一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱方法

摘要

本发明公开了一种测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法，包括如下步骤：（1）制备溶菌酶纳米金适配体探针；（2）制备溶菌酶标准溶液体系；（3）制备空白对照溶液体系：用步骤（2）的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液；（4）分别以溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系测定共振瑞利散射峰强度值I与I0，计算ΔI=I-I0；（5）以ΔI对溶菌酶的浓度关系做工作曲线；（6）被测物样品测定，算出被测物的ΔI样＝I样-I0；（7）根据样品测得的ΔI样，查步骤（5）的工作曲线，计算出被测物中溶菌酶的浓度。本测定方法的仪器简单，操作快速，灵敏度高、选择性好。

说明书

技术领域

本发明涉及分析化学，具体是测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法。

背景技术

溶菌酶又称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它是由129个氨基酸残基组成的碱性球蛋白，是由英国细菌学家弗莱明于1922年在鼻粘液中发现的强力杀菌物质。溶菌酶存在于蛋清、哺乳动物的泪液、唾液、尿液、乳汁等体液以及微生物中，其中以蛋清含量最为丰富。溶菌酶能选择性地使目标微生物细胞壁溶解而使其失去生理活性，具有良好的杀菌抑菌作用。由于无毒安全，溶菌酶作为一种生物防腐剂被广泛的应用于食品工业中。因此，研究简单，快速，灵敏测定溶菌酶的方法具有重要的意义。目前，溶菌酶的检测方法主要有光度法、电化学法、表面等离子体共振法、化学发光法、荧光法等。这些方法各有其优缺点，但有的方法操作复杂，有的灵敏度欠佳，有的选择性欠佳，使得这些方法的使用受到了一定的限制。

核酸适配体是通过指数级富集的配体系统进化技术体外筛选得到的寡核苷酸序列，由于适配体具有制备简单、便于修饰、稳定性好等优点，且能特异性地识别金属离子、蛋白质、小分子等各种靶分子，已成为分析化学领域的重要发展方向。共振瑞利散射光谱法是一种灵敏、快速、简便的光谱分析技术，在生物化学、分析化学、纳米材料研究等方面均有应用。它与适配体标记纳米金反应结合已建立适配体共振瑞利散射分析方法，用于检测痕量金属离子和腺苷等有机小分子。据我们所知，尚未见溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法报道。

发明内容

本发明的目的是为克服现有技术的不足，而提供一种简单快速测定溶菌酶的适配体纳米金共振瑞利散射光谱法。

应用适配体纳米金共振瑞利散射光谱法测定溶菌酶，包括如下步骤：

（1）制备溶菌酶纳米金适配体探针：取序列为5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′的溶菌酶适配体，用二次蒸馏水溶解至浓度为1 μmol/L。于试管中，加入2.0 mL 47.8 μg/mL纳米金溶液，0.8 mL 1 μmol/L 溶菌酶适配体，混合均匀，室温下静置10min，即获得0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针，于4℃保存。

（2）制备溶菌酶标准溶液体系：取刻度试管，依次移取100～400 μL 0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针，20～80μL 0.05 mol/L pH 7.2～9.1 Tris-HCl缓冲溶液，5～60μL 0.174 μmol/L溶菌酶标准溶液，用二次蒸馏水定容至1.0mL，再加入20～90μL 2.0 mol/L NaCl溶液，用二次蒸馏水定容至2.0mL。混匀；

（3）制备空白对照溶液体系：用步骤（2）的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液；

（4）分别取按步骤（2）、(3）制备的溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系适量，置于比色皿中，在荧光分光光度计上，同步扫描激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大波长368 nm处溶菌酶标准溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I，以及测定空白对照溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I₀，计算ΔI = I-I₀；

