目的基因纯合的转基因植株。其优点在于：节省大量的人力和物力，缩短了转基因小麦纯合所需的时间。

说明书

技术领域

本发明涉及小麦生物技术育种领域，采用幼胚培养、除草剂筛选以及PCR检测相结合的方法快速获得转基因小麦纯合植株。

背景技术

    转基因技术自诞生以来,由于具有针对性强、可以打破物种间的生殖隔离、提高作物育种效率等优点，倍受育种工作者的关注。据已有的统计资料，1996年第一例转基因作物商业化种植以来，转基因作物为经济、环境和社会福利带来了持续可观的利益，2012年转基因作物的种植面积已由当初的１７０万公顷，扩展到１．7亿公顷，增长了100倍，使得转基因成为现代农业史上应用最为迅速的作物技术。种植转基因作物的国家数目由６个增加到30个，其中１９个为发展中国家；种植转基因作物的人数达到1730万；２０１2年转基因种子的全球市场价值为150亿美元，2011年转基因作物带来的经济效益为197亿美元；转基因技术为保障全球粮食安全和粮食自给、可持续性发展、减轻贫困和饥饿、帮助缓解气候变化和全球变暖带来的挑战作出重要贡献【Clive James.中国生物工程杂志, 2013, 33(2): 1-8】。

小麦目前是仅次于玉米的全球第二大重要粮食作物,2010年总产65.3亿吨。中国是全球最大的小麦生产国，2010年总产达到11.2亿吨。与其他国家一样，气候环境和病虫害是影响中国小麦生产稳定和可持续发展的重要因素。近些年来，常规育种在提高小麦产量和品质方面进展缓慢，转基因等生物技术手段为解决这些问题开辟新的途径。目前，尽管转基因小麦还没有在中国商业化，中国科研人员已经开展抗病、抗虫、耐除草剂、耐旱和改善品质的转基因小麦的研究，并取得较好的研究进展【Xia Lanqin, Ma Youzhi, He Yi, Huw D. Jones. Journal of Experimental Botany, 2011, doi:10.1093/jxb/err342】。

目前小麦的转基因方法仍以基因枪介导法为主，农杆菌介导等方法为辅。基因枪法导入的目的基因通常多拷贝居多，后代分离严重，需多代连续跟踪检测，才能获得纯合的转基因植株。纯合的转基因植株对于研究目的基因的功能和表达分析以及遗传的稳定性具有重要意义。由于小麦的基因组较大，PCR等检测较为困难，多代连续跟踪检测的工作量非常巨大，需投入大量的人力和物力。业内人员长期以来一直寻求一种能够提高培育效率，降低培育成本的方法，寻找快速获得纯合的转基因植株的途径。 

发明内容

本发明目的在于：针对以往转基因小麦纯合植株的获得需对转基因小麦后代进行目的基因的连续多代PCR检测，工作量巨大，且每年只能进行1代检测等一系列问题，提供一种快速获得转基因小麦纯合植株的方法。

本发明目的是这样实现的：一种快速获得转基因小麦纯合植株的方法，其特征在于：将含有目的基因的重组质粒导入小麦，通过对转基因小麦的幼胚培养、除草剂筛选以及PCR检测快速获得转基因小麦基因纯合植株，具体步骤是：

a、以pAHC25为基础质粒，将目的基因插入pAHC25的SmaI和SacI限制性内切酶切位点之间，以目的基因取代pAHC25的gus基因，使目的基因与pAHC25基础质粒中的抗除草剂bar基因紧密连锁；

b、将上步骤获得的重组质粒采用基因枪转化方法导入小麦并获得T₀代转基因小麦植株；

c、取T₀代转基因小麦植株开花15天后的幼胚，置于含1mg/L L-PPT除草剂的 1/2MS培养基上培养，弃去不抗除草剂的幼苗，待幼苗长至6cm左右移栽至盆钵，常规栽培管理至植株开花；

d、取开花15天后的幼胚，至少重复一次c步骤，直至后代幼苗不再死亡，该幼苗为抗除草剂bar基因纯合的转基因小麦植株；

  e、取d步骤获得的抗除草剂bar基因纯合的同源同代植株中的1株转基因小麦叶片DNA进行目的基因PCR检测是否含有目的基因，如含有目的基因，再对与该株同源同代的所有植株叶片DNA进行目的基因的PCR检测以验证目的基因是否纯合，如目的基因纯合，这些植株即为转基因小麦纯合植株。

