法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-02-02
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C07K14/78 授权公告日:20160106 终止日期:20161220 申请日:20111220
专利权的终止
2016-01-06
授权
授权
2014-01-29
实质审查的生效 IPC(主分类):C07K14/78 申请日:20111220
实质审查的生效
2013-10-30
公开
公开
技术领域
本发明涉及结合白介素23 (IL-23)的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白质。本发明亦涉及创新蛋白质在治疗应用中用于治疗自身免疫疾病的用途。本发明还涉及包含所述蛋白质的细胞、编码所述蛋白质或其片段的多核苷酸，且涉及包含编码所述创新蛋白质的多核苷酸的载体。
引言
IL-23为IL-12异源二聚体细胞因子家族的成员。其含有与IL-12共有的p40亚基及独特的p19亚基。IL-23通过由IL-12Rβ1和IL-23R组成的异源二聚体受体复合物发送信号(Aggarwal, S. 等人, “Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17”, J. Biol. Chem., 278:1910-1914 (2003))。IL-23为用于治疗慢性炎性病症(例如多发性硬化、类风湿性关节炎、银屑病及克罗恩病)的潜在靶标。
基于纤连蛋白的支架(Fibronectin based scaffold)为能发展到结合任一所关注化合物的蛋白质家族。这些蛋白质通常利用衍生自纤连蛋白III型(Fn3)或Fn3-样结构域的支架，以天然或工程改造抗体(亦即，多克隆抗体、单克隆抗体或单链抗体)所特有的方式起作用，且另外具有结构优势。特别地，这些抗体模拟物的结构已经设计而具有最优选折叠、稳定性及溶解性，甚至在通常导致抗体结构及功能丧失的情况下亦如此。基于纤连蛋白的支架蛋白质的例子为Adnectin (Adnexus, Bristol-Myers Squibb R&D Company)。
纤连蛋白III型(Fn3)结构域自N-端至C-端按顺序包含β或β样链A；环AB；β或β样链B；环BC；β或β样链C；环CD；β或β样链D；环DE；β或β样链E；环EF；β或β样链F；环FG；及β或β样链G。环AB、BC、CD、DE、EF及FG中的任一个或全部均可参与靶标结合。BC、DE及FG环在结构与功能两方面皆与免疫球蛋白的互补决定区(CDR)类似。美国专利号7,115,396描述了Fn3结构域蛋白质，其中对BC、DE和FG环的改变会产生高亲和力的TNFα结合剂。共同未决的美国临时专利申请号61/305,566和61/330,706描述了Fn3结构域蛋白质，其中对BC、DE和FG环的改变会产生高亲和力的IL-23-特异性的p19亚基结合剂。两篇临时申请通过引用并入本文。
将有利的是，获得用于治疗性治疗自身免疫病症的经改进的纤连蛋白结构域支架蛋白质。产生白介素17(IL-17;“Th17细胞”)的效应T细胞子集具有高促炎性并诱导严重自身免疫。与Th1及Th2细胞相比，Th17细胞表达不同子集的细胞因子及趋化因子，包括IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)、IL-22、IL-17A和IL-17F以及趋化因子受体CCR6。IL-23通过活化T细胞来促进IL-17产生(Aggarwal, S. 等人, “Interleukin-23 promotes a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17”, J. Biol. Chem., 278:1910-1914 (2003))，且为诱导产生IL-17的CD4+ T细胞扩增的关键细胞因子。暴露于IL-23似乎为决定Th17细胞的致病性的关键特征。
发明内容
本申请提供了针对人IL-23的Adnectin。本发明的一个方面提供了包含Fn3结构域的多肽，其中一个或多个溶剂可及环(solvent accessible loop)已被随机化或突变。在一些实施方案中，Fn3结构域为衍生自人纤连蛋白III型结构域的野生型第10模块(module) (10Fn3)的Fn3结构域。在一些实施方案中，本发明的10Fn3多肽与人10Fn3结构域具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性。
在一些实施方案中，一个或多个选自BC、DE及FG的环的长度可相对于相应人纤连蛋白环延长或缩短。
在一些实施方案中，本发明多肽包含纤连蛋白III型第10 (10Fn3)结构域，其中该10Fn3结构域包含环AB；环BC；环CD；环DE；环EF；及环FG；且具有至少一个选自环BC、DE及FG的环且所述环的氨基酸序列相对于人10Fn3结构域中相应环的序列经改变。
在一些实施方案中，本发明多肽包含Fn3结构域，其包含与非环区具有至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自SEQ ID NO: 2-11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自SEQ ID NO: 12-22的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自SEQ ID NO: 23-25的氨基酸序列。
在一些实施方案中，10Fn3结构域可以以氨基酸置换、插入或缺失开始和/或结束。
在一些实施方案中，本发明蛋白质包含一个来自SEQ ID NO: 2-11中所示的BC环序列的环序列、一个SEQ ID NO: 12-22中所示的DE环序列及一个SEQ ID NO: 23-25中所示的FG环序列。
在一些实施方案中，本发明蛋白质包含与SEQ ID NO: 2-25中任一个具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的BC、DE及FG环氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 27-39中任一个的氨基酸序列。
在一些实施方案中，抗IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 27-39中任一个的3至96位的Fn3结构域氨基酸序列。
在一个方面，抗IL-23 Adnectin还包含药代动力学(PK)部分。在一些实施方案中，PK部分包含聚乙二醇(PEG)。
在一个方面，本申请提供了可用于治疗自身免疫疾病的抗IL-23 Adnectin。
附图说明
图1a-1b显示了本发明的抗-IL23 Adnectin的完整氨基酸序列。
图2a-2c显示了本发明的抗-IL23 Adnectin的完整核酸序列。
图3显示了Adnectin 1454B08与IL-23的结合。将Adnectin显示为卡通画，其中β-链为红色，非重复的二级结构为橙色，且多变环为洋红色。将IL-23显示为表面(灰色)。该视图强调，Adnectin 1454B08结合在p40和p19亚基之间的界面处，并且它与p40亚基上的结构域D2和D3相互作用。该图用PyMol (DeLano, 2002)产生。
图4显示了在与IL-23的接触中涉及的Adnectin 1454B08的残基。将Adnectin主链显示为卡通画，其中β-链为红色，非重复的二级结构为橙色，且多变环为洋红色。用洋红色碳原子、蓝色氮原子和红色氧原子显示在与多变环的接触中涉及的残基。在二级结构卡通画上用黑色碳原子和黑色区域显示与Adnectin的剩余部分的接触所涉及的残基。应当指出，来自N-端区域的残基、C-链、在多变环分子的对侧的CD环、E-链和F-链的残基与IL-23接触。该图用PyMol (DeLano, 2002)产生。
图5显示了叠加在10Fn3上的1454B08 (PDB 1FNF残基1416至1509)的卡通画简图的2个正交视图。颜色代码：1FNF (蓝色)，1454B08 (青色)。注意到核心β-链与AB和EF环(在C-端处，分子的右手侧)的优良重叠。在左侧是多变环：BC、DE和FG。DE环（它是非常短的）显示了在这些结构中的微小变异。BC环显示了中等的变异。相比而言，FG环显示了甚至在等长1454B08和10Fn3环之间的位置的引人注目的变异。10Fn3的N-端和1454B08的N-端明显不同。该图用PyMol (DeLano, 2002)产生。
具体实施方式
定义：
“多肽”是指，无论长度、翻译后修饰或功能，具有两个或更多个氨基酸的任何序列。“多肽”、“肽”与“蛋白质”在本文中可互换地使用。多肽可包括天然氨基酸及非天然氨基酸，例如描述于美国专利号6,559,126中的那些，该专利通过引用并入本文。多肽亦可以多种标准化学方式中的任一种来修饰(例如，氨基酸可用保护基团修饰；可使羧基末端氨基酸成为末端酰胺基；氨基末端残基可用基团修饰以例如增强亲油性；或多肽可经化学糖基化或以其它方式修饰以增加稳定性或体内半衰期)。多肽修饰可包括另一结构(例如环状化合物或其它分子)与多肽的连接且亦可包括含有一个或多个呈经改变构型(即，R或S；或L或D)的氨基酸的多肽。本发明肽为衍生自纤连蛋白III型第10结构域的蛋白质，其已被修饰以特异性结合IL-23，且在本文中称为“Adnectin”或“抗IL-23 Adnectin”。