（5）以ΔI对溶菌酶的浓度关系做工作曲线；

（6）被测物样品测定：取含有溶菌酶的被测物，然后移取一定量替换溶菌酶标准溶液，按步骤（2）～（4）操作。算出被测物的ΔI_样＝I_样-I₀；

（7）根据样品测得的ΔI_样，查步骤（5）的工作曲线，计算出被测物中溶菌酶的浓度。

实现本发明的原理是：适配体和纳米金通过电荷引力、范德华力及分子间作用力相互结合形成适配体-纳米金探针复合物，它在高盐浓度下稳定而不聚集。在Tris-HCl 缓冲溶液中，当加入溶菌酶时，适配体与溶菌酶发生特异性结合，形成稳定的适配体-溶菌酶复合物，释放出的纳米金在NaCl作用下形成粒径较大的聚集体，导致共振瑞利散射光强度增强。随着溶菌酶浓度增大，释放出来的纳米金越多，纳米金聚集体越大，共振瑞利散射光强度增强。据此建立了一个简便快速测定溶菌酶的共振瑞利散射光谱法。

本发明的优点是：

与已有的方法相比，本测定方法操作简便，灵敏度高、选择性好。

附图说明

图1为本发明实施例测定溶菌酶的部分共振瑞利散射光谱图。

图中：a: 39.2 nmol/L 适配体-纳米金探针-pH 8.05 Tris-HCl缓冲液-40 mmol/L NaCl; b: a+1.7 nmol/L溶菌酶;c: a+5.2 nmol/L 溶菌酶。

具体实施方式

实施例

应用适配体-纳米金共振瑞利散射光谱法测定溶菌，包括如下步骤：

（1）制备溶菌酶纳米金适配体探针：取序列为5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′的溶菌酶适配体，用二次蒸馏水溶解至浓度为1 μmol/L。于试管中，加入2.0mL 47.8 μg/mL纳米金溶液，0.8mL 1 μmol/L 溶菌酶适配体，混合均匀，室温下静置10min，即获得0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针，于4℃保存。

（2）制备溶菌酶标准溶液体系：取5支刻度试管，依次移取280 μL 0.28 μmol/L溶菌酶适配体探针，50μL 0.05 mol/L pH 8.05 Tris-HCl缓冲溶液，0.174 μmol/L溶菌酶标准溶液5μL、20μL、40μL、50μL、60μL，用二次蒸馏水定容至1.0mL，再加入40μL 2.0 mol/L NaCl溶液，用二次蒸馏水定容至2.0mL。混匀；

（3）制备空白对照溶液体系：用步骤（2）的方法不加溶菌酶标准液制备空白对照溶液；

（4）分别取按步骤（2）、(3）制备的溶菌酶标准溶液体系及空白对照溶液体系适量，置于比色皿中，在F-7000型日立荧光分光光度计上，设定仪器检测器电压为450伏，激发波长狭缝及发射波长狭缝均为5nm，同步扫描从200nm～800nm的激发波长和发射波长，获得体系的共振瑞利散射光谱，测定体系最大波长368 nm处溶菌酶标准溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I，以及测定空白对照溶液体系的共振瑞利散射峰强度值I₀，计算ΔI = I-I₀；

（5）以ΔI对溶菌酶的浓度C (nmol/L)关系做工作曲线；回归方程为ΔI = 446 C + 49.8；

（6）被测物样品测定：取鸡蛋清搅拌均匀后，移取500 μL蛋清于试管中，加入49.5 mL二次蒸馏水，于超声波仪上超声30min使蛋清充分溶于水中，用滤纸过滤，取滤液适量用二次蒸馏水稀释48倍；然后移取100μL替换溶菌酶标准溶液，按步骤（2）～（4）操作。算出被测物的ΔI_样＝I_样 - I₀；

（7）根据样品测得的ΔI_样，查步骤（5）的工作曲线，计算出被测物中溶菌酶的含量分别为6.5 mg/mL、4.7 mg/mL、5.9 mg/mL。

本发明实施例测定溶菌酶线性范围为0.4～5.2 nmol/L，回归方程为ΔI= 446C+49.8，检出限为0.05 nmol/L。

本发明检测方法的验证：

取上述步骤（6）制备的被测样品溶液适量,按参考文献Yan Li, Honglan Qi, Qiang Gao, Chengxiao Zhang. Label-free and sensitive electrogenerated chemiluminescence aptasensor for the determination of lysozyme. Biosensors and Bioelectronics. 2011, 26: 2733-2736. 的方法测定溶菌酶的含量,结果分别为6.3 mg/mL、4.5 mg/mL、5.6 mg/mL。

说明该方法准确可靠。

5′- CAGTGTATCGAATTCATCAGGGCTAAAGAGTGCAGAGTTACT-3′