一种利用制浆废液生产单细胞蛋白的方法

摘要

本发明涉及一种利用制浆废液作为酵母营养源高得率生产单细胞蛋白的工艺方法。研究发现加碱量少，不加蒽醌、硫化物等有毒助剂的制浆工艺，产生的废液量少、碱度低、营养物含量高，中和用酸量低，盐浓度低，可不经脱毒及稀释处理就很适合微生物生长。用COD为100000mg/L的废液原液经酸化后，可直接利用其中的碳源等营养成分培养酵母，生产的单细胞蛋白产量最高可达8.42g/L，蛋白含量最高可达52.42％，氨基酸含量为39.82％，富含20种必须氨基酸，发酵后废液的COD去除率能达到60％左右，其中的N、P、K也可以大部分利用。本发明特别适合我们前期所发明的制浆新工艺的黑液利用，为植物全价开发及高附加值利用开辟了新途径。使得从制浆废液中提取木质素后的残余液再作为酵母营养源成为可能，高收率的单细胞蛋白可直接用作饲料及缓控释肥料，不但有效的降低了废液的COD，同时大大减轻了后处理负荷，可以打造更有价值的产业链。

说明书

技术领域

本发明涉及一种单细胞蛋白的生产方法，具体是利用碱法制浆废液中 的还原糖、低聚糖、可溶性纤维、N、P、K等营养成分在优化的培养条件 下可以通过培养酵母生产单细胞蛋白。

背景技术

本研究希望对我们前期开发的碱法制浆新工艺(专利公开号 CN102337687A)产生的废液作为酵母营养源的可行性进行探索。该制浆工 艺及半化学浆工艺具有用碱量少，未添加蒽醌、硫化物等有毒助剂，产生 的废液量少，废液的碱度低，富含N、P、K有机物等营养物质，且中和用 酸量低，盐浓度低，不用脱毒，较高浓度下也许适合微生物生长的优势， 可望开发为植物、微生物和藻类等生物营养源。

传统碱法制浆工艺由于用碱量大，加入了大量的硫化物、蒽醌等有毒 助剂，导致纤维提取率低，黑液中溶解了相当量的木质素、水解的纤维素、 半纤维素、蛋白质、糖、单宁、核酸、钾盐等有用的物质。黑液碱度高， 中和用酸量大，且产生恶臭及大量无机盐。含高钠离子浓度的黑液也难生 化处理和被植物利用，曾有人将制浆黑液直接或浓缩做肥料，但黑液中无 机盐含量高，易造成土壤板结和盐碱化，特别是大量钠离子的存在会影响 植物对钾的吸收和植物的正常生长，因此作为肥料存在很大问题。