术语“PK”为“药代动力学”的首字母简略词，且涵盖化合物的性质，包括、例如受试者的吸收、分布、代谢及消除。“PK调节蛋白质”或“PK部分”是指，当与生物活性分子融合或一起施用时，影响生物活性分子的药代动力学性质的任何蛋白质、肽或部分。PK调节蛋白质或PK部分的例子包括PEG、人血清白蛋白(HSA)结合剂(如美国公开号2005/0287153及2007/0003549中所公开的)、人血清白蛋白、Fc或Fc片段及糖(例如，唾液酸)。
本文中的“氨基酸序列同一性百分比(%)”定义为：在比对各序列及(若需要)引入缺口以达到最大序列同一性百分比后，候选序列中与所选序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比，且不将任何保守性置换视为序列同一性的一部分。出于测定氨基酸序列同一性百分比目的的比对可用本领域技术范围内的多种方式实现，例如，使用可公开获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign (DNASTAR?)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的合适参数，包括在所比较序列全长范围内达到最大比对所需要的任何算法。
“分离的”多肽为已鉴定并自其天然环境组分中分离和/或回收的多肽。其天然环境的污染组分为可干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，且可包括酶、激素及其它蛋白质性溶质或非蛋白质性溶质。在优选实施方案中，可将多肽纯化至(1)大于95%重量的多肽(如通过Lowry方法测定)，且最优选大于99%重量的多肽，(2)通过使用旋杯式序列分析仪足以至少获得N末端或内部氨基酸序列残基的程度，或(3)均质，通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE并使用考马斯蓝或优选银染进行。所分离多肽包括重组细胞内的原位多肽，这是因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，分离的多肽通常可通过至少一个纯化步骤来制备。
概述
本申请提供了针对人IL-23的Adnectin。为了鉴别IL-23特异性拮抗剂，使用抗p40 mAb将IL-23呈递至Adnectin大型合成文库。针对以下方面对结合至IL-23的Adnectin进行筛选：与人IL-23的结合、对IL-23/IL-23R相互作用的竞争及对IL-23诱导的T细胞系中的发信号的抑制。通过降低靶标浓度并选择具有缓慢解离速率的抗IL-23 Adnectin使抗IL-23 Adnectin经受进一步选择压力。根据此优化过程，将Adnectin家族确定为具有有利的生物化学及生物物理学性质的IL-23特异性抑制剂。
基于纤连蛋白的支架
本申请的一个方面提供了包含Fn3结构域的多肽，其中一个或多个溶剂可及环已被随机化或突变。在一些实施方案中，Fn3结构域为衍生自人纤连蛋白III型结构域的野生型第10模块(10Fn3)的Fn3结构域：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEQ ID NO: 1)。在以上10Fn3序列中，对BC、DE及FG环加下划线。
已报道多种突变型10Fn3支架。在一个方面，Asp 7、Glu 9及Asp 23中的一个或多个被另一氨基酸(例如不带负电荷的氨基酸残基例如Asn、Lys等)替代。已报道与野生型形式相比，这些突变在中性pH下具有促进突变型10Fn3的更大稳定性的作用(参见，PCT公开号WO 02/04523)。已公开了10Fn3支架中多种有益或中性的额外改变。参见，例如，Batori等人, Protein Eng., 15(12):1015-1020 (2002年12月); Koide等人, Biochemistry, 40(34):10326-10333 (2001年8月28日)。
变体与野生型10Fn3蛋白质二者的特征在于相同结构，即7个命名为A至G的β链结构域序列及6个连接该7个β链结构域序列的环区(AB环、BC环、CD环、DE环、EF环及FG环)。位于最靠近N-及C末端处的β链可采用溶液中的β样构象。在SEQ ID NO: 1中，AB环对应于残基15-16，BC环对应于残基21-30，CD环对应于残基39-45，DE环对应于残基51-56，EF环对应于残基60-66，且FG环对应于残基76-87 (Xu等人, Chemistry & Biology, 9:933-942 (2002))。
在一些实施方案中，10Fn3多肽可与SEQ ID NO: 1中所示的人10Fn3结构域具有至少40%、50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%或90%同一性。在一个或多个所述环中通常可出现许多变化。10Fn3多肽的每一β或β样链可基本上由这样的氨基酸序列组成：其与SEQ ID NO: 1的相应β或β样链的序列具有至少80%、85%、90%、95%或100%同一性，前提为此变化不会破坏生理条件下多肽的稳定性。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含纤连蛋白III型第10 (10Fn3)结构域的多肽，其中该10Fn3结构域包含环AB；环BC；环CD；环DE；环EF；及环FG；且具有至少一个选自环BC、DE及FG的环且所述环的氨基酸序列相对于人10Fn3结构域中相应环的序列经改变。在一些实施方案中，改变BC及FG环，在一些实施方案中，改变BC、DE及FG环，即，Fn3结构域包含非天然存在的环。“经改变”意指相对于模板序列(相应人纤连蛋白结构域)氨基酸序列中的一个或多个改变且包括氨基酸添加、缺失及置换。改变氨基酸序列通常可经由核酸编码序列的有意、盲目或自发序列变化来实现，且可通过任一技术(例如PCR、易错PCR或化学DNA合成)来进行。
在一些实施方案中，一个或多个选自BC、DE及FG的环的长度可相对于相应人纤连蛋白环延长或缩短。在一些实施方案中，所述环的长度可延长2-25个氨基酸。在一些实施方案中，所述环的长度可减少1-11个氨基酸。因此，为了优化抗原结合，可在长度上以及序列上改变10Fn3环的长度，以获得最大可能的抗原结合灵活性及亲和力。
在一些实施方案中，多肽包含Fn3结构域，其包含与SEQ ID NO: 1的非环区具有至少80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列，其中至少一个选自BC、DE及FG的环经改变。在一些实施方案中，经改变BC环具有至多10个氨基酸置换、至多4个氨基酸缺失、至多10个氨基酸插入或其组合。在一些实施方案中，经改变DE环具有至多6个氨基酸置换、至多4个氨基酸缺失、至多13个氨基酸插入或其组合。在一些实施方案中，FG环具有至多12个氨基酸置换、至多11个氨基酸缺失、至多25个氨基酸插入或其组合。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的BC环包含选自以下的氨基酸序列：DHDYPYR (SEQ ID NO: 2)、DMYYPYS (SEQ ID NO: 3)、YHDYPYR (SEQ ID NO:4)、YMHYPYS(SEQ ID NO:5)、YHMYSYR (SEQ ID NO:6)、EHDYPYR (SEQ ID NO:7)、MHDYPYR (SEQ ID NO:8)、DHNYSYR (SEQ ID NO:9)、NHNYSYY (SEQ ID NO:10)和DHNYTWY (SEQ ID NO:11)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的DE环包含选自以下的氨基酸序列：RNIN (SEQ ID NO:12)、KEYD (SEQ ID NO:13)、KDEE (SEQ ID NO:14)、KQHD (SEQ ID NO:15)、RDVD (SEQ ID NO:16)、KDVD(SEQ ID NO:17)、MEED (SEQ ID NO:18)、RHTD (SEQ ID NO:19)、REDS (SEQ ID NO:20)、RGVA (SEQ ID NO:21)和RGVD (SEQ ID NO:22)。
在一些实施方案中，本发明蛋白质的FG环包含选自以下的氨基酸序列：SSYKYDMQYS (SEQ ID NO:23)、SSYKYDIQYP (SEQ ID NO:24) 和STLKYDIQYS (SEQ ID NO:25)。
结构域可始于氨基酸变化。例如，额外MG序列可位于Fn3结构域的N末端处。通常M将被切割掉，在N末端处留下G。在一些实施方案中，序列可位于10Fn3结构域的C末端处。例如，在定点聚乙二醇化中，其中将含有半胱氨酸的接头诸如GSGC (SEQ ID NO: 26)添加至C末端。
