艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明提供了一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的特异性引物和探针组成；本发明的有益效果主要体现在：本发明针对艰难梭菌毒素基因提供了一种快速、敏感、特异的多重荧光PCR检测试剂盒和检测方法，为区分艰难梭菌产毒株与无毒株、及其艰难梭菌感染的早期诊断提供了基础。

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒及检测 方法。

（二）背景技术

艰难梭菌（Clostridium difficile）为革兰阳性厌氧产芽孢杆菌，是人 类肠道中的正常菌群之一，广泛分布于自然环境和动物粪便中。艰难梭菌 自身没有侵袭性，但当大量服用广谱抗生素、免疫抑制剂、质子泵抑制剂 或化疗药物后使其肠道一些其他正常菌群受到抑制，艰难梭菌在肠道内大 量繁殖，其中部分产毒株可通过分泌毒素A、毒素B引起抗生素相关性 腹泻、结肠炎甚至伪膜性肠炎。部分高产毒力株产生二元毒素将导致疾病 发生率和复发率增高，更需重视的是提高了疾病的严重性和致死性。据报 道25%～30%抗生素相关性腹泻是由艰难梭菌引起的，而伪膜性肠炎则几 乎100%由艰难梭菌所致。

在过去二十年中艰难梭菌出现了发病率、严重程度和复发率上升的趋 势，所有这些都与预后不佳有关，并已成为欧美排名第1的“超级臭虫”。 现在美国已将艰难梭菌感染与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素的 肠球菌并列于美国三大医院获得性感染之列。根据国外经验，为控制艰难 梭菌的广泛传播，最重要的是发展更为敏感和快速的检测方法，以及时发 现，及早诊治。艰难梭菌的传统检测方法为粪便培养加细胞毒素测定，但 其检测周期长，不能满足临床对快速检测的需要。谷氨酸脱氢酶（GDH） 测定法为检测艰难梭菌表面大量表达的抗原性酶蛋白，其稳定性好、敏感 性高，但特异性差，无法区分艰难梭菌产毒株与无毒株。酶免方法（EIA） 具有快速可行性。但其敏感性为60%至70%，特异性为98%。鉴于其敏 感性适中，当EIA检测阴性而临床症状明显时，常选用其他敏感性更高 的方法进行验证检测。因此，实验室开发一种快速、特异、灵敏的艰难梭 菌毒素基因检测方法意义重大。实时荧光定量PCR是近几年发展起来的 新型检测技术，具有快速、准确、可定量等优势，其中TaqMan探针、 TaqMan-MGB探针、复合探针、染料及分子信标等方法目前已成功应用 到病原菌分子诊断领域。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种艰难梭菌四种相关毒素基因的多重荧光PCR 检测试剂盒及检测方法。

本发明采用的技术方案是：

一种艰难梭菌毒素基因多重荧光PCR检测试剂盒，主要包括特异性 引物和探针以及PCR反应试剂，所述特异性引物和探针由艰难梭菌毒素 A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB） 的特异性引物和探针组成，所述特异性引物和探针序列如下：

tcdA上游引物:5′-TCAGGAGTTGTTAAATCGTGGAAA-3′；

tcdA下游引物:5′-CAGAGTGAATACCTGGAAGCATATCA-3′；

tcdA荧光探针:5′-FAM-CTGCAGCATCTGACATAG-BHQ1-3′；

tcdB上游引物:5′-GATAATATTTACGGACAAGCAGTTGACT-3′；

tcdB下游引物:5′-AGTCTCAATTGTATAGGTTTCTCCAAAA-3′；

tcdB荧光探针:5′-VIC-AGCGGTTTAGTTAGAGTTG-BHQ1-3′；

cdtA上游引物:5′-TGGGAAGCACTATATTAAAGCAGA-3′；

cdtA下游引物:5′-ACATCAGCAAGTTCATTAGGTGTT-3′；

cdtA荧光探针:

5′-ROX-TTTGCTTTACCCCAAGARTCCCCCT-BHQ2-3′；

cdtB上游引物:5′-ATTTCTTTGACCCAAAGTTGATG-3′；

cdtB下游引物:5′-CCCACTTAACTGCAATTAAGTCC-3′；

cdtB荧光探针:

5′-CY5-TGATTGGGAAGACGAAGATTTGGAT-BHQ2-3′；

其中FAM、VIC、ROX和CY5为不同波长的荧光报告基团，BHQ1 和BHQ2为荧光淬灭基团。

本发明的关键在于扩增引物的设计，试剂盒中其他组成，可按本领域 常规进行选择。PCR反应试剂包括PCR缓冲液、脱氧三磷酸核苷混合物 和DNA聚合酶等，其中PCR缓冲液可采用市购商品，也可自行配制， 例如将Tris-HCl、KCl、MgCl₂等按比例混合进行配制，进行检测时，将 PCR反应试剂和扩增引物和探针混合，再加入待测样品或对照品，即可 进行PCR扩增反应。

为达到定量检测的要求，所述试剂盒中还可包括艰难梭菌毒素A （tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的 标准品，所述标准品序列如下：

tcdA标准品：

tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttg

gcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg；

tcdB标准品：

gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaa

acctatacaattgagact；

cdtA标准品：

tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaagggg

gattcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt；

cdtB标准品：

atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccagat

tcatatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。

可将上述序列构建到质粒载体中，以标准品的梯度浓度的DNA溶液 进行荧光PCR检测，根据拷贝浓度的对数值与标准品Ct值的关系可绘制 得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照标准曲线即可获得样品 DNA的拷贝浓度。

本发明还涉及利用所述试剂盒检测艰难梭菌毒素基因的方法，所述方 法包括：

（1）提取待测样品DNA；

（2）以待测样品DNA为模板，加入艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B （tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）的特异性 引物和探针，PCR缓冲液，脱氧三磷酸核苷混合物和DNA聚合 酶配制PCR反应液，进行PCR扩增，以非靶细菌为阴性对照于 相同条件下进行PCR扩增；

（3）PCR扩增产物进行荧光检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照 的最高点设定阈值线，若待测样品荧光增长曲线超过阈值线， 并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

定量检测时，所述方法同时以艰难梭菌毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、 二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）标准品的梯度浓度的DNA溶 液进行荧光PCR检测，分别根据拷贝浓度的对数值与各标准品Ct值的关 系绘制得到标准曲线，测得样品DNA的Ct值后，对照相应标准曲线获 得样品DNA中相应基因的拷贝浓度；所述标准品序列如下：

tcdA标准品：

tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaattttg

gcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg；

tcdB标准品：

gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggagaa

acctatacaattgagact；

cdtA标准品：

tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaagggg

gattcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt；

cdtB标准品：

atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccagat

tcatatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。

优选的，所述PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45 秒进行40个循环扩增，最后置4℃，荧光采集在每个循环的退火温度时 进行。

本发明的有益效果主要体现在：本发明针对艰难梭菌毒素基因提供了 一种快速、敏感、特异的多重荧光PCR检测试剂盒和检测方法，为区分 艰难梭菌产毒株与无毒株、及其艰难梭菌感染的早期诊断提供了基础。

（四）附图说明

图1为四种标准品检测结果；A：tcdA；B：tcdB；C：cdtA；D：cdtB； 1～5分别为30ng/μL、3ng/μL、0.3ng/μL、30pg/μL、3pg/μL标准品；

图2为四种毒素基因对应的标准曲线；A：tcdA；B：tcdB；C：cdtA；D： cdtB；

图3为阳性菌株与合成模版的检测结果；1为tcdA基因；2为tcdB基因； 3为cdtA基因；4为cdtB基因。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围 并不仅限于此：

实施例1：标准品的获得

1、材料：

pGEM-T-Easy克隆系统、PCR相关试剂及Taq DNA聚合酶购自美国 Promega公司，377型测序仪（ABI公司）、Bio-Rad icycler PCR仪（Bio-Rad 公司）、ABI7500fast定量PCR仪（ABI公司）。

2、引物及探针设计与合成：

以艰难梭菌tcdA（GenBank注册号为JQ809336.1）、tcdB（GenBank 注册号为JQ809336.1）、cdtA（GenBank注册号为HQ639678.1）和cdtB （GenBank注册号为HQ639678.1）基因为模板，使用Primer Express TM （V3.0，美国ABI公司）软件分析TaqMan引物和探针位点，从中选择 最佳组合。由上海辉睿生物科技有限公司进行引物和探针的合成与纯化。

3、阳性参考品的制备：

以艰难梭菌标准株（ATCC43598）以及二元毒素A（cdtA）（GenBank 注册号为HQ639678.1）、二元毒素B（cdtB）（GenBank注册号为 HQ639678.1）合成寡核苷酸序列做为模板，用DNA提取试剂提取基因组 DNA，用分光光度计测定浓度，取1.0μL（50ng/μL）做PCR反应模板， 分别上述的上下游引物在Bio-Rad icycler PCR仪上进行PCR扩增：