制浆废液因其强碱性，含硫化物及木质素均会抑制微生物生长，直接 生化处理很难达标。虽然也有人利用制浆废液或者废纸进行过发酵培养微 生物的下述探索，但需要大量的酸或碱进行中和脱毒处理，且普遍存在利 用效率不高。徐世袁采用亚硫酸盐制浆废液发酵制取酒精(徐世袁.富含戊 糖的亚硫酸盐制浆废液的酒精发酵方法.中国：92107774.2，1993.04.28.)； 朱明军等人利用废纸浆发酵生产酒精，采用同步糖化与发酵工艺，利用葡聚 糖酶(Spezyme CP或者AccelleraseTM，Genencor International，Inc) 和β-葡萄糖苷酶(Novozyme 188)水解制浆中的纤维素、半纤维素为葡萄 糖，并向发酵培养基中添加玉米浆及硫酸镁等成分，发酵时间为96h，酒精 产量最高可达40g/L(朱明军，梁世中.一种利用废纸浆发酵生产能源酒精 的方法.中国：200810198428.6，2009.02.04.)；张肇鉻等人采用光合细菌 来处理造纸废水，采用对硫化物耐受性很强的木霉突变菌CGMCC NO 0191 和光合细菌混合培养物CGMCC NO 0192，利用木霉菌将黑液中的纤维素、半 纤维素转化为有机酸然后絮凝沉淀去除木质素，取上清液发酵生产单细胞 蛋白(张肇鉻，王梦亮.处理造纸废水的菌种及培养方法.中国：93119016.9， 1993.04.19)；钟聘将粗纤维与黑液和产酸微生物按比例充分混合，在自然 温度下进行长期贮池贮存发酵，即得中性黑液粗纤维粉发酵料，在向黑液 中中性黑液粗纤维粉发酵料中加入不同的菌种，即可得饲料或肥料(钟聘. 利用碱法造纸黑液制造肥料和饲料的方法及其发酵器.中国：97107378.3， 1997.12.10)；张莉等人利用造纸废液进行发酵制取单细胞蛋白，但是由于 黑液中残留化学物质会抑制微生物生长，因此在发酵前要进行预处理脱去 亚硫酸盐及糠醛等杂质(张莉，赵辛.造纸废液生产单细胞蛋白.环境导报， 1998，5：13-15)；关洁介绍过芬兰佩基洛流程即利用造纸废液生产单细胞 蛋白的方法，由于采用的造纸废液来源于亚硫酸盐法制浆技术，因此在发 酵前要对造纸废液进行脱出二氧化硫处理，发酵过程中也要补充钾、磷等 营养物质(关洁，用造纸废液生产单细胞蛋白的新方法-芬兰佩基洛流程介 绍.造纸科学与技术，1979，4：38-39)；马建华利用造纸厂的亚铵制浆废 液去毒后，添加适量的营养盐，接种酵母菌、霉菌交替培养，过滤或离心 提取单细胞蛋白(马建华，利用亚铵制浆废液生产单细胞蛋白.纸和造纸， 1993，4(2)：19-20)。尚未见英文中有利用造纸废水发酵生产单细胞蛋白 的文献报道。

目前碱法制浆黑液的主流处理工艺是通过浓缩、焚烧、苛化法处理， 回收套用大部分碱，虽部分解决了黑液的污染问题，但资源浪费严重，同 时产生大量二氧化碳、氮氧化物、二氧化硫、二噁英等二次污染废气及残 碱、硫化碱、硅铝酸盐等以碳酸钙为主的白泥废渣等，造成二次环境污染。 该黑液处理工艺存在设备投资大、成本高、能耗大。

用酵母培养单细胞蛋白是补充目前饲料和食品行业中蛋白严重不足的 有效途径，也是将无机氮转化为有机氮进行生物氮源补充的有潜力的生产 方法。特别是前期关于氨基酸可以释放土壤中的磷而不用施加磷肥，具有 氮磷双效肥作用的发现，使得利用生物废液和无机氮通过培养酵母发酵生 产单细胞蛋白进而生产双效肥更具广泛应用前景。因此单细胞蛋白的培养 已经受到了关注，研究报导不少。高玉荣利用了大豆废糖蜜生产单细胞蛋 白，通过对大豆糖蜜除杂、成分调整、灭菌、两段发酵、离心真空干燥获得 益生性单细胞蛋白(高玉荣.用大豆糖蜜生产益生性单细胞蛋白的方法.中 国：201010292389.3，2011.02.09.)；李丰伯利用啤酒废渣生产单细胞蛋白 (李丰伯.一种利用啤酒废渣生产单细胞蛋白的方法.中国： 201010169006.3，2010.10.06)；Zhang等人利用热带假丝酵母处理啤酒洗 槽废水的同时生产出了单细胞蛋白(Zhang Y M，Bruce E，Rittmann，Wang J L，et al.High-carbohydrate wastewater treatment by IAL-CHS with  immobilizedCandidatropicalis.ProcessBiochemistry，2005，40(1)：857- 863)；Zhao等人用莲果废汁发酵耐热、渗透突变的海洋酵母(新生隐球菌 G7a)生产单细胞蛋白(Chun-Hai Zhao，Tong Zhang，Zhen-Ming  Chi(2009).Single cell protein production from yacon extract using  a highly thermosensitive and permeable mutant of the marine yeast  Cryptococcus aureus G7a and its nutritive analysis.Bioprocess  Biosyst Eng.33：549556)还有人利用玉米皮、秸秆加酒糟、菠萝蜜等工 农业废弃物生产单细胞蛋白，都需要补加适量的碳源(例如淀粉、稀酸水 解液、废糖蜜等)、氮源(例如酵母浸膏、硫酸铵、玉米粉等)，磷源(磷 酸二氢钾)作为培养微生物的营养源。