在一些实施方案中，本发明蛋白质包含一个来自SEQ ID NO: 2-11中所示的BC环序列的环序列、一个SEQ ID NO: 12-22中所示的DE环序列及一个SEQ ID NO: 23-25中所示的FG环序列。在一些实施方案中，本发明蛋白质包含与SEQ ID NO: 2-25中任一个具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的BC、DE及FG环氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗-IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO:27-39中的任一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗-IL-23 Adnectin包含来自SEQ ID NO:27-39中的任一个的3-96位的Fn3结构域氨基酸序列。在一些实施方案中，所述抗-IL-23 Adnectin包含与SEQ ID NO:27-39中的任一个具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗-IL-23 Adnectin包含SEQ ID NO: 40-52中的任一个的核酸序列。在一些实施方案中，所述抗-IL-23 Adnectin包含与SEQ ID NO: 40-52中的任一个具有至少70、75、80、85、90、95、98、99或100%同一性的核酸序列。
纤连蛋白经由其整联蛋白结合基序“精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸”(RGD)天然地结合某些类型的整联蛋白。在一些实施方案中，多肽包含缺乏(RGD)整联蛋白结合基序的10Fn3结构域。
药代动力学部分
在一个方面，本申请提供了还包含药代动力学(PK)部分的抗IL-23 Adnectin。经改进药代动力学可根据感知性治疗需要来评估。通常期望通过增加蛋白质在施用后在血清中保持可用的时间来增加生物利用度和/或延长给药之间的时间。在一些情况下，期望提高蛋白质血清浓度随时间的连续性(例如，减小蛋白质血清浓度在施用后不久与下一次施用前不久的差异)。抗IL-23 Adnectin可连接至这样的部分，其相对于未经修饰Adnectin将该多肽在哺乳动物(例如，小鼠、大鼠或人)中的清除率降低3倍以上。经改进药代动力学的其它测量可包括血清半衰期，其通常分为α阶段及β阶段。此两个阶段中的一个或两个可通过添加合适部分来显著改进。
倾向于延缓蛋白质自血液清除的部分(本文中称为“PK部分”)包括聚氧化烯部分例如聚乙二醇、糖(例如唾液酸)及良好耐受的蛋白质部分(例如，Fc、Fc片段、转铁蛋白或血清白蛋白)。Adnectin可融合至白蛋白或白蛋白的片段(部分)或变体，如美国公开号2007/0048282中所述。
在一些实施方案中，PK部分为血清白蛋白结合蛋白，例如描述于美国公开号2007/0178082及2007/0269422中描述的那些。
在一些实施方案中，PK部分为血清免疫球蛋白结合蛋白，例如描述于美国公开号2007/0178082中描述的那些。
在一些实施方案中，Adnectin包含聚乙二醇(PEG)。一个或多个PEG分子可连接于蛋白质上的不同位置，且此连接可通过与胺、硫醇或其它适宜反应基团反应来实现。胺部分可为例如在多肽N末端存在的伯胺或存在于诸如赖氨酸或精氨酸等氨基酸中的胺基团。在一些实施方案中，PEG部分连接于多肽上的位置，该位置选自：a)N末端；b)介于N末端与最N末端β链或β样链之间；c)位于与靶标结合位点相对的多肽面上的环；d)介于C末端与最C末端β链或β样链之间；及e)在C末端处。
聚乙二醇化可通过定点聚乙二醇化来实现，其中将适宜反应基团引入蛋白质中以产生其中聚乙二醇化优先发生的位点。在一些实施方案中，对蛋白质进行修饰以在期望位置处引入半胱氨酸残基，从而允许对半胱氨酸进行定点聚乙二醇化。PEG的分子量可大幅度变化且可具支链或为直链。
在一些实施方案中，Adnectin包含Fn3结构域及PK部分。在一些实施方案中，Fn3结构域为10Fn3结构域。在一些实施方案中，相对于仅Fn3结构域，PK部分使多肽的血清半衰期延长超过5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、200、400、600、800、1000%或更多。
在一些实施方案中，PK部分为聚合糖。在一些实施方案中，PK部分为聚乙二醇部分。在一些实施方案中，PK部分为血清白蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，PK部分为人血清白蛋白。在一些实施方案中，PK部分为血清免疫球蛋白结合蛋白。在一些实施方案中，PK部分为转铁蛋白。在一些实施方案中，PK部分为对血清蛋白质具有特异性的另一Adnectin。
生物物理学及生物化学表征
本申请提供了包含结合至IL-23的Fn3结构域的Adnectin。如实施例2中所示，可在平衡常数(例如解离常数，KD)方面及在动力学常数(例如，结合速率常数Kon及解离速率常数koff)方面评估多肽与靶分子的结合。Adnectin通常将以小于500 nM、100 nM、10 nM、1 nM、500 pM、200 pM、100 pM的KD结合至靶分子，但可耐受更高KD值，其中Koff足够低或Kon足够高。
本发明的抗IL-23 Adnectin家族的BC、DE及FG环序列以及相应全长SEQ ID NO呈现于下表1中。
核酸-蛋白质融合技术
在一个方面，本申请提供了包含结合IL-23的纤连蛋白III型结构域的Adnectin。一种快速制作并测试具有特异性结合性质的Fn3结构域的方法为Adnexus, Bristol-Myers Squibb R&D公司的核酸-蛋白质融合技术。本公开内容利用称为PROfusion的体外表达及标签技术，其采用核酸-蛋白质融合(RNA-及DNA-蛋白质融合)来鉴别对于与蛋白质结合重要的新颖多肽及氨基酸基序。核酸-蛋白质融合技术为使蛋白质共价偶合至其编码遗传信息的技术。关于RNA-蛋白质融合技术及基于纤连蛋白的支架蛋白质文库筛选方法的详细说明，参见Szostak等人，美国专利号6,258,558、6,261,804、6,214,553、6,281,344、6,207,446、6,518,018、6,818,418；和Roberts等人, Proc Natl. Acad. Sci., 94:12297-12302 (1997), 通过引用并入本文。
载体及多核苷酸实施方案
可化学合成编码本文所公开各种蛋白质或多肽中任一种的核酸。可选择密码子使用以改进在细胞中的表达。所述密码子使用将取决于所选细胞类型。已针对大肠杆菌(E. coli)及其它细菌、以及哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞及昆虫细胞研发专门的密码子使用模式。参见例如: Mayfield等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100(2):438-442 (2003年1月21日); Sinclair等人, Protein Expr. Purif., 26(I):96-105 (2002年10月); Connell, N.D., Curr. Opin. Biotechnol., 12(5):446-449 (2001年10月); Makrides等人, Microbiol. Rev., 60(3):512-538 (1996年9月)；和Sharp等人, Yeast, 7(7):657-678 (1991年10月)。
核酸操纵的一般技术描述于例如以下文献中：Sambrook等人, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版，第1至3卷, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) 或Ausubel, F. 等人, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing and Wiley-Interscience, New York (1987))及周期性更新，其通过引用并入本文。通常，编码多肽的DNA可操作地连接至衍生自哺乳动物、病毒或昆虫基因的适宜转录或翻译调节元件。所述调节元件包括转录启动子、控制转录的可选操纵基因序列、编码适宜mRNA核糖体结合位点的序列及控制转录及翻译终止的序列。另外纳入在宿主中复制的能力(其一般通过复制起点赋予)及选择基因(以帮助识别转化体)。
本文所述蛋白质不仅可以直接地重组产生，且亦可作为与异源多肽的融合多肽重组产生，该异源多肽优选为信号序列或在成熟蛋白质或多肽的N末端具有特异性切割位点的其它多肽。所选异源信号序列优选为由宿主细胞识别及处理(即通过信号肽酶切割)的异源信号序列。
对于不能识别及处理天然信号序列的原核宿主细胞而言，可用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp、或热稳定肠毒素II前导序列的原核信号序列取代该信号序列。
对于酵母分泌而言，天然信号序列可被以下取代：例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括酵母菌属(Saccharomyces)及克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的α-因子前导序列)、或酸性磷酸酶前导序列、白色念珠菌(C. albicans)葡糖淀粉酶前导序列、或美国专利号5,631,144中所述信号。在哺乳动物细胞表达中，可使用哺乳动物信号序列以及病毒分泌性前导序列，例如单纯疱疹gD信号。此前体区的DNA可与编码蛋白质的DNA符合读框地连接。
表达及克隆载体二者皆含有使载体在一个或多个所选宿主细胞内复制的核酸序列。一般而言，在克隆载体中此序列为使载体独立于宿主染色体DNA复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。对于各种细菌、酵母及病毒而言，所述序列为众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适用于大多数革兰氏(Gram)阴性细菌，2微米质粒起点适用于酵母，且各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点组分(通常可使用SV40起点，仅由于其含有早期启动子)。
