水稻条纹病毒P3基因用于制备转基因抗稻瘟病植物体的应用

摘要

本发明涉及水稻条纹病毒(

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域及植物病害防治领域，尤其涉及水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)P3基因在植物抗稻瘟病中的应用领域。

背景技术

水稻条纹病毒（Rice Stripe virus, RSV）是由灰飞虱传播的一种重要水稻病毒，由该病毒导致的水稻条纹叶枯病在我国持续发生，造成严重经济损失。近年来，我国科学家针对RSV的生物学和分子生物学研究开展了一系列细致而深入的工作：测定了病毒全基因组序列、鉴定了病毒沉默抑制蛋白、运动蛋白、开展了水稻互作蛋白的分离筛选工作、建立了灰飞虱饲毒、检测技术、综合防治技术等工作，这些工作所取得的进展加深了人们对于RSV致病机制的了解。RSV的p3基因编码一个沉默抑制蛋白，通过与siRNA结合起到抑制RNA沉默的作用。

稻瘟病又名稻热病，俗称火烧瘟、吊头瘟、掐颈瘟等，是世界性的重要稻病，在我国它同纹枯病、白叶枯病被列为水稻三大病害，由稻梨孢菌(PyriculariaoryzaeCav.)引起，在世界各水稻产区都有发生，其中以亚洲和非洲稻区发病最为严重。稻瘟病是危害我国水稻产区的三大水稻病害之一，一般可造成产量损失10%-30%，流行时产量损失可达40%-50%。

防治稻瘟病的最经济有效的措施是选育和种植抗病品种。传统的防治方法是通过不断更换农药品种以及加大农药使用量来防治稻瘟病，这对生态环境和人类健康产生压力。利用植物基因工程可向现有栽培品种中导入外源基因而不受种属限制，拓展可利用基因的来源，为作物抗病育种工作开辟了一条崭新而有效的途径。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗稻瘟病植物体的应用。本发明的第一个目的是提供一种抗稻瘟病的水稻的制备方法。

为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：

水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因用于制备转基因抗稻瘟病植物体的应用。该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。该基因来源于水稻条纹病毒，通过GenBank序列比对设计引物从我们田间采集的水稻病株上序列扩增而来。作为优选，该基因用于制备抗稻瘟病水稻。

为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：

一种抗稻瘟病的水稻的制备方法，该方法采用包含水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因的宿主细胞对水稻成熟胚进行的遗传转化获得。作为优选，所述的宿主细胞由包含水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因的植物表达载体转化。作为再优选，转化菌株为农杆菌菌株EHA105。

作为优选，所述的宿主细胞的制备方法包括以下的步骤：

(1) 水稻条纹病毒p3基因的克隆及载体构建

通过GenBank中的RSV p3序列分析，设计如下引物用于从田间采集的RSV侵染水稻病株中扩增得到水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，引物设计时已加入酶切位点，用于将p3基因重组到双元表达载体pCV1300中；引物序列如下：

P3 (+):  5’- T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’

P3 (-):  5’- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’；

(2) 转化农杆菌

取-70 ℃保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解；取1μl抽纯pCV-P3-C质粒加入到100 μl感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯；设置2200V电压，电击转化；点击完成加入900 μl的液体YEP培养基，28 ℃，200 rpm摇床培养1.5 h，菌液涂布在含50 μg/ml卡那霉素和100 μg/ml利福平平板上，28 ℃培养至形成单菌落。

作为优选，所述的抗稻瘟病的水稻的制备方法包括以下的步骤：

1) 菌液的准备

取-70 ℃保存的包含水稻条纹病毒(Rice stripe virus, RSV)p3基因的阳性转化菌株，于含50 μg/ml卡那霉素和100 μg/ml利福平平板上划线，28 ℃培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50 μg/ml Kan、100 ug/ml Rif的YEP液体培养基中培养，28℃，220rpm振荡培养24 h；将菌液按1:100用YEP 培养基稀释，继续震荡培养至OD600为0.6；

2) 水稻成熟胚愈伤组织的诱导与培养

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子；将种子放入100 ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1min，无菌水洗3-5遍，直到没有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸钠；溶液，浸泡30min；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30min；种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿9-12颗；操作完毕用封口膜；封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织，置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周；

