一种靶向于细菌RNA聚合酶的抗结核小分子化合物

摘要

本发明属生物技术领域，涉及作用于抑制结核分支杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的RNA聚合酶的小分子抑制剂；式（Ⅰ）为该抑制剂的分子结构结构；该类抑制剂作为药物化合物预防或治疗相关细菌感染性疾病的方法。通过生化和生物学实验，结果显示式（Ⅰ）的该抑制剂与目的蛋白——结核分支杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌RNA聚合酶具有很强的结合力，且能明显抑制上述合成酶的活性，能显著抑制结核分支杆菌（包含耐药结核分支杆菌）、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长。本发明抑制剂可制备治疗由结核分支杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌引起疾病的药物，配制成消毒液。

说明书

技术领域

本发明本发明属生物技术领域，涉及作用于抑制结核分支杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的RNA聚合酶的小分子抑制剂；该抑制剂的分子结构；该类抑制剂作为药物化合物预防和治疗相关的细菌感染性疾病的方法。 

  

背景技术

细菌RNA聚合酶（RNAP）是一个已经明确的开发广谱抗菌药物的靶蛋白。它是细菌DNA转录过程中的关键酶，抑制此聚合酶的活性则能够终止细菌DNA的转录，从而高效地阻断细菌的蛋白质合成。目前，已有一些抑制细菌RNAP的药物，如利福霉素类抗生素（如利福平，利福喷丁和利福布丁等）是细菌RNA聚合酶的优良抑制剂。它们在临床治疗革兰氏阴性和阳性细菌感染起到了非常重要的作用，也是一线的抗结核药物，而且也是唯一的快速清除感染和预防复发的抗结核药物。且利福平对于静止期的结核分枝杆菌也具有明显的杀灭效果，从而防止结核病的复发。但由于上述药物的频繁使用以及抗生素的滥用，出现了对利福霉素类耐药和多重耐药性的细菌，导致结核或耐药性感染问题日益严峻，公共医疗正在受到耐药菌的威胁，因此开发一种新型的细菌RNA聚合酶抑制剂迫在眉睫。 

细菌RNA聚合酶“开关区”靶点的发现则为解决这一问题奠定了基础。2008年第一个极端嗜热细菌RNAP与抑制剂复合物的三维结构被解析出来，该晶体结构的解析度为3.0埃。基于细菌RNAP“开关区”新靶点进行新型抑制剂的筛选与设计具有许多明显的优势：第一，细菌RNAP“开关区”靶点的氨基酸序列与真核生物RNAPⅠ、Ⅱ、Ⅲ中的序列不同，研究小组的实验显示，细菌的RNAP“开关区”靶点抑制剂并没有表现出对真核生物RNAP的交叉抑制作用，因此基于此靶点筛选得到的抑制剂可以特异性地作用于细菌而非人体，具有良好的安全性。第二，细菌RNAP是DNA转录过程中的必需酶，并且此转录路径是唯一的，抑制此靶点就阻断了转录过程，从而抑制细菌蛋白的生物合成，因此，因此可望基于此靶点开发出具有高效抗菌的新型药物。第三，细菌RNAP“开关区”靶点的氨基酸序列在各种细菌的RNAP中是高度保守的，因此可望基于此靶点开发出具有广谱抗菌性的新型药物。第四，细菌RNAP“开关区”新靶点与目前已发现的RNAP药物靶点无重合或者交叉，因此可望基于此靶点开发出的新型抑制剂与现有细菌RNAP抑制剂无交叉耐药性，且可抑制耐药细菌。这些明显优势和细菌RNA聚合酶与抑制剂复合物的三维结构的成功解析为采用计算机虚拟筛选有效抑制细菌RNA聚合酶的活性分子提供了可能。 

本发明选择细菌RNA聚合酶的“开关区”作为靶标，运用计算机辅助药物设计的手段对小分子三维结构数据库中的化合物进行虚拟筛选，对打分较高、活性较好的化合物进行化学合成和衍生，以及生物活性测试。生活活性测试证明，我们获得化合物对细菌的RNA聚合酶具有很好的抑制活性，同时对结核分枝杆菌（包含耐药结核分支杆菌）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌也具有很好的抑制活性。 

发明内容

本发明的目的是提供提供一种结核分枝杆菌（包含耐药结核分支杆菌）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌抑制剂，具体涉及式（Ⅰ）的化合物（简称：RNAP-001）在制备抑制结核分枝杆菌（包含耐药结核分支杆菌）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的抑制剂中的用途。此化合物购于IBscreen公司，结构式如下： 