表达及克隆载体可含有选择基因，其亦称为可选标记物。典型选择基因编码具有以下性质的蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素(例如，氨苄西林(ampicillin)、新霉素、氨甲喋呤或四环素)的抗性，(b)补充营养缺陷型缺乏，或(c)供给不可自复合培养基中获得的关键营养物，例如编码杆菌(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。
表达及克隆载体通常含有被宿主生物识别且与编码本发明蛋白质(例如，基于纤连蛋白的支架蛋白质)的核酸可操作地连接的启动子。适合与原核宿主一起使用的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶及乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、及杂合启动子(例如tan启动子)。然而，其它已知细菌启动子亦适合。用于细菌系统的启动子亦可含有与编码本发明蛋白质的DNA可操作地连接的夏因-达尔加诺(S.D.)序列。已知真核生物的启动子序列。事实上，所有真核基因皆具有富含AT的区，其位于转录起始位点上游约25-30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处存在的另一序列为CNCAAT区，其中N可为任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端处为AATAAA序列，其可能为向编码序列3'端添加聚腺苷酸尾巴的信号。所有这些序列皆适当地插入真核表达载体中。
与酵母宿主一起使用的适宜启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶(例如，烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、及葡糖激酶)的启动子。
在哺乳动物宿主细胞中自载体转录可受例如以下启动子控制：自病毒(例如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(例如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒及最优选猿猴病毒40 (SV40))基因组获得的启动子、自异源哺乳动物启动子(例如，肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)获得的启动子、自热激启动子获得的启动子，前提为所述启动子皆与宿主细胞系统相容。
高等真核生物对编码本发明蛋白质的DNA的转录通常可通过将增强子序列插入载体中来增强。当前已知许多增强子序列来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、α-甲胎蛋白及胰岛素)。然而，通常可使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点迟侧(late side)上的SV40增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、位于复制起点迟侧上的多瘤病增强子及腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件亦可参见Yaniv，Nature 297：17-18(1982)。增强子可在肽编码序列的5'或3'位置(但优选位于启动子的5'位点)剪接至载体中。
用于真核宿主细胞(例如酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人细胞或来自其它多细胞生物的有核细胞)中的表达载体亦可含有终止转录及稳定mRNA所需的序列。所述序列通常可自真核或病毒DNA或cDNA的5'及(有时)3'未翻译区获得。这些区含有在编码本发明蛋白质的mRNA的未翻译部分中转录为多腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用转录终止组分为牛生长激素多腺苷酸化区。参见WO 94/11026及本文所公开的表达载体。
重组DNA亦可包括可用于纯化蛋白质的任一类型的蛋白质标签序列。蛋白质标签的例子包括、但不限于组氨酸标签、FLAG标签、myc标签、HA标签或GST标签。与细菌、真菌、酵母及哺乳动物细胞宿主一起使用的合适克隆及表达载体可参见Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York (1985)，其相关公开内容特此通过引用并入。
使用适于宿主细胞的方法将表达构建体引入宿主细胞中，如本领域技术人员所明了的。用于将核酸引入至宿主细胞中的多种方法为本领域已知，其包括、但不限于电穿孔；采用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其它物质的转染；微粒轰击；脂转染；及感染(其中载体为感染剂)。
适宜宿主细胞包括原核生物、酵母、哺乳动物细胞或细菌细胞。适宜细菌包括革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如大肠杆菌或芽孢杆菌(Bacillus spp.)。优选地，亦可使用来自酵母菌属的酵母(例如酿酒酵母(S. cerevisiae)来产生多肽。亦可采用各种哺乳动物或昆虫细胞培养系统来表达重组蛋白质。用于在昆虫细胞中产生异源蛋白质的杆状病毒系统由Luckow等人综述(Biotechnology, 6:47 (1988))。适宜哺乳动物宿主细胞系的例子包括内皮细胞、CO8-7猴肾细胞、CV-1、L细胞、C127、3T3、中国仓鼠卵巢(CHO)、人胚胎肾细胞、HeLa、293、293T及BHK细胞系。通过培养适宜宿主/载体系统以表达重组蛋白质来制备经纯化多肽。对于许多应用而言，本文所公开的许多多肽的小尺寸将使在大肠杆菌中的表达为优选表达方法。随后自培养基或细胞提取物纯化蛋白质。
蛋白质产生
宿主细胞用本文所述用于蛋白质产生的表达或克隆载体转化，且在经改进适于诱导启动子、选择转化体、或扩增编码期望序列的基因的常规营养培养基中进行培养。在此处所展示的例子中，用于高通量蛋白质产生(HTPP)及中等规模产生的宿主细胞是BL21(DE3) plysS细菌菌株。诸如温度、pH等培养条件为先前用于所选表达用宿主细胞的条件，且对本领域普通技术人员为清楚明了的。
本文所公开蛋白质亦可使用细胞翻译系统产生。出于所述目的，必须对编码多肽的核酸进行修饰以允许进行体外转录以产生mRNA并允许mRNA在所用特定无细胞的系统(无真核(例如哺乳动物或酵母)细胞的翻译系统或无原核(例如细菌)细胞的翻译系统)中进行无细胞翻译。
本发明蛋白质亦可通过化学合成(例如，通过描述于Solid Phase Peptide Synthesis, 第2版, The Pierce Chemical Co, Rockford, IL (1984)中的方法)产生。蛋白质的修饰亦可通过化学合成产生。
本发明蛋白质可通过蛋白质化学领域中通常已知的用于蛋白质的分离/纯化方法来纯化。非限制性例子包括萃取、再结晶、盐析(例如，利用硫酸铵或硫酸钠)、离心、透析、超滤、吸附色谱、离子交换色谱、疏水色谱、正相色谱、反相色谱、凝胶过滤、凝胶渗透色谱、亲和色谱、电泳、反流分布或这些方法的任何组合。在纯化后，多肽可更换至不同缓冲液中和/或通过本领域已知多种方法中的任一种(包括、但不限于过滤及透析)来浓缩。
经纯化多肽优选至少85%纯、或优选至少95%纯且最优选至少99%纯。无论纯度的确切数值为多少，多肽均足够纯地用作医药产品。
体内治疗用途
在一个方面，本申请提供了抗IL-23 Adnectin，其可用于治疗自身免疫疾病，例如狼疮(例如，红斑狼疮、狼疮性肾炎)、桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis)、原发性粘液水肿、格雷夫斯病(Graves' disease)、恶性贫血、自身免疫性萎缩性胃炎、阿狄森病(Addison's disease)、糖尿病(例如胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病)、肺出血-肾炎综合征(Goodpasture's syndrome)、重症肌无力、天疱疮、克罗恩病、交感性眼炎、自身免疫性葡萄膜炎、多发性硬化、自身免疫性溶血性贫血、特发性血小板减少症、原发性胆汁性肝硬化、慢性作用肝炎(chronic action hepatitis)、溃疡性结肠炎、舍格伦综合征(Sj?gren's syndrome)、风湿性疾病(例如，类风湿性关节炎)、多肌炎、硬皮病及混合性结缔组织病。本申请亦提供了对受试者施用抗IL-23 Adnectin的方法。在某些实施方案中，受试者为人。在一些实施方案中，抗IL-23 Adnectin对于哺乳动物、尤其人是药学上可接受的。“药学上可接受的”多肽是指施用动物而无显著不良医疗后果(例如基本上不含内毒素或具有极低内毒素水平)的多肽。
制剂及给药
