一种剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法

摘要

一种剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法，包括如下步骤：（1）取剑叶龙血树种子作为外植体进行消毒；（2）将消毒后的外植体置于MS基本培养基中诱导发芽得到无菌试管苗；（3）将所述无菌试管苗置于MS繁殖培养基中进行试管苗快速繁殖培养获得丛生芽；（4）将所述丛生芽置于MS壮苗培养基中进行壮苗培养得到健壮植株；（5）将所述健壮植株置于MS生根培养基中培养得到完整的带根苗；（6）取完整的带根苗进行炼苗后移植于沙床生长一个月，再移栽至大田。采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树丛生芽增殖系数达到10-15倍，获得的组培苗生根率在95%以上，移栽苗床成活率在90%以上，有效解决了剑叶龙血树的规模化育苗问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种植物繁殖方法，特别是一种剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法。

背景技术

剑叶龙血树又名千年木、血竭树、交趾龙血树，是渐危种，属国家二级保护植物，2003 年被国际自然与自然资源保护联合会划归为易受危害的物种列为红色名单，被定为佛得角红 皮书中的濒危物种，是目前国内公认的国产龙血竭的基源植物。

血竭是一种名贵传统中药，在我国的使用历史已有1500年以上。据《本草纲目》记载， 龙血竭性温、平，味甘、咸，无毒，入血分，归肺、脾、肾三经，具有活血化瘀、消肿止痛、 收敛止血，软坚散结、生肌敛疮等显著功效，被誉为活血圣药。现代医学研究证实，血竭具 有改善机体微循环、调整机体新陈代谢、改善机体免疫功能等作用。

虽然血竭在国内的使用历史悠久，但在1972年以前一直是依靠东南亚和非洲进口，价 格十分昂贵。1973年蔡希陶先生在云南思茅地区孟连县境内的石灰山上发现了大片可以产生 血竭的龙血树，才暂时缓解了我国血竭的资源压力，从而诞生了国产龙血竭的历史。但是龙 血树的生长非常缓慢，一年之内树干增粗还不到1厘米，龙血竭又为龙血树受伤后流出的红 色液体，产量非常有限。而且随着医药观念的转变，越来越多的人群倾向于使用传统中医药 来防病治病，中药资源的用量急剧上升，越来越多的药用植物趋于稀缺，甚至濒危。近年来， 市场对龙血竭需求的不断扩大，目前龙血竭价格已涨到1000-1300元/kg，致使人们对剑叶 龙血树野生资源实施了不合理的掠夺性采伐，剑叶龙血树野生资源日趋枯竭，濒危灭绝，已 经被国际上很多国家列为珍稀濒危保护植物。

为了加强龙血竭基源植物保护，防止剑叶龙血树的濒危灭绝，实现资源的可持续利用， 需要大力推广剑叶龙血树的栽培种植。在种苗繁育上，剑叶龙血树可通过种子、扦插或分蘖 繁殖，但这种常规方法的繁殖速率低，所需时间长，所得的种苗数量非常有限，生产上难以 实现大面积栽培。而采用生物技术组织培养技术，可以有效快速地提高剑叶龙血树种苗的繁 殖速度和质量，实现剑叶龙血树优质种苗的工厂化育苗，以满足生产上的需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法，它能够快速繁殖出大量 适合移栽的优良剑叶龙血树种苗、满足生产需要。

本发明通过以下技术方案达到上述目的：一种剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法，包 括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：取剑叶龙血树种子作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸 泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、 无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌 的蒸馏水；

（2）种子萌发获得无菌试管苗：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培 养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种 子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的 吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（3）试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤（2）中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养 基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30 天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含1.0-5.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、 0.1-0.5mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-2.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培 养基的pH值为5.8；

（4）丛生芽壮苗培养：将步骤（3）中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在 培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到 健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5-1.5mg/L的吲 哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（5）健壮植株生根培养：将步骤（4）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培 养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带 根的完整植株，其中MS生根培养基中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.5mg/L的生 根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（6）炼苗与移栽：步骤（5）获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖， 在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移 栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。

本发明的突出优点在于：

（1）采用生物技术对剑叶龙血树进行组织培养快速繁殖，通过剑叶龙血树丛生芽的繁 殖，在短时间内可培育出大量适合栽培种植的剑叶龙血树幼苗，显著提高了剑叶龙血树种苗 的增殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。

（2）在MS繁殖培养基中添加的6-苄基腺嘌呤6-BA、吲哚乙酸IAA和激动素KT属于化 学合成物质，价格较为便宜，可大大降低剑叶龙血树组织培养的成本消耗，达到降低成本的 目的；

在MS繁殖培养基中添加1.0-5.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.1-2.0mg/L的激动素可 促进丛生芽的分化；添加浓度为0.1-0.5mg/L的生长激素吲哚乙酸IAA可促进丛生芽的生长；

在MS壮苗培养基中添加浓度为1.0-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA和0.5-1.5mg/L的吲 哚乙酸IAA可促进丛生芽的再次增殖及长高展叶；

在MS生根培养基上组合使用浓度为0.1-1.0mg/L的生长激素IAA和0.1-0.5mg/L生根 粉ABT，可获得带根的完整植株，这些植株经炼苗后可直接移栽沙床。