PCR反应液组成如下：

PCR条件为：94℃5分钟变性，94℃30秒、55℃30秒、72℃30秒 进行35个循环扩增，最后于72℃延伸5分钟后置4℃。

PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后即用克隆系统插入 pGEM-T-Easy克隆载体，并将阳性克隆经测序验证。艰难梭菌毒素A （tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB）基 因对应的片段长度分别为1119bp、92bp、141bp和126bp片段，即为标准 品，测定浓度并换算成质量/体积。

4、结果：

经测序，上述设计标准品完全与预期相符，回收的标准品片段序列如 下：

tcdA基因标准品序列：

tcaggagttgttaaatcgtggaaatttagctgcagcatctgacatagtaagattattagccctaaaaaatttt ggcggagtatatttagatgttgatatgcttccaggtattcactctg。

tcdB基因标准品序列：

gataatatttacggacaagcagttgactatagcggtttagttagagtggtgaagatatatattattttggaga aacctatacaattgagact。

cdtA基因标准品序列：

tgggaagcactatattaaagcagaagcatctgttgtaagtagtcttgattttaaagatgatgtaagtaaggg ggattcttggggtaaagcaaattataatgattggagtaataaattaacacctaatgaacttgctgatgt。

cdtB基因标准品序列：

atttctttgacccaaagttgatgtctgattgggaagacgaagatttggatacagataatgataatataccag attcatatgaacgaaatggatatactattaaggacttaattgcagttaagtggg。

实施例2：多重荧光定量PCR法检测艰难梭菌四种相关毒素基因方 法的建立

1、质粒DNA及其他细菌DNA提取：

采用基因组DNA提取试剂提取细菌基因组DNA，采用质粒DNA提 取试剂盒提取阳性质粒DNA，分别取1.0μL（50ng/μL）做模板，用检测 用上下游引物在ABI7500fast定量PCR仪（ABI公司）上进行PCR扩增。

PCR反应液组成如下：

PCR反应条件为：95℃预变性5分钟，95℃15秒、60℃45秒进行40 个循环扩增，最后置4℃，荧光采集在每个循环的退火温度时进行。

以非靶细菌志贺菌（ATCC04121）为阴性对照于相同条件下进行PCR 检测，以阈值线刚好超过正常阴性对照的最高点设定阈值线；若待测模板 荧光增长曲线超过阈值线，并呈良好的对数增长，则判断为阳性。

同时在相同条件下以不同浓度标准品进行检测，并绘制标准曲线。

待测DNA的测定结果经仪器处理根据标准曲线计算出检测艰难梭菌 毒素A（tcdA）、毒素B（tcdB）、二元毒素A（cdtA）和二元毒素B（cdtB） 基因的数量。

以肠出沙门氏菌（CICC21490）、血性大肠杆菌（ATCC43889），致病 性大肠杆菌（ATCC43887），肠产毒性大肠杆菌（ATCC35401），肠侵袭 性大肠杆菌（ATCC43893），创伤弧菌（CICC10383）按照上述方法进行 检测，结果均为阴性，说明本发明方法特异性好。

2、检测结果

标准品检测结果参见图1（A、B、C、D），标准品浓度分别为1：30ng/μL、 2：3ng/μL、3：0.3ng/μL、4：30pg/μL、5：3pg/μL标准品，标准曲线参 见图2。

图2为四种毒素基因对应的标准方程，其中图中标注与四种基因荧光 探针标记类型对应，其中tcdA基因标准方程（FAM）（图2-A）：Y＝ -3.3094×lgX＋39.879，R²=0.9998；tcdB基因标准方程（VIC）（图2-B）： Y＝-3.3624×lgX＋37.2423，R²=0.9991；cdtA基因标准方程（ROX）（图 2-C）：Y＝-3.2434×lgX＋40.6222，R²=0.9976；cdtB基因标准方程（CY5）) （图2-D）：Y＝-3.1730×lgX＋39.4229，R²=0.9971。Y：对应的Ct值； X：基因的质量数。

阳性菌株与合成模版的检测结果见图3。其中1为tcdA基因，Ct值 为23.98，基因浓度为63.10ng/μL；2为tcdB基因，Ct值为25.56，基因 浓度为2.978ng/μL；3为cdtA基因，Ct值为26.35，基因浓度为25.12ng/μL； 4为cdtB基因，Ct值为28.92，基因浓度为2.041ng/μL。