法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2017-09-15
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N1/20 授权公告日:20150722 终止日期:20160725 申请日:20130725
专利权的终止
2015-07-22
授权
授权
2013-11-20
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N1/20 申请日:20130725
实质审查的生效
2013-10-23
公开
公开
技术领域
本发明涉及的是一种蜡样芽孢杆菌B2菌株、液体制剂及其制作方法和在防治板栗 炭疽病中的应用。
背景技术
板栗炭疽病(Colletotrichum gloeosporioide s Penz)为害栗叶、嫩枝幼杆和 栗果,造成栗叶早落,嫩枝幼杆枯死和栗果霉烂,是板栗的重要病害之一。
目前主要采用化学防治和营林技术,而生物防治措施研究尚未涉及。化学防治虽 是一种有效的防治手段,但存在病原菌抗药性、环境与食品安全、药害等许多实际问题, 一些化学杀菌剂在许多发达国家和地区已严格限制使用。而与环境友好的生物农药越来 越受到人们的青睐,是未来农业可持续发展的重要组成部分。板栗炭疽病,尚未涉及生 物防治,该技术是生态学领域的一个应用学科分支,是基于生态平衡的原理,引进有 益生物基因或基因产物,达到稳定、有效地防治靶标病(虫),生物农药(biopesticides) 是利用生物活体或者其代谢产物对有害生物进行防治的一类制剂,是生物防治的物质基 础和重要手段。
发明内容
本发明在杂交竹根际中发现蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus Frankland)一新菌株 B2菌株,能有效防治板栗炭疽病。
该B2菌株于2010年6月14日分离自四川雅安市天全县杂交竹根际。经形态,生 理,分子鉴定为蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus);该菌株已于2013年6月20日保藏在 中国北京市朝阳区中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏编号 为CGMCC NO:7767,分类命名为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus。
含有所述的B2菌株的液体制剂的制作方法,包括以下步骤:
①一级斜面种子:常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基,接种蜡样芽孢杆菌B2 后在26-28℃下培养24-36小时制成一级种子;
②二级液体种子:营养肉质培养液经高压灭菌后,按100mL液体盛于300mL三角 瓶比例装瓶,在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子,每瓶接种2支斜面种子,温 度26-28℃,初始pH值6.0,120r/min振荡培养36h,制成蜡样芽孢杆菌B2液体种子;
③液体发酵:营养肉质培养液经高压灭菌后,按200mL液体盛于500mL三角瓶比 例(通氧控制)装瓶,在无菌状态接种B2液体种子,接种量10%(体积比),温度26-28℃, 初始pH值6.0,120r/min振荡培养72h,制成B2液体制剂;所述的营养肉质培养液: 牛肉膏7.0g,蛋白胨10g,NaCl5g,板栗叶浸渍液1000mL。
所述的液体制剂在防治板栗炭疽病中的应用,B2发酵液采用喷雾法对板栗炭疽 病的田间防治效果见表3,4种处理均表现出一定的防治效果,防效均在60%以上。其 中,以发酵液原液的防治效果最佳,防治效果达到了91.31%;其次是发酵液的50倍和 100倍稀释液,防效在85%以上,分别为89.37%、85.69%,差异极显著;而500倍稀释 液的防效仅为64.21%。如应用于实践生产,从经济角度考虑,应在50倍和100倍稀释 液两种处理中进行选择。