本专利通过反复研究及工艺优化，开发了利用低碱制浆废液原液的品 质优势培养酵母发酵高得率生产单细胞蛋白的新工艺，整个过程不用脱毒 及稀释处理，更加经济环保。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用低碱制浆废液生产单细胞蛋白的方法，以 破解制浆废液难利用、难处理，污染环境的难题，实现废液的资源化利用， 生产高附加值的单细胞蛋白。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：利用制浆废液作为主要营 养源生产单细胞蛋白的方法，所述的制浆废液是化学制浆、半化学制浆的 纤维提余液，制浆过程所用的碱是氢氧化钠或氢氧化钾或石灰，但不能添 加硫化钠、蒽醌等有毒助剂。具体做法如下：

将上述来源的碱法制浆提余液直接用磷酸调pH至5-7.5，经离心分离 木质素后，取上清液作为微生物发酵培养基，适当补充碳源、氮源，经115 ℃灭菌20-30min后接入菌种产朊假丝酵母CICC1314种子培养液，酵母种 子培养液的添加量为制浆废液体积的5-10％，进行发酵培养40-96h，发酵 液经离心分离、洗涤收集菌体，于60℃真空干燥箱中干燥可得产品，24-48h 后可干燥至恒重。

上述方案中调节废液所用的酸最好是磷酸或纤维材料的磷酸水解液，析 出的木质素可以不分离，但会影响单细胞蛋白的品相和含量。采用制浆废 液原液不经任何脱毒及稀释处理，直接酸析后用作发酵培养基，不补充碳 源、氮源也可以得到单细胞蛋白，但是产量较低，经稀释及酸析处理后， 稍加补充氮源，蛋白含量可显著提高。不补充碳源也可以得到单细胞蛋白， 补充碳源可成倍提高单细胞蛋白的产量，所补充的碳源可以是葡萄糖、废 糖蜜、玉米浆及纤维材料的磷酸水解液等任何能被酵母利用的碳源，通常 添加量在20g/L以内。不补充氮源也可以得到单细胞蛋白，补充氮源单细 胞蛋白产量提高效果比补充碳源更明显，补充的氮源可以是尿素、硫酸铵 或者玉米浆，添加量为6g/L左右，尤以添加玉米浆或硫酸铵效果最佳。优 化发酵培养条件为发酵温度为28-35℃，33℃单细胞蛋白产量最高，培养 时间为40-96h，以40h最为经济。

本发明的有益效果：

1 本发明选用碱法制浆废液直接作为酵母的营养源可以高得率的发酵 生产单细胞蛋白，无须对制浆废液进行脱毒及稀释处理，不但可以少消耗 酸，少添加其他营养物质，还可以充分利用废液中的碳源(包括还原糖， 低聚糖，可溶性纤维素等)，氮源，无机盐等营养成分，同时生产出经济价 值较高的单细胞蛋白，产量最高可达8.42g/L，粗蛋白含量最高可达 52.42％，氨基酸含量可达39.82％，富含20种必须氨基酸(参见表2)。可 以副产木质素，废液COD去除率可达60％左右，可直接套回生产线或经较 低负荷的处理实现达标排放。

2 单细胞蛋白可不经分离直接水解成氨基酸，用我们前期研究成果生产 无磷和少磷的双效肥，达到充分利用土壤中的磷，而可以不施或少施磷的 效果。实现无机氮肥的有机化、多功能化和高效化。

3 分离出来的单细胞蛋白富含各种氨基酸可以作为饲料等的蛋白添加 剂。

附图说明

附图1为制浆工艺处理流程示意图。

具体实施方式

实施例1

用磷酸调制浆废液pH至5.5，经4000r/min离心10min后去除沉淀木 质素，取上层清液100ml装入250ml的锥形瓶中，不添加其他任何营养成 分，115℃灭菌30min。发酵培养基冷却至室温后，添加产朊假丝酵母 CICC3.144的种子培养液，酵母种子培养液的添加量为造纸废液培养基体 积的10％。在33℃，180r pm/min的摇床上培养40h，发酵后液体经离心分 离、洗涤收集菌体，于60℃真空干燥箱中干燥可得产品。24h后可干燥至 恒重。