本发明的优点在于：由于本发明前期采用含除草剂的培养基筛选，结合幼胚加代技术，最后只针对同源同代植株中的一株进行PCR检测，验证是否含有目标基因，再对与该株同源同代的所有植株进行目的基因的PCR检测验证，节省大量的人力和物力，同时幼胚加代技术也节省了目的基因纯合过程所需的时间。

具体实施方式

实施例1：转拟南芥NPR1基因小麦纯合植株的获得

材料：pAHC25基础质粒由中国农业科学院作物科学研究所徐惠君研究员提供，拟南芥NPR1基因由本项目组通过PCR方法克隆，限制性内切酶SmaI和SacI酶由TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司提供，除草剂L-PPT由Sigma公司提供。小麦扬麦12号由江苏里下河地区农科所小麦室提供。1/2MS培养基通过将标准MS培养基中的大量元素减半而获得。

采用PCR方法克隆拟南芥NPR1基因，并在基因的上下游分别添加限制性内切酶SmaI和SacI酶切位点；以pAHC25为基础质粒，采用限制性内切酶SmaI和SacI对pAHC25质粒（该质粒同时含有抗除草剂L-PPT的bar筛选基因以及gus报告基因）DNA进行酶切，切除gus基因，回收7.8Kb左右DNA酶切大片段，以T₄DNA连接酶与克隆的添加SmaI和SacI酶切位点的拟南芥NPR1基因连接，构建拟南芥NPR1基因与bar基因紧密连锁的小麦表达载体。

采用基因枪法（参照文献【麦类作物学报, 2008，28(6): 935-940】）将构建的拟南芥NPR1基因的表达载体导入小麦扬麦12号，获得转基因T₀代植株21株，待转基因植株开花结实后，剥取开花15后的幼胚，置于含1mg/L L-PPT除草剂的 1/2MS培养基上培养，转基因植株后代出现除草剂抗性分离，将抗除草剂的转基因植株后代移栽，结实后继续重复筛选，直至转基因植株后代除草剂抗性不再分离，此即为抗除草剂bar基因纯合植株，从T₁代开始来源于不同的T₀代转基因植株的后代中陆续有bar基因纯合转基因植株出现，直至T₆代，21个转基因T₀代植株的后代中均获得bar基因纯合转基因植株。

对获得的bar基因纯合转基因植株进行拟南芥NPR1的PCR检测（参照文献【分子植物育种，2012,10（6）：655-661】。

对以上获得的21个bar基因纯合转基因小麦株系各选1株叶片的DNA进行目的基因PCR检测，如含有目的基因，再对与该株同源同世代的所有植株进行目的基因的PCR检测，以验证目的基因是否纯合。

通过检测，两年内从21个bar基因纯合转基因株系中共筛选到15个拟南芥NPR1基因纯合的转基因株系。

实施例2

材料：基础质粒pAHC25、限制性内切酶SmaI和SacI酶、除草剂L-PPT和培养基均与实施例１相同。

TaPIMP1基因由中国农业科学院作物科学研究所张增艳研究员提供，小麦扬麦158和扬麦12号由江苏里下河地区农科所小麦室提供，Alondra为本项目组保存种质。

采用与实施例1相同的方法和步骤，将基础质粒pAHC25的gus报告基因用小麦TaPIMP1基因替换，构建小麦TaPIMP1基因过量表达载体，该基因与抗除草剂bar基因紧密连锁。

将该过量表达载体通过基因枪法导入小麦扬麦158、扬麦12号以及Alondra，采用与实施例1相同的纯合方法，至T₅代的两年内，获得23个bar基因纯合的转基因株系。

对获得的bar基因纯合转基因植株进行小麦TaPIMP1基因的PCR检测（参照文献【核农学报，2011，25（3）：0421-0426】），经检测，23个bar基因纯合转基因株系中有17个株系为TaPIMP1纯合转基因植系（表1）。

 

表1 转TaPIMP1基因小麦目的基因纯合情况

以上各实施例不是对本发明的限制，所述的目标基因不限于拟南芥NPR1基因和TaPIMP1基因，所述的小麦品种也不限于扬麦12号、扬麦158、扬麦12号和Alondra，只要本领域的技术人员在本发明的启示下，将目标基因转入小麦品种，都属于本发明的保护范畴。