本申请进一步提供了包含本文所述抗IL-23 Adnectin的药学上可接受的组合物，其中该组合物基本上不含内毒素。通过将具有期望纯度的所述Adnectin与可选生理上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(Osol, A.编辑，Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，(1980))混合来制备包含抗IL-23 Adnectin的治疗制剂以用于储存，所述制剂呈水溶液、冻干或其它干燥制剂的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所用剂量及浓度下对接受者无毒性，且包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸及甲硫氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲双铵(hexamethoninm chloride)；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯基吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖、及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；鳌合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；形成盐的反离子，例如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如吐温、PLURONICS?或聚乙二醇(PEG)。
本发明制剂亦可视需要含有一种以上用于所治疗特定适应症的活性化合物，优选为相互间不产生不利影响的具有互补活性的那些。所述分子适宜以对预期目的有效的量组合地存在。
用于体内施用的制剂必须无菌。这可通过经由无菌过滤膜过滤来容易地实现。
本领域技术人员应了解，各治疗剂的剂量将视药剂特性而定。
对于治疗应用而言，抗IL-23 Adnectin以药学上可接受的剂型施用于受试者。其可作为推注经静脉内施用或在一段时间内通过连续输注来施用，或通过皮下途径施用。药学上可接受的适宜载体、稀释剂及赋形剂是熟知的且可通过本领域技术人员合理地根据临床情况来来确定。适宜载体、稀释剂和/或赋形剂的例子包括：(1)Dulbecco磷酸盐缓冲盐水、(2) 0.9%盐水(0.9% w/v NaCl)及(3) 5% (w/v)右旋糖。
本发明方法可在体外、体内或离体实施。
可如上文针对治疗应用所述，以共同施用或序贯施用方式来施用抗IL-23 Adnectin与一种或多种额外治疗剂。本领域技术人员应了解，用于共同施用的药学上可接受的适宜载体、稀释剂及赋形剂将视所施用特定治疗剂的特性而定。
当蛋白质以水性剂型而非冻干剂型存在时，其通常将以约0.1 mg/ml至100 mg/ml的浓度来配制，但允许使用这些范围外的宽变化。对于治疗疾病而言，抗IL-23 Adnectin的合适剂量将取决于：待治疗疾病类型、疾病严重程度及病程、施用Adnectin的目的是预防性还是治疗性、先前疗程、患者临床史及对Adnectin的反应，以及主治医师的决定。蛋白质经一次或经系列治疗适宜地施用于患者。
抗-IL-23 Adnectin/IL-23蛋白复合物的结构
结合IL-23的Adnectin的结构分析会揭示对该Adnectin和它的靶标之间的分子相互作用的多个观察。鉴于靶标结合是由从野生型序列突变而来的一组Adnectin环残基介导，不会奇怪，观察到这些残基中的许多会接触靶标。更有趣的是，注意到，没有发现在BC、DE和FG环中的所有在文库中是多变并被选择为非野生型残基的残基都在Adnectin/靶标界面处或附近。相反，在多变环(BC、DE、FG)外面的几个野生型残基会与靶蛋白相互作用。将结合靶标的Adnectin的主链构象与野生型10Fn3进行对比，观察到在3个多变环中的每一个处相对于野生型的差异，并且N-端可能发生构象变化以结合靶蛋白的表面。
如在实施例3中所述，发现来自Adnectin的下述残基会接触IL-23：N-端区域：Pro5，Arg 6，Asp 7，BC-环：Glu 23，His 24，Asp 25，Tyr 26，Pro 27，Tyr 28，Arg 30，C-链：Tyr 31；CD-环：Gly 40，Asn 42，Val 45；F-链：Tyr 73，Val 75；FG-环：Thr 76，Ser 77，Ser 78，Tyr 79，Lys 80，Tyr 81，Asp 82，Met 83，Gln 84，Tyr 85，Ser 86，Pro 87。注意这些接触残基包括大量非多变的残基。
具体地，Tyr 26、Tyr 28、Asp 82和Tyr 85在该组adnectin中是完全保守的，表明这些氨基酸是关键的，并且用其它19种天然氨基酸中的任一种置换这些氨基酸可能会显著地减少或消除与IL-23的结合。共有序列包括：BC环中的Tyr 26和Tyr 28，以及FG环的Ser 77、Lys 80、Tyr 81、Asp 82、Gln 84和Tyr 85。这些氨基酸的组合可能在1454B08与IL-23的高亲和力结合中起重要作用，尽管具有在这些位置中的1个或2个突变的克隆可能保持一些结合。
应当指出，在Adnectin中的N-端是柔性的。在10Fn3中，该位置取决于与9Fn3的连接。在实施例3中描述的晶体结构表明，1454B08的N-端相对于10Fn3 N-端折叠离开可能是为了避免与IL-23的碰撞，并且在A链前面的N-端区域中的Pro5、Arg6、Asp7会与靶标接触。
通过在实施例3中描述的能量学计算和丙氨酸诱变的组合，已经将1454B08的最小能量互补位鉴别为至少由下述组分组成：来自BC环的Tyr 28，来自FG环的Tyr 81，和来自FG环的C-端末端的Pro 87（一种非多变的残基）。
与Adnectin的复合物的结构表明，与靶蛋白相互作用的残基可能在Adnectin的多变环的外面向远处延伸。显然，通过相互作用能量计算和定向诱变实验已经证实了在结合环外面的残基的重要性，所述残基显示出增加或减小结合亲和力的能力。几个接触残基向丙氨酸的诱变，显示出疏水相互作用对于分子间相互作用的重要性。
除了在多变环外面的残基的与靶标相互作用的能力以外，该结构显示了几个其它特征。IL-23/1454B08结构表明，尽管大多数残基参与相互作用，但是并非在Adnectin上的3个多变环中的所有残基都与IL-23直接接触。此外，所述环和N-端可能呈现不同于在野生型10Fn3结构中观察到的构象。据推测，所述环具有一定的柔性，但是仅仅某些构象能够有结果地与靶标相互作用，这是在复合物中观察到的结果。Adnectin由于其小尺寸和凸形，可能实现与抗体难以达到的表面（例如，在IL-23的p40和p19结构域之间的凹陷接头）的结合。最后，尽管Adnectin小于抗体Fv结构域二聚体的尺寸的一半，但是它们完全能够埋藏与它们的靶标一样多的表面。所有这些能力提示，可能证实Adnectin为用于开发蛋白治疗剂的非常有用的平台。
结构坐标表的描述和定位
与adnectin的复合物的晶体结构的结构坐标于2011年2月29日保藏于RCSB蛋白数据库（RCSB Protein Data Bank）(www.pdb.org, Berman, H.M. 等人, “The Protein Data Bank”, Nucleic Acids Research, 28: 235-242 (2000)和www.wwpdb.org, Berman, H.M. 等人, “Announcing the worldwide Protein Data Bank”, Nature Structural Biology, 10(12):98 (2003))，且已经获得PDB ID：3QWR。
实施例
实施例1：本文所用材料及方法
高通量蛋白质产生(HTPP)
将所选结合剂克隆至pET9d载体中，并转化至大肠杆菌BL21 DE3 plysS细胞中，将所述细胞以24孔形式接种于含有50 μg/mL卡那霉素的5 ml LB培养基中，并在37℃生长过夜。通过吸入200 μl过夜培养物并将其分配于合适孔中来制备5 ml新鲜LB培养基(50 μg/mL卡那霉素)培养物用于诱导表达。使培养物在37℃生长直至A600为0.6-0.9。在用1 mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后，使培养物在30℃生长6小时并通过在4℃以2750 g离心10分钟来收获。
通过将细胞沉淀(呈24孔形式)再悬浮于450 μl裂解缓冲液(50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，1x Complete蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA)(Roche)，1 mM PMSF，10 mM CHAPS，40 mM咪唑，1 mg/ml溶菌酶，30 μg/ml DNA酶，2 μg/ml抑肽酶，pH 8.0)中来使其裂解并在室温下振荡1-3小时。将裂解物澄清且通过转移至装配有96孔1.2 ml捕捉板(catch板)的97孔Whatman GF/D UNIFILTER?中而重排(re-rack)为96孔形式并通过正压力过滤。将澄清裂解物转移至已用平衡缓冲液(50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，40 mM咪唑，pH 8.0)平衡的96孔Ni-螯合板中并温育5分钟。通过真空去除未结合材料。用洗涤缓冲液1号(50 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，5 mM CHAPS，40 mM咪唑，pH 8.0)以2×0.3 ml/孔洗涤树脂，且通过真空去除每一洗涤液。在洗脱前，用50 μl洗脱缓冲液(PBS+20 mM EDTA)洗涤各孔，将其温育5分钟并通过真空丢弃此次洗涤液。通过向各孔中施加额外的100 μl洗脱缓冲液来洗脱蛋白质。在室温下温育30分钟后，以200 g将各板离心5分钟并将洗脱蛋白质收集于96孔捕捉板中，所述捕捉板含有在洗脱前添加于洗脱捕捉板底部的5 μl 0.5 M MgCl2。使用BCA测定利用SGE作为蛋白质标准品来定量洗脱蛋白质。