3) 愈伤组织与农杆菌的共培养

收集菌体，用含200 μmol/L As的AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD600的终浓度为0.1；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；将愈伤组织置于共培养基上；26℃暗培养2.5d；

4) 抗性愈伤的筛选与分化

将愈伤组织取出，用无菌水清洗1遍，再用含500 mg/L头孢拉定或头孢噻肟钠的无菌水浸泡30 min，清洗3-5遍，置于无菌滤纸上沥干2h。随后将晾干的愈伤转入选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14d；将长有抗性愈伤的初始愈伤进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；挑取颜色鲜黄的颗粒类抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗；

5) 生根壮苗和移载

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2 cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周；选择高10 cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。

本发明通过设计引物克隆基因阅读框全长，构建表达载体，通过遗传转化与分子技术检测，获取稳定遗传的转p3基因植株。然后对转基因植株接种稻瘟菌，进行抗稻瘟分析，筛选抗病株系。本发明获取的转p3基因水稻，主要应用于抗稻瘟菌水稻育种，避免真菌病害的为害。本发明对培育高抗稻瘟病水稻具有重要的理论及实际意义，对植物病害防治其他领域也有指导作用。与通过其他抗稻瘟菌策略获得的抗性株系相比，本发明具体优势如下：

(1) 目前的抗稻瘟病基因多数是水稻内源基因，p3作为病毒蛋白能够提高水稻对稻瘟病的抗性，丰富了抗稻瘟病基因资源。

(2) 正因为p3基因不是水稻内源抗性基因，所以它的抗性机制可能与其他抗性基因不同，有助于人们对水稻抗稻瘟菌机理和稻瘟菌致病机理的理解。

附图说明

图1：含有p3基因的载体的构建图谱。

图2：转p3基因水稻的DNA PCR检测图谱。

图3：转p3基因水稻的Northern blot检测图谱。

图4：转p3基因水稻的抗稻瘟病鉴定显示接种后的叶片。

图5：转p3基因水稻的抗稻瘟病鉴定显示接种后叶片的坏死斑数量差异。

图6：转p3基因水稻的抗稻瘟病鉴定显示接种后叶片的坏死斑大小差异。

具体实施方式

本发明所转水稻品种为日本晴。

1.    重组农杆菌的获得

(1) p3克隆及载体构建

本发明通过GenBank中的RSV p3序列分析，设计如下引物用于从田间采集的RSV侵染水稻病株中扩增得到p3基因序列，引物设计时已加入酶切位点，用于将p3基因重组到双元表达载体pCV1300中。引物序列如下：

P3 (+):  5’- T TCTAGA ATGAACGTGTTCACATCGTCTGT -3’

P3 (-):  5’- G GGATCC CTACAGCACA GCTGGAGAGCT -3’。

(2) 转化农杆菌

取-70 ℃保存的EHA105农杆菌感受态，置冰上融解。取1μl抽纯pCV-P3-C质粒加入到100 μl感受态中，混匀，加入到处理好的电击杯。设置2200V电压，电击转化。点击完成加入900 μl的液体培养基（YEP）。28 ℃，200 rpm摇床培养1.5 h，菌液涂布在含50 μg/ml卡那霉素 (Kan) 和100 μg/ml利福平 (Rif) 平板上，28 ℃培养至形成单菌落。

(3) 阳性克隆的鉴定与保存

挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50 μg/ml Kan、100 μg/ml Rif的液体培养基中，28 ℃，200 rpm摇培16 h，取1μl菌液进行PCR检测。检测引物为P3(+)、P3(-)。取检测结果为阳性的菌液，混合15-30%甘油，置甘油管中，于-70℃超低温冰箱中保存，备用。

PCR体系如下：

2×Taq Master Mix10μlP3(+) (10 μmol/L )0.3μlP3(-) (10 μmol/L )0.3μl菌液1.0μl无菌去离子水8.4 μl 20 μl

混匀后按以下条件进行PCR循环：

2. 农杆菌介导的水稻遗传转化

本发明是利用水稻成熟胚进行的遗传转化。具体操作过程如下：

(1) 菌液的准备

取-70 ℃保存的阳性转化菌株，于含50 μg/ml卡那霉素 (Kan) 和100 μg/ml利福平 (Rif) 平板上划线，28 ℃培养至形成单菌落，挑取单菌落于含50 μg/ml Kan、100 ug/ml Rif的YEP液体培养基中培养，28℃，220rpm振荡培养24 h；将菌液按1:100用YEP 培养基稀释，继续震荡培养至OD₆₀₀为0.6左右。