具体实施方式
以下结合具体实施例,对本发明进行详细说明。
(一)蜡样芽孢杆菌B2菌株筛选
1.1供试病原菌
供试病原菌为胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides Penz)。
1.2芽孢的分离和纯化
取杂交竹根际土壤(表层10cm以下)装入无菌样品袋带回实验室,备用。每份样 品称量10g转至装有90mL生理盐水和少量玻璃珠的三角瓶中,充分混匀后制成土壤 悬浮液,放入100℃水浴中加热5min。冷却后,无菌条件下取1mL加入装有9mL无 菌水的试管中,充分混匀得到10-2的样品稀释液,按照此法依次稀释,分别获得10-3、 10-4、10-5和10-6的土壤稀释液,取10-3、10-4、10-5和10-6的土壤稀释液各0.1mL,分 别采用稀释平板涂布法将其涂布在LB培养基上,倒置在30℃恒温培养箱中,48h后 根据菌落形态特征,挑取单菌落进行平板划线,以保证菌落纯度,分别保存于斜面中, 保存备用。
1.3生防芽孢杆菌的初筛
将斜面培养的产孢胶孢炭疽菌用无菌水洗出分生孢子,用移液枪取1mL加入无菌 培养皿中,然后倒入45℃左右的PDA培养基15mL,充分混合均匀,冷却后制成含菌 平板。采用点菌法,接种分离获得的芽孢杆菌,倒置在30℃恒温培养箱中,24h后观 察有无抑菌圈产生进行生防芽孢杆菌的筛选,并做好记录。
分离共获得36株芽孢杆菌,根据菌落形态、颜色、边缘、光学特性以及是否产生 色素进行合并后,共25株。分别通过点菌法进行拮抗测定,筛选出胶孢炭疽菌具有较 强拮抗做用的菌株7株。抑菌圈直径达到5mm以上的共3株,其中B2菌株拮抗作用 最强,抑菌圈直径均达到17mm左右;其次是B27,抑菌圈直径均达到10mm左右; B29抑菌圈最小,仅达到5mm。
1.4发酵液活性的测定(复筛)
1.3筛选出抑菌活性较强的芽孢杆菌菌株,活化后分别将其接种于LB肉汤培养液 中,30℃,120r/min的恒温摇床中培养,培养24h后,作为种子液以1:1比例加入含 有葡萄糖的LB肉汤培养基,30℃,120r/min的恒温摇床中培养48h后取出,用牛津 杯法和打孔法进行抑菌试验,检测发酵液是否有抑菌活性。
待测生防菌株发酵后,静置,取上清液,3500r/min,离心5min,取上清液分别采 用打孔法、牛津杯法对指示病原菌进行拮抗测定。
采用打孔法,将指示病原菌分生孢子接种在平板上,直径5mm打孔器打孔后,在 孔中加入待测的生防菌发酵液,测得B27、B29基本不产生抑菌圈,而B2菌株抑菌圈 直径达到23mm±0.5mm,说明B2胶孢炭疽菌具有较好的抑制作用。
采用牛津杯法对发酵液进行拮抗活性的测定,测得B2具有一定的拮抗活性,发酵 液对病原菌的抑菌圈直径达到15mm±0.4mm,而B27和B29基本看不出抑菌圈,发酵 液无抑菌活性。
1.5发酵滤液活性的测定
用移液枪吸取5mL经过24h培养的种子液,加入装有45mL含葡萄糖的LB肉汤 培养液的250mL三角瓶中,30℃,120r/min的恒温摇床中培养,36h后,经3000r/min, 离心5min后,取上清液,用0.2μm细菌过滤器过滤,获得无细胞发酵滤液。取0.1mL 病原菌稀释液涂布于平板上,采用牛津杯法、打孔法测定发酵滤液对病原菌的抑菌活性, 重复3次,并设对照,2d后测量抑菌圈直径。
同时对发酵液进行121℃,15min高温处理,按照上述方法检测拮抗活性的有无。
结合1.3和1.4实验结果,筛选出最佳生防芽孢杆菌进行后续试验。
B2菌株经发酵后,取其上清液用细菌过滤器(直径0.2μm)过滤后获得无菌发酵 滤液,用打孔法和牛津杯法分别测定抑菌活性测定。结果表明,B2菌株经发酵后获得 无细胞发酵滤液对指示病原菌表现出较强的拮抗效果,打孔法和牛津杯法产生的抑菌圈 带宽分别为5mm±0.5mm和4mm±0.2mm。发酵滤液经过121℃,15min高温处理后 仍具有拮抗活性,说明抑菌代谢产物具有耐热性。