不溶性的基于纤连蛋白的支架蛋白结合剂的中等规模表达及纯化
对于表达，将所选克隆及之后的HIS6标签克隆至pET9d载体中并在大肠杆菌BL21 DE3 plysS细胞中表达。使用20 ml接种培养物(自单一平铺菌落产生)接种1升含有50 μg/ml卡那霉素及34 μg/ml氯霉素的LB培养基或TB-过夜表达培养基(自动诱导)。在37℃温育LB培养基中的培养物直至A600为0.6-1.0，此时用1 mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)对所述培养物实施诱导并在30℃生长4小时。将TB-过夜表达培养基中生长的培养物在37℃温育5小时，此时使温度降至18℃并生长19小时。通过在4℃以≥10,000 g离心30分钟来收获培养物。在-80℃冷冻细胞沉淀。在冰上使用ULTRA-TURRAX?均质器(IKA works)将细胞沉淀再悬浮于25 ml裂解缓冲液(20 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，1x Complete蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA)(Roche)，pH 7.4)中。通过使用M-110S型MICROFLUIDIZER?(Microfluidics)进行高压均质化(≥18,000 psi)来实现细胞裂解。通过在4℃以≥23,300 g离心30分钟来分离不溶部分。用20 mM磷酸钠、500 mM NaCl (pH 7.4)洗涤自对裂解物离心所回收的不溶沉淀。用超声处理将该沉淀再溶解于在20 mM磷酸钠、500 mM NaCl (pH 7.4)中的6.0 M盐酸胍中，随后在37度温育1-2小时。将再溶解沉淀过滤至0.45 μM并装载至用20 mM磷酸钠、500 mM NaCl、6.0 M胍(pH7.4)缓冲液平衡的HISTRAP?柱上。在装载后，用额外25 CV的相同缓冲液洗涤柱。用20 mM磷酸钠、500 mM NaCl、6.0 M盐酸胍(pH 7.4)中的50 mM咪唑洗脱结合蛋白。通过针对50 mM乙酸钠、150 mM NaCl (pH 4.5)或PBS (pH 7.2)进行透析使经纯化蛋白质再折叠。
可溶性的基于纤连蛋白的支架蛋白结合剂的中等规模表达及纯化
作为不溶结合剂的纯化的替代，亦可使用可溶结合剂的纯化。对于表达，将所选克隆及之后的HIS6标签克隆至pET9d载体中并在大肠杆菌BL21 (DE3) plysS细胞中表达。使用20 ml接种培养物(自单一平铺菌落产生)接种1升含有50 μg/ml卡那霉素及34 μg/ml氯霉素的LB培养基或TB-过夜表达培养基(自动诱导)。在37℃温育LB培养基中的培养物直至A600为0.6-1.0，此时用1 mM异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)对所述培养物实施诱导并在30℃生长4小时。将TB-过夜表达培养基中生长的培养物在37℃温育5小时，此时使温度降至18℃并生长19小时。通过在4℃以≥10,000 g离心30分钟来收获培养物。在-80℃冷冻细胞沉淀。在冰上使用ULTRA-TURRAX?均质器(IKA works)将细胞沉淀再悬浮于25 ml裂解缓冲液(20 mM NaH2PO4，0.5 M NaCl，1x Complete蛋白酶抑制剂混合物(不含EDTA)(Roche)，pH 7.4)中。通过使用M-110S型MICROFLUIDIZER?(Microfluidics)进行高压均质化(≥18,000 psi)来实现细胞裂解。通过在4℃以≥23,300 g离心30分钟来分离可溶部分。经由0.45 μM滤器使上清液澄清。将澄清裂解物装载至用20 mM磷酸钠、500 M NaCl (pH 7.4)预平衡的HISTRAP?柱(GE)上。然后用25柱体积的相同缓冲液、之后20柱体积的20 mM磷酸钠、500 mM NaCl、25 mM咪唑(pH 7.4)及随后35柱体积的20 mM磷酸钠、500 M NaCl、40 mM咪唑(pH 7.4)洗涤柱。用15柱体积的20 mM磷酸钠、500 M NaCl、500mM咪唑(pH 7.4)洗脱蛋白质，根据A280下的吸光度合并各部分并针对1x PBS, 50 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 8.5)或50 mM NaOAc, 150 mM NaCl (pH 4.5)进行透析。通过0.22 μM过滤去除任何沉淀。
实施例2：体外表征
结合常数的确定
在乙酸盐（pH 5.0）中将抗-His抗体mAb050 (RnD Systems, MN) 稀释至20 μg/mL，并根据生产商的说明书，在CM5芯片表面(GE Healthcare, Piscataway, NJ) 的流动池1和2上固定化至约9000 RU。在HBS-EP (10 mM Hepes、150 mM NaCl、3 mM EDTA、0.05%表面活性剂P20)中在25℃进行所有表面等离子体实验。将IL-23注射到抗-His mAb捕获的Adnectin的上面保持2分钟，继之以10分钟解离期。使用T100. Biaevaluation计算动力学参数。
细胞上的STAT3磷酸化
等人(“A receptor for the heterodimeric cytokine IL-23 is composed of IL-12Rbeta1 and a novel cytokine receptor subunit, IL-23R”, J. Immunol., 168(11):5699-5708 (2002年6月1日))自人IL-2依赖性T细胞系Kit225克隆出IL-23R。已经表征了这些细胞的IL-12RB1和1L-23R二者的表达（通过FACS分析）以及对IL-23（通过pSTAT3的刺激）和对IL-12（通过pSTAT4的刺激）的应答。将Kit225细胞接种进96孔板中，并在没有FBS和IL-2存在下在37℃静置3小时。在此温育后，施用人重组IL-23(或与拮抗剂预温育1小时的IL-23)，并使细胞返回温育箱中在37℃保持15分钟，以刺激STAT3的磷酸化(缩写为p-STAT3)。在96孔板中一式两份地测定每一条件。通过将细胞置于冰上并添加冰冷PBS来终止刺激。最后，依照标准方案使细胞沉淀并裂解，且通过ELISA来检测pSTAT3产生。
通过滴定抗-p19多克隆抗体(AF1716)，证实了IL-23诱导的pSTAT3的抑制。克隆1241A05具有与抗-p19多克隆抗体类似的活性，IC50为约31 nM (表3)。
实施例3：抗-IL-23 Adnectin/蛋白复合物的结构
用于共结晶研究的抗-IL-23 Adnectin的表达和纯化
通过用克隆进载体pET9d (New England Biolabs, Ipswich, MA)中的、编码Adnectin的基因转化感受态BL21 (DE3) 细胞(Calbiochem)，表达Adnectin。将转化体在通气条件下在补充了卡那霉素自动诱导培养基(EMD Biosciences)中在37℃生长6小时，随后在20℃生长18小时。离心收获细胞，并在-80℃冷冻。
将冷冻的细胞融化，并再悬浮于pH 7.5的50 mM磷酸钠、300 mM氯化钠、10 mM咪唑中。溶解后，将DNA酶(20 ng/μL)加入该混合物中。对细胞进行机械裂解(Avestin Emulsiflex-C3)，离心，并将上清液加载上IMAC柱(Qiagen, Ni-NTA, 30 mL)。使用咪唑不连续梯度(用pH 7.5的50 mM磷酸钠、300 mM氯化钠、30 mM咪唑洗涤，并用pH 7.5的50 mM磷酸钠、300 mM氯化钠、400 mM咪唑洗脱)，洗脱Adnectin。在pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中透析合并的洗脱液。
以3.7 nM的KD结合固定化的IL-23，并在生化竞争测定中以1 nM的IC50与IL-23/IL-23R相互作用竞争。
亲和柱的制备
根据公开的说明书(GE Healthcare 71-5000-15 AD)，制备CNBr活化的SEPHAROSE?4 Fast Flow树脂(GE目录号17-0987-01)。在摇振下，将Adnectin与树脂一起在4℃温育过夜。偶联效率> 98% (通过A280确定)。
人IL-23的表达/纯化
通过使用p40和p19亚基的双顺反子构建体，在Sf9细胞中表达人IL-23。浓缩含有分泌的IL-23的培养基，并通过切向流过滤缓冲液交换进PBS或TBS中。以20cm/小时的流速，将浓缩物加载上Adnectin亲和柱(将不同大小的柱用于不同的制品)。用TFF缓冲液洗涤该柱5个柱体积，随后用0.1 M乙酸盐（pH 4.0）、1.0 M NaCl进行不连续洗脱。用Tris HCl（pH 8.0）(1/10体积；最终的Tris浓度为0.1M)中和洗脱液，合并，并浓缩。进一步纯化样品，并在制备级SUPERDEX?200尺寸排阻色谱(SEC)柱上缓冲液交换进HBS中。