（Ⅰ）

    本发明所述的抑制剂通过抑制细菌的RNA聚合酶的活性而抑制结核分枝杆菌（包含耐药结核分支杆菌）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌生长。

本发明所述的抑制剂可进一步制备治疗由结核分枝杆菌（包含耐药结核分支杆菌）、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌引起的疾病的药物；配制成消毒液作为医疗器械消毒包括室内消毒。 

本发明通过下述方法和步骤进行： 

       通过生化实验和生物学实验对式（Ⅰ）的化合物（RNAP-001）抑制结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的RNA聚合酶的活性和抗菌活性进行检测。

结果显示，本发明中的化合物RNAP-001对目的蛋白——结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的RNA聚合酶有很好的抑制活性（其抑制活性与现有抑制剂相当）其IC₅₀如表1所示。抑菌实验显示，化合物RNAP-001对结核分枝杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌均有较好的抑制作用，其中，对结核分枝杆菌的抑制活性最好，且对耐药结核分枝杆菌也有明显的抑制作用，其最小抑菌浓度（MIC₅₀）如表2所示。 

  

具体实施方式

       在以下的实施例中将进一步举例说明本发明。这些实施例仅用于说明本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例中的所有参数以及其余的说明，除另有说明外，都是以质量为说明依据的。 

实施例1 

化合物RNAP-001对细菌RNA聚合酶的体外抑制实验。对于化合物RNAP-001分子，通过检测底物ATP的减少量——Kool NC-45 RNAP Activity & Inhibitor Screening Kit（Epicentre 公司 ）：将2μg大肠杆菌、金葡萄球菌、结合分枝杆菌RNA聚合酶分别与梯度稀释的吡啶并吲哚衍生物在25℃作用20分钟，然后加入1002μMATP（反应总体积50μL），在25℃作用20分钟后，将反应混合物加入96孔酶标板，每孔50μL，加入Kool NC-45Reagent每孔50μL室温静置10分钟，读取化学发光值表示反应剩余的ATP的量，实验设不加化合物组为对照组。最后计算化合物RNAP-001对目的蛋白活性的抑制率：

 

检测结果显示，实施例中的化合物RNAP-001对大肠杆菌、金葡萄球菌、结核分枝杆菌的RNA聚合酶有不同程度的抑制作用，其IC₅₀如表2所示。

表2 化合物对三种细菌的RNA聚合酶的抑制活性IC₅₀

注：IC50值即半数抑制浓度，代表化合物抑制反应体系中细菌RNA聚合酶半数催化活性时的浓度。

  

实施例2

化合物RNAP-001对标准细菌生长的体外抑制实验。使用美国Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)推荐的标准试管稀释法：

1、将细菌接种于新鲜的MH液体培养基，37℃培养过夜；

2、将菌液用新鲜的MH液体培养基校正至0.5麦氏比浊标准，再用MH液体培养基按1：200稀释，向每只试管中加入1mL，加入1mL不同浓度梯度的N-((4-氟代苄氧基)甲基)-O-甲基-N-(6-(三氟甲基)-2,3,4,9-四氢化吡啶并吲哚)羟胺等6个化合物(溶剂DMSO终浓度保持1%)，37℃培养18小时，以1%DMSO+细菌作为对照，以无菌培养基为空白对照；

3、 取出与空白对照比较，细菌不生长的浓度最低的一管即为化合物RNAP-001的最小抑菌浓度。

结果显示，化合物RNAP-001对大肠杆菌、金葡萄球菌、结核分枝杆菌生长有明显的抑制作用，表3是化合物RNAP-001对上述三种细菌生长的抑制作用，其中显示了其最低抑菌浓度。 

表3 化合物对三种细菌的抑制活性MIC₅₀

实施例3

化合物RNAP-001对耐药结核分支杆菌的体外抑制实验。采用实施例3所述的实验方法，对临床采集的3株耐药结核分支杆菌使用化合物RNAP-001进行抑菌实验。同时使用了临床常用抗结合药物链霉素(SM)、乙胺丁醇（EMB）、卡那霉素（KM）、异烟肼（INH）、利福平（RFP）、左氧氟沙星（LVFX）、氧氟沙星（OFLX）、莫西沙星（MOX）、卷曲霉素（CPM）、阿米卡星（AMK）做为对照。

结果显示，化合物RNAP-001对临床采集的耐药结核分枝杆菌生长有明显的抑制作用，其MIC9₀值如表5。 

表5 结核分枝杆菌临床耐药株对各种药物和化合物RNAP-001的MIC₉₀值 

注：药物列数据为结核分枝杆菌临床分离株对药物的MIC₉₀值(单位: μg/ml) 。