(2) 水稻成熟胚愈伤组织的诱导与培养

取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子。将种子放入100 ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1min，无菌水洗3-5遍，直到没有酒精味道；加入50 ml 20%次氯酸钠（NaClO）溶液，浸泡30min；倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30min；种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿9-12颗；操作完毕用封口膜（Micropore ^TM Surgical Tape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，培养3周左右；在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周。

(3) 愈伤组织与农杆菌的共培养

收集菌体，用含200 μmol/L As的AAM感菌液制成悬浮液，使菌液OD₆₀₀的终浓度为0.1左右；将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5min；将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40min；将愈伤组织置于共培养基上。26℃暗培养2.5d。

(4) 抗性愈伤的筛选与分化

将愈伤组织取出，用无菌水清洗1遍，再用含500 mg/L头孢拉定（或头孢噻肟钠）的无菌水浸泡30 min，清洗3-5遍，置于无菌滤纸上沥干2h。随后将晾干的愈伤转入选择培养基上进行第一轮选择，28℃，光照培养14d；将长有抗性愈伤的初始愈伤进行第二轮选择，28℃，光照培养，直到颗粒性的抗性愈伤组织长出；挑取颜色鲜黄的颗粒类抗性愈伤3-4颗，移入装有分化培养基的塑料广口瓶中，放入恒温培养室中，等待分化成苗（15-30d）。

(5) 生根壮苗和移载

当抗性愈伤组织分化的芽长至约2 cm时，将小苗移到生根培养基上，培养两周左右。选择高约10 cm、根系发达的小苗，洗去培养基，在温室内移栽入土。

3. 转基因再生水稻的分子生物学检测

(1) PCR检测

用CTAB法提取转基因再生水稻的基因组DNA。取再生水稻叶片一小段放入2ml EP管，用液氮快速振荡成粉末，加入500 μl 2×CTAB，剧烈震荡。65℃水浴20-30min，每10min上下混匀一次。然后加入等体积氯仿，剧烈混匀。12000 rpm离心10min，取上清至新的EP管中。加入1/10体积的醋酸钠（NaAc, 3M, pH 5.2）和等体积的异丙醇，颠倒混匀。12000 rpm离心10 min。去上清，沉淀用70%乙醇洗涤，12000 rpm离心10 min。去上清，沉淀室温干燥10 min，然后加入30-50μl的ddH₂O进行溶解。然后取0.5μl的DNA作为模板，进行PCR检测。检测结果如图3所示。检测引物序列如下：

P3 detect (+):ATGAACGTGTTCACATCGTCTGTP3 detect (-):CTACAGCACA GCTGGAGAGCT

(2) Northern blot分析

探针制备：用DNA纯化试剂盒回收P3扩增片段，引物(primer(+):GATCTGACCAGTTTGAGCATA,primer(-):TGGCACAATGTAGAGCTCTG)。取10μgDNA加ddH2O定容至16μl。沸水变性10min，冰置2min。加入4μl DIG-High Prime(Vial 1)，混匀并离心，37℃水浴过夜。加入2μl 0.2M EDTA(PH8.0)终止反应。参照Roche的DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ说明书进行。

RNA样品制备：用Trizol抽提植物总RNA，方法如前。取同样RNA量，定溶至15μl，加入15μl去离子甲酰胺(公司)，混匀后75℃变性5min，冰置2min，加入0.3μl稀释一定倍数的EB。

甲醛变性电泳：用1×MOPS配制1.5%琼脂糖凝胶，待溶液温度低于65℃后每10ml里面加入570μl甲醛。用3-4V/cm电压电泳3-4h。电泳后UV灯下观察拍照。

转膜：用20×SSC浸泡20min，2次去除甲醛。用一张3MM的Whatman滤纸塔在玻璃板上浸泡在20×SSC中做为桥，将正面向下放置滤纸上，去除两层间的气泡，将20×SSC浸泡好的硝酸纤维膜放置在胶上面，赶走胶与膜间的气泡，标记好正反面及点样顺序。在硝酸纤维膜上放上与其大小相同的滤纸3～5张，赶除气泡；凝胶四周用防水的胶条封好，避免短路，放上略小于纤维膜的吸水纸约5～8 cm，压上重物，转膜12-16 h左右，更换吸水纸1-2次。