复合物的制备
以1:3摩尔比混合人IL-23和Adnectin，并在4℃温育过夜。通过在SUPERDEX?200柱(GE Healthcare)上的尺寸排阻色谱法，在含有25 mM HEPES（pH 7.0）、200 mM NaCl的运行缓冲液中分离1:1复合物。为了确保不存在游离的IL-23，将1倍摩尔过量的游离Adnectin（其在柱上分离）加入复合物中。将最终的复合物浓缩至12 mg/mL。
复合物的结晶
使用坐滴蒸汽扩散方法，通过将1 μL蛋白复合物与1 μL蓄池溶液（其含有1M柠檬酸三钠、0.2M氯化钠、0.1M Tris，pH 7.0）混合，使人IL-23/1454B08复合物在20℃结晶。通过引晶技术提高晶体质量。
数据收集和处理
在位于Argonne National Laboratory的先进光子源（Advanced Photon Source）的IMCACAT，在束线（beamline）17ID收集IL-23/1454B08复合物的数据。使用的波长是1.0?，检测器是MAR 165 CCD，距离为200 mm。以150o的扫描，每3秒收集0.5o的旋转图像。索引数据，积分，并用d*TREK标定(Pflugrath, “The finer things in X-ray diffraction data collection”, Acta Crystallogr. Sect. D, 55:1718-1725 (1999))。空间群、晶胞参数和数据收集统计学列出在下表4中。
分子置换
使用残基1416-1437、1444-1466、1470-191和1502-1509，即，删除BC、EF和FG环，从PDB 1FNF衍生出Adnectin的模型。从在文献中公开的那些(3DUH, 3D87)，在BMS确定不同晶型的IL-23模型的结构(V. Ramamurthy和S. Sheriff, 未公布)。使用PHASER (McCoy等人, “Phaser crystallographic software”, J. Appl. Crystallogr., 40:658-674 (2007))进行分子置换，注意平移函数Z-评分和在添加每块时的对数似然增益（Log Likelihood Gain）。当PHASER没有发现IL-23/1454B08复合物中的Adnectin时，使用AMoRe平移函数的六维检索获得成功(Sheriff等人, “Implementation of a six-dimensional search using the AMoRe translation function for difficult molecular-replacement problems”, J. Appl. Crystallogr. 32:98-101 (1999); Navaza, “AMoRe: an automated package for molecular replacement”, Acta Crystallgr. Sect. A, 50:157-163 (1994); Navaza等人, “On the fast translation functions for molecular replacement”, Acta Crystallgr. Sect. A, 51:445-449 (1995); CCP4, “The CCP4 Suite: programs for protein crystallography”, Acta Cryst., D50:760-763 (1994))。
模型建立、精化和图形显示
使用COOT (Emsley等人, 2004Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. Sect. D, 60:2126-2132 (2004); Emsley等人, “Features and Development of COOT”, Acta Crystallogr. Sect. D, 66:486-501 (2010))进行模型建立和结构的一般观察。用得自GlobalPhasing, Ltd. 的autoBUSTER(Bricogne等人, 2009 BUSTER, version 2.8.0. Cambridge, United Kingdom: Global Phasing Ltd.)进行精化。用PyMOL (DeLano, 2002, The PyMol Molecular Graphics System (2002). DeLano Scientific, San Carlos, CA, US. http:/www.pymol.org)生成图形显示。精化统计学列出在下表5中。
用程序MS (Connolly, “Analytical Molecular Surface Calculation”, J. Appl. Crystallogr., 16:548-558 (1983))，使用Gelin等人(“Side-chain torsional potentials: effect of dipeptide, protein and solvent environment”, Biochemistry, 18:1256-1268 (1979))定义的1.7?探测球扩展的原子半径，计算埋藏的表面积。接触残基如下述文献所定义：Sheriff等人, “Structure of Myohemerythrin in the Azidomet State at 1.7/1.3?Resolution”, J. Mol. Biol., 197:273-296 (1987)，和Sheriff, “Some methods for examining the interactions between two molecules”, Immunomethods, 3:191-196 (1993)，它们使用如Gelin等人(1979)所定义的扩展原子半径。
残基自由能和相互作用能的估测
使用MAESTRO 9.0.211 (Schrodinger, LLC. 2009)中的蛋白制备（Protein Preparation）WIZARD?工作流，优化蛋白复合物。在该过程中，优化了组氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的侧链质子化状态、组氨酸互变异构体和末端Chi旋转异构体。所述工作流中的最终步骤是复合物(0.3?RMSD)的受限最小化，其允许在OPLS_2005力场内对复合物进行精细优化。使用PRIME侧链精化方案，建立每种突变型蛋白质的蛋白模型，随后进行2个最小化步骤。第1个最小化仅应用于在突变位点的5?内的残基子集的侧链。最后1个最小化步骤应用于相同残基子集，但是它包括处于最小化的残基的主链。
如以前所述(Novotny等人, “On the attribution of binding energy in antigen-antibody complexes McPC 603, D1.3, and HyHel-5”, Biochemistry, 28:4735-4749 (1989); Krystek等人, “Affinity and specificity of serine endopeptidase-protein inhibitor interactions”, J. Mol. Biol., 234:661-679 (1993))，计算吉布斯自由能的估测值，并使用MAESTRO (Maestro, 9.0版, Schr?dinger, LLC, New York, NY, 2009)，在python脚本中实现。使用Macromodel (MacroModel, 9.7版, Schr?dinger, LLC, New York, NY, 2009)，使用如在组分相互作用（Component Interactions）脚本(Schrodinger, LLC) 中实现的OPLS_2005力场，确定残基相互作用能。该脚本计算一组残基之间的分子力学相互作用能，并输出各个范德华（VDW）和静电贡献项目。就静电组分而言，使用距离依赖性的电介质，其具有4.0的常数，类似于自由能计算。
复合物的结构的概述
是由p40亚基和p19亚基组成的双亚基蛋白，所述p40亚基与IL-12共有，所述p19亚基不同于IL-12的p35亚基。所述p40亚基由3个Ig-样7-链β-折叠结构域组成，而所述p19由4-螺旋束组成。1454B08结合在p40和p19亚基的接头处，与二者（包括p40亚基的结构域2和3）发生显著的相互作用(图3)。此外，尽管3个多变环(BC、DE和FG)朝向界面的中心，相互作用沿着β-链延伸远离BC、DE和FG环末端，并且甚至观察到与分子的相对末端上的CD环的相互作用。该凹陷位点可能是由来自各个亚基的2个结构域和6个高变环组成的大得多的抗体结合位点所不可接近的。实际上，Adnectin结合位点显著不同于IL-23的一种已知抗体复合物(PDB 3D85)的结合位点，后者仅仅结合p19亚基(Beyer等人, “Crystal Structures of the Pro-inflammatory Cytokine Interleukin-23 and its Complex with a High-affinity Neutralizing Antibody”, J. Mol. Biol., 382:942-955 (2008))。
