一种用无血清培养基制备风疹减毒活疫苗的方法

摘要

本发明公开了一种用无血清培养基制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法，属于预防用生物制品领域。本发明在人二倍体细胞MRC-5复苏、扩增和感染病毒过程中使用无血清培养基，工艺过程及产品不添加抗生素，用一次性细胞工程瓶取代传统玻璃转瓶。本发明采用的是更为安全的风疹病毒RA27/3减毒株，该毒株在25-33代对人体失去致病力并且免疫性良好，使疫苗安全性大大增加。冻干剂使用了不含明胶的配方，从根本解决了明胶成分复杂而可能对人体有不确定致病性的缺点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用无血清培养基制备风疹减毒活疫苗的方法，特别是在人二倍体细胞MRC-5上接种风疹病毒RA27/3减毒株得到的风疹疫苗的制备方法。

背景技术

目前国内上市的疫苗均为有牛血清培养。众所周知，牛血清的生产过程很难避免疯牛病病毒、支原体以及牛易感的其他病原微生物的污染；利用疫苗生产工艺完全清除血清及其可能的污染是不可能的；因此国家食品药品监督管理局乃至WHO都在倡导疫苗生产过程中避免使用动物源性原材料。开发无血清疫苗生产工艺，符合国家政策要求，符合全球生物制品发展趋势，符合人民的健康安全要求。本发明细胞培养过程不使用含血清的培养液，避免了因添加血清而导致的污染。

本发明使用由美国WISTAR研究所授权使用的风疹减毒活疫苗生产用毒种RA27/3。该毒种由WISTAR研究所分离，并通过在WI-38细胞上连续传代减毒，在25-33代进行了临床试验，证明25-33代病毒对人体失去致病力，但免疫原性良好，可以刺激机体产生足够的抗风疹病毒感染的免疫，之后巴斯德研究所和美国Merck公司都用该毒种开发了减毒活疫苗。已经安全使用近数十年。

明胶是人用疫苗常用的一种保护剂和赋形剂，来源于动物，其生产过程无法完全控制所有病毒的污染，而且明胶与疫苗接种后过敏反应有关。WHO在多次疫苗生产相关指南上建议全球疫苗生产企业，尽可能采用明胶替代物作为疫苗的冻干赋形剂。本发明疫苗赋形剂中彻底摆脱了明胶，来源方便，质量可控。外观及溶解时间符合现行中国药典要求，稳定效果符合疫苗质量要求。

我国育龄女性的风疹阳性率高达80-95%，孕妇感染风疹可能引起婴儿先天性风疹综合征，包括白内障、耳聋、先天性心脏病、精神发育迟滞、肺炎、肝炎、血小板减少、糖尿病、甲状腺炎等。欧美等发达国家80年代即开始实施风疹疫苗免疫规划，婴幼儿、育龄妇女、成年妇女、新兵、医务工作者均进行强制免疫，因此，这些国家已经基本消灭了风疹。我国风疹免疫比较薄弱，全国生产厂家合计产能每年3000万剂，仅新生儿免疫每年就需要3200万，此外需免疫人群还有育龄妇女、新兵以及医务工作者，显然，产能还远不能满足我国的基本免疫需要。

发明内容

本发明提供一种用无血清培养基制备人二倍体细胞风疹减毒活疫苗的方法。

本发明采用细胞为人二倍体细胞MRC-5，即用该细胞接种风疹病毒RA27/3减毒株，收获病毒液，加入病毒保护剂和赋形剂后，分装冻干，制成疫苗。本发明的疫苗是冻干注射剂。

本发明所述的是一种风疹减毒活疫苗的制备方法，具体通过以下步骤实现：

（1）、MRC-5人二倍体细胞的复苏；

（2）、MRC-5的传代扩增；

（3）、在MRC-5细胞上接种风疹病毒RA27/3减毒株；

（4）、收获感染细胞培养上清液；

（5）、病毒液澄清过滤；

（6）、加入冻干保护剂；

（7）、分装冻干。

本发明的风疹减毒活疫苗的制备工艺中，培养细胞所用的培养基为无血清培养基，胰酶为非动物蛋白。如细胞和病毒培养所用的无血清培养基可以是MP-MRC-5 SFM，该培养基不含有动物来源的蛋白质和多肽，本发明同样适用其他无血清培养基。

经检定，细胞出现病变时，多次收获病毒液，经冻存、化冻、合并、检测滴度后，得到生产疫苗的风疹病毒液。本发明使用无血清培养基培养人胚肺二倍体细胞能够得到与有血清培养基培养同样的效果，而得到的风疹病毒滴度无显著差异（见表1），整个过程不使用抗生素。本发明所用无血清培养液为通用无血清培养液。

表1，风疹病毒有血清培养与无血清培养的滴度比较（logCCID₅₀/ml）

培养基种类第1次收获第2次收获第3次收获第4次收获有血清培养5.646.245.745.45无血清培养6.006.006.485.21

所述人二倍体细胞MRC-5来自英国生物标准品及质量控制研究所（National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC），首先建立三级细胞库：原始细胞库、主细胞库和工作细胞库，并对细胞库进行了全面的检定，细胞库获得中检所检验合格报告。

在细胞的传代扩增过程中使用的培养基中不含有动物来源的蛋白质和多肽，整个过程无需逐步降低血清含量进行适应驯化。消化细胞使用非动物蛋白来源的胰蛋白酶,消化完成后添加0.01％-0.1％的胰酶抑制剂，通过232g-334g离心去除胰酶抑制剂。细胞培养过程中，细胞传代分种率一般是1：2-1：4。当细胞生长至致密单层后，可接种风疹病毒RA27/3减毒株，此时pH维持在7.2左右，培养条件为5％-10％二氧化碳、37℃。