实施例2

本实施方式与具体实施方式1的不同是采用秸秆粉的磷酸水解液调制 浆废液pH至5.5，并向去除木质素的废液发酵培养基中添加0.6g尿素， 其他操作步骤完全一样。

实施例3

本实施方式与具体实施方式1的不同是采用秸秆粉的磷酸水解液调制 浆废液pH至5.5，并向去除木质素的废液发酵培养基中添加0.6g硫酸铵， 其他操作步骤完全一样。

实施例4

本实施方式与具体实施方式1的不同是采用秸秆粉的磷酸水解液调制 浆废液pH至5.5，并向去除木质素的废液发酵培养基中添加0.6g玉米浆， 其他操作步骤完全一样。

实施例5

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加2g葡萄糖，其他操作步骤完全一样。

实施例6

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加8g废糖蜜，其他操作步骤完全一样。

实施例7

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加2g葡萄糖，0.6g尿素，其他操作步骤完全一样。

实施例8

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加2g葡萄糖，0.6g玉米浆，其他操作步骤完全一样。

实施例9

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加2g葡萄糖，0.6g硫酸铵，其他操作步骤完全一样。

实施例10

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加2g废糖蜜，0.6g尿素，其他操作步骤完全一样。

实施例11

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加6g废糖蜜，0.6g尿素，其他操作步骤完全一样。

实施例12

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加8g废糖蜜，0.6g尿素，其他操作步骤完全一样。

实施例13

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加8g废糖蜜，0.6g玉米浆，其他操作步骤完全一样。

实施例14

本实施方式与具体实施方式1的不同是向去除木质素的废液发酵培养 基中添加8g废糖蜜，0.6g硫酸铵，其他操作步骤完全一样。

实施例15

本实施方式与具体实施方式1的不同是用自来水将制浆废液原液稀释 至COD含量为20000mg/L，向去除木质素的废液发酵培养基中添加0.6g硫 酸铵，其他操作步骤完全一样。

实施例16

用自来水将制浆废液原液稀释至COD含量为40000mg/L，用硫酸调制 浆废液pH至6.0，经4000r/min离心20min后去除沉淀木质素，取上层清 液100ml装入250ml的锥形瓶中，并向100ml发酵液中加入0.6g尿素以及 0.6g磷酸二氢钾。121℃灭菌20min。发酵培养基冷却至室温后，添加产朊 假丝酵母CICC3.144的种子培养液，酵母种子培养液的添加量为制浆废液 培养基体积的10％。于28℃，180rpm/min的摇床上培养40h，发酵后液体 经离心分离、洗涤收集菌体，于60℃真空干燥箱中干燥可得产品。24h后 可干燥至恒重。

实施例17

本实施方式与具体实施方式1的不同是用自来水将制浆废液原液稀释 至COD含量为60000mg/L，向去除木质素的废液发酵培养基中添加0.6g硫 酸铵，其他操作步骤完全一样。

实施例18

本实施方式与具体实施方式16的不同是用自来水将制浆废液原液稀释 至COD含量为80000mg/L，其他操作步骤完全一样。 实施例结果参见表1

表1  实施例结果

氨基酸成分及含量分析参见表2

表2  氨基酸成分及含量分析

  氨基酸成分   含量(％)   天门冬氨酸   3.94   苏氨酸   2.45   丝氨酸   2.19   谷氨酸   4.70   甘氨酸   2.00   丙氨酸   2.58   胱氨酸   0.45   缬草氨酸   2.72   甲硫氨酸   0.36   异亮氨酸   2.15   亮氨酸   3.79   酪氨酸   1.66   苯丙氨酸   2.00   赖氨酸   3.16   组氨酸   1.15   精氨酸   2.14   脯氨酸   2.38   合计   39.82