与IL-23的特异性相互作用
和IL-23之间的相互作用是非常大的，埋藏了Adnectin表面上的约1320?2和IL-23表面上的约1390?2。该量的埋藏表面积大于大多数抗体/抗原相互作用，并且据推测，会反映IL-23上的结合位点的凹陷性质。尽管存在较大的相互作用表面，1454B08对IL-23的亲和力与该抗体对它们的蛋白抗原的亲和力处于相同数量级。该复合物的Sc统计值为0.73，这提示，它比Lawrence等人(“Shape Complementarity at Protein/Protein Interfaces”, J. Mol. Biol., 234:946-950 (1993))测量的抗体/抗原复合物更互补。
基本相互作用通过FG (约540?2)和BC (约300?2) 环而发生，但是二级结构的大部分区段具有至少一些被相互作用埋藏的表面积。发现来自Adnectin的下述残基会接触IL-23：N-端区域：Pro5，Arg 6，Asp 7，BC-环：Glu 23，His 24，Asp 25，Tyr 26，Pro 27，Tyr 28，Arg 30，C-链：Tyr 31；CD-环：Gly 40，Asn 42，Val 45；F-链：Tyr 73，Val 75；FG-环：Thr 76，Ser 77，Ser 78，Tyr 79，Lys 80，Tyr 81，Asp 82，Met 83，Gln 84，Tyr 85，Ser 86，Pro 87 (图4)。四点从该列表中凸显出来。首先，相互作用残基的数目较大，并且它们来自许多β-链和环。其次，不存在多变的DE-环和IL-23之间的接触。第三，在相互作用中涉及较大数目(7个)的酪氨酸残基。关于与抗原相互作用的抗体，已经观察到酪氨酸的频繁出现(Padlan, “On the nature of antibody combining sites: Unusual structural features that may confer on these sites an enhanced capacity for binding ligands”, Proteins: Structure, Function and Genetics, 7:112-124 (1989); Mian, “Structure, Function and Properties of Antibody Binding Sites”, J. Mol. Biol., 217:133-151 (1991); Kossiakoff等人, “Understanding mechanisms governing protein-protein interactions from synthetic binding interfaces”, Curr. Opin. Struct. Biol., 18:499-506 (2008); Koide等人, “The importance of Being Tyrosine: Lessons in Molecular Recognition from Minimalist Synthetic Binding Proteins”, ACS Chem. Biol., 4:325-334 (2009))，并且据推测是由于与酪氨酸残基能够贡献的大表面积（在该情况下，共计约420?2）相比相对较低的熵损失，后者归因于已经变得固定化的相对较小的双面夹角。第四，在与IL-23的直接相互作用中涉及较大数目(9个)的非多变的残基。在该第四类中的残基包括7个Tyr残基中的2个和在N-端处的残基。尽管电子密度仅就N-端的某个部分而言是可判断的，显然，N-端没有象它在野生型10Fn3中那样指向BC、DE和FG环的方向，而是反转方向，并指向分子的相对末端。这种取向变化会阻止N-端与IL-23碰撞，使其严密限制在p40和p19亚基之间的接头处。
白介素-23竞争性的ELISA
通过ELISA试验了Adnectin变体的以与天然IL-23受体(IL-23R)的结合位点竞争的方式结合IL-23的能力。将50μL（4μg/mL，在PBS中）重组人IL-23R-Fc (R&D Systems, Minneapolis, MN) 在NUNC?Maxisorp板(Thermo Fisher Scientific, 丹麦) 上在4℃包被过夜。使用自动化的洗板机(Biotek, VT)，用PBST (含有0.05% (w/v) 吐温的PBS)进行所有洗涤。使用OptEIA缓冲液(BD Bioscience, CA)作为封闭剂和测定稀释剂。将在200 nM至28 pM范围内的Adnectin稀释液与1 nM IL-23一起预温育1小时，然后转移至封闭的IL-23R-Fc包被的平板保持30分钟。通过抗-IL-23 (GeneTex, CA)和抗-小鼠-HRP (R&D Systems, MN) 检测结合的IL-23，随后加入TMB (3,3′,5,5′-四甲基联苯胺) (BD Bioscience, CA)。典型的显影时间为10分钟。使用已知的IL-23 Adnectin中和标准品来定义100% 抑制，并使用非结合性的Adnectin标准品作为阴性对照，计算抑制百分比。使用自制的曲线拟合应用程序，从4次运行的平均值产生IC50。
是突变为丙氨酸的4个关键氨基酸，以表明我们可以积极地预测重要的残基。所述酪氨酸残基都具有大于75%的表面积被埋藏在IL-23界面处，且Pro 87具有约70%的表面被埋藏在界面处。能量学计算提示，在这些位置处向丙氨酸的突变会降低结合。对于Tyr 28、Tyr 81和Pro 87，这被证实是事实，但是这对于Tyr 73而言没有得到证实，所述Tyr 73在突变为丙氨酸时几乎没有影响(表6)。
位于BC-环的中心，并与处于IL-23 p19结构域A-螺旋的末端处的氨基酸形成显著接触，例如，与Trp 26和His 29的边对面相互作用。类似地，位于FG-环的中心的Tyr 81与IL-23 p40亚基（例如，Ser 204）具有显著接触。位于FG-环的C-端处的Pro 87可能是保持FG-环构象所必需的，并且会接触来自IL-23 p40亚基的残基Gly 100和Pro 101。预测Tyr 73仅为相互作用贡献约6千卡（与此相比，Tyr 28和Tyr 81分别贡献约16千卡和约13千卡），并且在最小化的结构中，该侧链与IL-23 p40亚基Lys 99羰基氧形成氢键。
定位突变的影响
尽管丙氨酸诱变突出了由置换的每个侧链的官能团做出的贡献，使用其它氨基酸置换可以获得对新的分子间相互作用的洞察。我们还尝试发现1454B08上的这样的位点：通过添加新的接触，我们可以在此处增强结合活性。大多数这样的突变轻微地改变活性。但是，据预测是有利的一个突变，显著降低了活性。另一方面，导致了活性的不大增加。通过丙氨酸诱变和能量学计算的组合，我们已经能够将1454B08的最小能互补位定义为至少由下述组分组成：来自BC环的Tyr 28，来自FG环的Tyr 81，和来自FG环的C-端末端的Pro 87（一种非多变的残基）。
结构对比表明，当1454B08与它的靶分子结合时，野生型分子(10Fn3;1FNF残基1416-1509) 具有与1454B08非常类似的拓扑学(图5)，包括核心β-折叠的优良重叠、以及远离多变区的3个环中的2个(AB和DE) (图5A，右侧)。1454B08的所有3个多变环BC、DE和FG环的长度与野生型相等，并且在该结构中，短DE环显示出最小变异。另一方面，与10Fn3结构相比，BC环显示出更多的变异。最大变异是在FG环中，在该处，在1FNF晶体结构中，天然RGD基序参与晶体接触，并且该接触可能负责它在该结构中的取向。在1454B08中，当与IL-23结合时，FG环呈现不同的构象。最后，应当指出，在Adnectin中的N-端是柔性的。在10Fn3中，该位置取决于与9Fn3的连接。另一方面，与10Fn3 N-端相比，1454B08的N-端折叠远离，据推测是为了避免与IL-23碰撞。
CPCH1361878P
序列表
<110> Bristol-Myers Squibb Company
<120> 结合IL-23的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白质
<130> 11713 PCT
<150> 61/426,024
<151> 2010-12-22
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<170> PatentIn 3.5版
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<212> PRT
<213> 智人
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1 5 10 15
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<223> 半胱氨酸 接头
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<223> 1454F05
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机译： 结合IL-23的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白
机译： 结合IL-23的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白
机译： 结合IL-23的基于纤连蛋白的支架结构域蛋白