（3）采用本发明所述的培养方法得到的剑叶龙血树丛生芽增殖系数达到10-15倍，丛 生芽经过复壮后，接种到含有生根粉IAA、ABT的生根培养基上，获得的组培苗生根率在95% 以上，移栽苗床成活率在90%以上；快速、便捷、高效地进行剑叶龙血树组织培养，实现剑 叶龙血树组培种苗的规模化生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

实施例1

本发明所述的剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：取剑叶龙血树种子作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸 泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、 无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌 的蒸馏水；

（2）种子萌发获得无菌试管苗：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培 养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种 子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的 吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（3）试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤（2）中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养 基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30 天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的 吲哚乙酸IAA、2.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8， 丛生芽增殖系数为9.2；

（4）丛生芽壮苗培养：将步骤（3）中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在 培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到 健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0-3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5-1.5mg/L的吲 哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽再次增殖的系数为 2.8；

（5）健壮植株生根培养：将步骤（4）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培 养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带 根的完整植株，其中MS生根培养基中含0.1-1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1-0.5mg/L的生 根粉ABT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为90.6%；

（6）炼苗与移栽：步骤（5）获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖， 在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移 栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。

实施例2

本发明所述的剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法的另一个实例，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：取剑叶龙血树种子作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸 泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、 无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌 的蒸馏水；

（2）种子萌发获得无菌试管苗：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培 养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种 子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的 吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（3）试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤（2）中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养 基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30 天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.5mg/L的 吲哚乙酸IAA、2.0mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8， 丛生芽增殖系数为17.9；

（4）丛生芽壮苗培养：将步骤（3）中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在 培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到 健壮植株，其中MS壮苗培养基中含2.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、 30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽再次增殖的系数为4.1；

（5）健壮植株生根培养：将步骤（4）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培 养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带 根的完整植株，其中MS生根培养基中含0.55mg/L的吲哚乙酸IAA、0.3mg/L的生根粉ABT、 30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为94.4%；

（6）炼苗与移栽：步骤（5）获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖， 在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移 栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。

实施例3

本发明所述的剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法的再一个实例，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：取剑叶龙血树种子作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸 泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、 无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌 的蒸馏水；

（2）种子萌发获得无菌试管苗：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培 养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种 子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的 吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（3）试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤（2）中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养 基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30 天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.3mg/L的 吲哚乙酸IAA、1.05mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8， 丛生芽增殖系数为15.2；

（4）丛生芽壮苗培养：将步骤（3）中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在 培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到 健壮植株，其中MS壮苗培养基中含3.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的吲哚乙酸IAA、 30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽再次增殖的系数为5.0；

（5）健壮植株生根培养：将步骤（4）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培 养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带 根的完整植株，其中MS生根培养基中含1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.5mg/L的生根粉ABT、 30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为98.2%；

（6）炼苗与移栽：步骤（5）获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖， 在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移 栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。

实施例4

本发明所述的剑叶龙血树的组织培养快速繁殖方法的又一个实例，包括以下步骤：

（1）外植体的选择与消毒：取剑叶龙血树种子作为外植体，依次用2%洗洁精水溶液浸 泡5min、线状自来水冲洗15-30min、添加了2-3滴吐温-20的100毫升0.1%升汞消毒8-10min、 无菌水冲洗3-5次，最后用消毒滤纸除去表面水分，得到外植体，其中无菌水为经高压灭菌 的蒸馏水；

（2）种子萌发获得无菌试管苗：将步骤（1）得到的外植体接种到MS培养基中，在培 养温度为23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养30天，种 子发芽后获得无菌试管苗，其中MS培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.2mg/L的 吲哚乙酸IAA、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8；

（3）试管苗丛生芽快速繁殖培养：将步骤（2）中得到的无菌试管苗置于MS繁殖培养 基中，在培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为8-10小时/天的条件下培养30 天得到试管苗丛生芽，其中MS繁殖培养基中含,5.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、0.1mg/L的 吲哚乙酸IAA、0.1mg/L的激动素KT、30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8， 丛生芽增殖系数为14.3；

（4）丛生芽壮苗培养：将步骤（3）中得到的试管苗丛生芽置于MS壮苗培养基中，在 培养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养20天得到 健壮植株，其中MS壮苗培养基中含1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤6-BA、1.5mg/L的吲哚乙酸IAA、 30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，丛生芽再次增殖的系数为3.8；

（5）健壮植株生根培养：将步骤（4）中得到的健壮植株置于MS生根培养基中，在培 养温度23-27℃，光照强度1500lux，光照时间为12-14小时/天的条件下培养35天得到带 根的完整植株，其中MS生根培养基中含1.0mg/L的吲哚乙酸IAA、0.1mg/L的生根粉ABT、 30g/L蔗糖和3.4g/L的琼脂，培养基的pH值为5.8，生根率为96.7%；

（6）炼苗与移栽：步骤（5）获得带根的完整植株后，在室温为25℃的室内打开瓶盖， 在瓶中加入少量自来水，炼苗2-4天，表面角质形成后将苗取出，洗净根部培养基，立即移 栽到沙床中，在沙床中生长一个月后移栽大田。