1.6盆栽试验
选取一年生盆栽板栗苗为对象。筛选出的生防菌经发酵后,取其发酵液采用喷雾法 对种苗进行喷雾,每隔7d喷施1次(共3次),并以无菌水作对照。一个月后采用针刺 接种法将病原菌接种在幼苗叶片上,每处理接种100个部位,并对接种部位进行保湿, 每处理重复3次。
病原菌接种15d后,按照表2中病害分级标准进行病害调查统计,并计算发病率。
表1盆栽接种试验15d后的防治效果
注:大小写字母分别为p<0.05和p<0.01水平上具有显著性差异。
接种病原菌15d后,生防菌B2发酵液对板栗表现出良好的保护效果(表1),防治 效果随稀释倍数的增加而降低。在稀释500倍时,发病率为19,而1000倍时,发病率 达38%,因此选用50倍,100倍,500倍稀释液用于大田试验的测定。
(二)田间防治实例
1、B2菌株液体制剂制作
①一级斜面种子:常规方法制作牛肉膏蛋白胨斜面培养基(牛肉膏7.0g,蛋白胨10g, NaCl5g,琼脂17g,水1000mL),接种蜡样芽孢杆菌B2后在26-28℃下培养24-36小时 制成一级种子。
②二级液体种子:营养肉质培养液(牛肉膏7.0g,蛋白胨10g,NaCl5g,板栗叶浸 渍液1000mL)经高压灭菌后,按100mL液体盛于300mL三角瓶比例(通氧控制)装 瓶,在无菌状态接种蜡样芽孢杆菌B2斜面种子,每瓶接种2支斜面种子,温度26-28℃, 初始pH值6.0,120r/min振荡培养36h,制成蜡样芽孢杆菌B2液体种子。
③液体发酵:营养肉质培养液(牛肉膏7.0g,蛋白胨10g,NaCl5g,板栗叶浸渍液 1000mL,板栗叶浸渍液制备方法:新鲜板栗叶10g在1000ml水中煮沸10分钟,保持 水量,除去叶片滤液即可)经高压灭菌后,按200mL液体盛于500mL三角瓶比例(通 氧控制)装瓶,在无菌状态接种B2液体种子,接种量10%(体积比),温度26-28℃,初 始pH值6.0,120r/min振荡培养72h,制成B2液体制剂。
④制剂保存:瓶装制剂常温保存半年或低温(4度)1年半不影响防治效果。
2、田间防治
(1)B2菌制剂配制:拮抗菌发酵后,将发酵原液稀释成1×109cfu/mL的发酵液, 并在此基础上依次配制50倍、100倍、500倍的稀释液。
(2)喷雾防治:选择历年发病板栗园进行,每个浓度处理应做到喷洒均匀一致,以 滴水不成线为宜,并以喷洒无菌水作对照。每处理设50株,喷雾间隔7d一次,连续喷 3次。每处理重复4次。
分别在喷雾前和在最后一次喷雾后的第30d进行调查统计,记录发病植株数、发病 程度,并计算病情指数增长率、防治效果。
发病率同上计算。
表2板栗炭疽病害分级标准
B2发酵液采用喷雾法对板栗炭疽病的田间防治效果见表3,4种处理均表现出一定 的防治效果,防效均在60%以上。其中,以发酵液原液的防治效果最佳,防治效果达到 了91.31%;其次是发酵液的50倍和100倍稀释液,防效在85%以上,分别为89.37%、 85.69%,差异极显著;而500倍稀释液的防效仅为64.21%。如应用于实践生产,从经 济角度考虑,应在50倍和100倍稀释液两种处理中进行选择。
表3采用喷雾法板栗炭疽病的田间防治效果
注:大小写字母分别为p<0.05和p<0.01水平上具有显著性差异。
应当理解的是,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换, 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
机译: 具有蜡样芽孢杆菌活性和还原生物胺的HJ5-2解淀粉芽孢杆菌HJ5-2寡营养菌株及其组合物
机译: 具有蜡样芽孢杆菌活性和还原生物胺的HJ5-2解淀粉芽孢杆菌HJ5-2寡营养菌株及其组合物
机译: ECOLI菌株-病毒样颗粒形式的全保护芽孢杆菌炭疽抗原。