固定：转膜结束后，翻转取出硝酸纤维膜， 2×SSC溶液中洗膜5 min，用滤纸吸干并夹好，放80℃，2 h。

预杂交：将固定好的膜用杂交袋包好，加入适当体积杂交液，口封好后37℃ 30 min。

杂交：制备好的探针沸水煮5 min，冰置5 min。根据膜大小取适量的探针加入一定体积的杂交液，混匀。取出预杂交后的膜用杂交袋包好，加入混有探针的杂交液，口封好后37℃ 过夜。

洗膜：用2×SSC含有0.1% SDS洗膜2次，各10 min，37℃杂交炉转动；0.5×SSC含0.1%SDS在37℃条件下洗膜2次，各20 min，37℃杂交炉转动。

检测：洗后的膜用冲洗缓冲液漂洗5 min；用Blocking Solution 中封闭至少30 min；在抗体溶液中反应至少45min；用冲洗缓冲液洗3次，每次摇床上10min; 在20 ml检测缓冲液中平衡2-5 min；膜的正面朝上放到杂交袋中，加入1 ml CSPD并快速将杂交袋覆盖在膜上，让底物均匀扩散，不能有气泡，室温放置2-5 min；挤去液体，用封口机封口，37℃温育10 min，暗室里暴光显影数分钟，以信号强弱而定。

检测结果如图3 所示。

(3) 转基因水稻抗性鉴定

本发明中对转p3基因水稻进行了抗稻瘟菌分析。

接稻瘟菌步骤：

转基因水稻及未转基因幼苗：光/暗育苗14d的转基因水稻幼苗 (三叶期) 用于接种，12株苗/营养钵。

孢子液准备：26°C下，16/8 h光/暗培养10d的稻瘟病菌CM平板，用0.25%明胶水洗取孢子，3层滤纸过滤，孢子悬浮液稀释至所需浓度（104-105/ml）。

用小型喷雾器将孢子液均匀喷布于水稻苗上，每营养钵用等量孢子液；每处理（菌株）3-5个重复。22°C，黑暗保湿48h；然后将接种苗置于26°C，相对湿度84%，900 E/m2光照条件下培养。7d后，观察并记录发病情况；实验重复3次 。鉴定结果表明（如图4 所示），所选用的5个株系（51、52、55、56、59）均对稻瘟病表现出一定的抗性，表现在坏死斑数量减少、坏死斑大小减少，从而表明转p3基因对稻瘟病表现高度抗性。

<110>浙江省农业科学院

<120>水稻条纹病毒P3基因及其表达载体、宿主细胞、植物受体细胞或组织和应用

<130>无

<140>

<141>

<160> 1

<210> 1

<211> 636

<212> DNA

<213> Oryza sativa

<400> 1

1        ATGAACGTGT TCACATCGTC TGTGGGTTCT GTGGAATTTG ATCATCCTCT GCTTTTGGAG

61       AATGATCTGA CCAGTTTGAG CATAAACTGT GATGATGTCC ATTGCTCTTC AAGAGCCTTA

121      TGTTATATAT ATGACATTCA CTCATCTAGG CACCCTTCCA TTGATGAACA TCAGTTTCTG

181      AGGCTTCTCC ATGGCCCTGA TGATGCTGTC ACTCTAGGCT CCTTCTTGAA AACTCTTATC

241      TGGATTCTGT CCCATGATAA GAATCTCCCA GAAGAGTACA GACTTCCTAC TATAATGATG

301      TCATCCTCAT ATGTGAAGTT CTTCACTGAA GTGAAGCCAA GACCCCCATC AACAAATTGC

361      TGGACATGCA GAATGTCCAA AGACAATTTG CCCTTTACCG TTCCTAGCGT CAAGGGATTT

421      CCTCCAGATG CAGAGCTCTA CATTGTGCCA ATATCTGACC ATGATGGAAA GCCTGTCAAA

481      TTTGACAATA GGAAGACTCT ATATAGATCA CCTAGTAAGA AAAGGCATAA GTATGTCATT

541      TCTTCTGATA AACCACCTCT TAGTGCACGT TATGTTAAGT ACGTTGATTC TAGTGTACTA

601      GAACCCTCAC CAGGCAGCTC TCCAGCTGTG CTGTAG