本发明建立病毒主种子批和工作库种子批，经细菌、霉菌、支原体检查以及外源因子检查合格后，用于疫苗制备。

病毒工作种子批的代次不超过29代。病毒接种人二倍体细胞，培养条件为5％-10％二氧化碳、37℃。细胞感染病毒后根据细胞病变发生的程度进行多次收获病毒液，一般在感染后2、4、6、8、10、12天收获。病毒收获后立即冻存在-20℃以下。如果细胞病变严重，可进行澄清过滤，然后冻存。收获的病毒液使用0.45/1.0微米的滤膜过滤澄清。经测定收获病毒液滴度不低于6.0 logCCID₅₀/ml，疫苗半成品滴度不低于4.8 logCCID₅₀/ml。细胞培养和接毒后培养液中不添加抗生素。

本发明采用的病毒滴定方法是传统的微量细胞病变法：将适宜稀释度的风疹病毒与RK-13细胞混种于96孔板培养，种毒后第10天观察孔内细胞病变情况，以Karber法计算疫苗滴度。

本发明采用的冻干工艺中，病毒液按一定比例添加甘露醇，右旋糖酐，谷氨酸钠，尿素，盐酸精氨酸，人血球白蛋白制成半成品，经冻干获得成品。冻干赋形剂配方适用一般的冻干工艺。冻干疫苗的水分含量在0.8％-1.5％之间。冻干疫苗置于37℃ 7天，滴度下降平均为0.3 logCCID₅₀/ml。无明胶的赋形剂配方依然保证了良好的外观状态和良好的滴度稳定性。

以上水分测定采用费休氏法，使用瑞士万通卡氏库仑仪测定，差重法计算样品用量后，将样品加到卡氏库仑仪中，待电解速率降至20ug/min且数值稳定后，读取数据，重复测量三次取平均值。

具体实施方式：

以下结合具体的实施例，对本发明做进一步的阐述。这些实施例仅用于对本发明做说明而不是对本发明的限制。

实施例1

二倍体细胞MRC-5来自工作种子库，1ml/支取1支，37℃水浴化冻，接种到T₂₅细胞培养瓶中，加入8mlMP-MRC-5 SFM无血清培养基（用前按说明补加1％L-Gln ,并37℃预热），培养基pH为7.2，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。该过程无需对细胞进行无血清培养的逐步驯化，细胞培养3天可以贴壁且致密单层，不添加抗生素。

实施例2

用不含动物蛋白的Cell Stripper ^TM非酶细胞裂解液消化实施例1中细胞，收集消化好的细胞悬液加入0.01％-0.2％浓度的胰酶抑制剂0.1ml-1ml， 232g-334g离心去除上清以除去胰酶抑制剂。将细胞重悬后，悬液按1:2比例分种扩增，培养3天可以达到生产要求的细胞数量，并且细胞状态良好。

实施例3

二倍体细胞MRC-5来自工作种子库，1ml/支取1支，37℃水浴化冻，接种到T₂₅细胞培养瓶中，加入8mlMP-MRC-5 SFM无血清培养基（用前补加1％L-Gln ,并37℃预热），培养基pH为7.2，置37℃、5％CO₂培养箱中培养。经培养至细胞贴壁且致密单层后，用不含动物蛋白的Cell Stripper ^TM非酶细胞裂解液消化细胞，收集消化好的细胞悬液加入0.01％-0.2％浓度的胰酶抑制剂0.1～1ml，再加入新鲜无血清培养基，232g-334g离心去除上清以除去胰酶抑制剂。重悬后，悬液按1:2比例分种扩增，培养3天达到生产要求的细胞数量及状态。当细胞长成致密单层，弃去细胞上清液，接种风疹病毒RA27/3减毒株，病毒代次为29代，接种后72h换新鲜无血清培养液，种毒后2、4、6、8、10、12天收获病毒液。收获的病毒液用0.45/1.0微米的滤膜过滤澄清。

实施例4

取实施例3中过滤后的病毒液，添加2％（W/W）甘露醇，3％（W/W）右旋糖酐，2％（W/W）谷氨酸钠，1％（W/W）尿素，0.2％（W/W）盐酸精氨酸，0.2％（W/W）人血球白蛋白等保护剂成分，制成冻干半成品，该半成品不含有明胶或明胶成分。分装至西林瓶中进行冻干，每西林瓶分装0.5ml，经以下程序进行冻干：

预冻： -45℃， 2h；

干燥温度：-45℃～30℃；

干燥过程：维持-45℃，0.02 Mpa 4h，然后每小时升高2℃。

按上述条件冻干三批，冻干后的疫苗，每支用0.5ml灭菌注射用水复溶，将适宜稀释度的风疹病毒与RK-13细胞混种于96孔板培养，种毒后第10天观察孔内细胞病变情况，以Karber法计算疫苗滴度，测定效价见表2。

表2，冻干前后半成品和成品效价比较（logCCID₅₀/ml）

冻干配方中不使用明胶，但成品外观状态及复溶性良好。水分测定采用费休氏法，使用瑞士万通卡氏库仑仪测定，差重法计算样品用量后，将样品加到卡氏库仑仪中，待电解速率降至20ug/min且数值稳定后，读取数据，重复测量三次取平均值，冻干疫苗的水分含量在0.8％-1.5％之间。冻干疫苗置于37℃ 7天，滴度下降平均为0.3 logCCID₅₀/ml。滴度符合2010版药典的要求。