法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-01-07
授权
授权
2013-11-06
实质审查的生效 IPC(主分类):C12M1/34 申请日:20111227
实质审查的生效
2013-10-02
公开
公开
技术领域
本发明涉及细胞核观察基板和细胞核观察装置。更特别地，本发明涉 及用于荧光染色和形态观察细胞核的细胞核观察基板。
背景技术
在相关技术中，使用显微镜等对细胞、微生物等的细胞核进行观察， 且已经基于核的形态而判定细胞和微生物的种类和性质。为了使核的形态 观察容易，在观察之前，将用于对核进行染色的颜料用于对细胞、微生物 等进行染色。
例如，非专利文献1和2描述了通过Giemsa对红细胞进行染色以观 察被疟疾寄生虫感染的细胞的技术。在非专利文献1和2中所述的装置中， 使用磁体（magnet）收集血液中被疟疾寄生虫感染的红细胞，由此可以方 便且迅速地进行疟疾诊断。
作为用于对核进行染色的颜料，例如，从过去开始就已经使用作为用 于上述Giemsa染色的蓝色颜料的亚甲基蓝、作为蓝紫色颜料的苏木精等。 近年来，将结合到核酸上的荧光颜料用于对核进行染色。荧光颜料的实例 包括Hoechst和DAPI。
将描述与本发明有关的作为在荧光观察时由细胞呈现的自发荧光的 过去已知的荧光。荧光的一种是在铜的存在下由紫外线照射的细胞呈现的 橙色自发荧光。例如，据报道，当添加铜时，果蝇幼虫中肠的特定部分的 细胞发射橙色荧光（参见非专利文献3至11）。将在果蝇幼虫中肠中特别 强地观察到橙色荧光的细胞称作“铜细胞”等。据报道，当提高添加的铜 的浓度时，在铜细胞周围的细胞（非专利文献6）和幼虫的全部体壁（非 专利文献4）观察到荧光。
描述了在细胞中的细胞质和细胞核两者处都观察到上述橙色荧光，并 且，特别地，在细胞质的颗粒中显著检测到上述荧光（参见非专利文献4 至6和9）。描述了荧光的波长范围为590nm至630nm，峰值波长为610 nm且最大激发波长为340nm（参见非专利文献5）。
关于果蝇以外的微生物，也观察到具有类似性质的自发荧光。例如， 据报道，在大鼠实验中，通过紫外线激发（激发波长为310nm）在给予了 铜的个体的肝脏中观察到橙色荧光（峰值波长为605nm）（参见非专利文 献11）。此外，据报道，在具有其中随着老化累积铜的肾脏和肝脏的模型 大鼠的肾脏中观察到类似的荧光（参见非专利文献12）。另外，在酵母（参 见非专利文献13）和Wilson病患者的肝细胞（参见非专利文献14）中报 道了具有类似性质的自发荧光。Wilson病是铜排泄功能不全和肝细胞内的 铜累积的遗传性疾病。
作为发射橙色荧光的上述荧光物质，推断为铜和金属硫蛋白（MT） 的复合体（在下文中简称作“Cu-MT”）（参见非专利文献16至25）。Cu-MT 的波长特性在非专利文献15中是305nm的激发波长和565nm的荧光波 长，以及非专利文献19中是310nm的激发波长和570nm的荧光波长。 可以想到，Cu-MT包含一价铜离子（Cu（I））（参见非专利文献15、17、 19、21和25）。
作为包含铜的荧光物质，通过使嘧啶或硫醇盐与铜相互作用而发射荧 光的包含嘧啶或硫醇盐的化合物是熟知的（参见非专利文献26至31）。
另一方面，在以前就研究了各种金属离子与核酸的相互作用。例如， 已知的是，当一价铜离子与核酸相互作用时，细胞核中包含的微量铜稳定 了核酸结构，但是在过氧化氢的共存下损害DNA（参见非专利文献32）。 还报道了，与铜的相互作用改变了DNA的吸收光谱（参见非专利文献32 和33）。此外，据报道，吸收光谱的变化取决于DNA的碱基序列（具体 地，具有G-C对的聚合物和具有A-T对的聚合物）（参见非专利文献32）。
非专利文献1：“Diagnosis of malaria by magnetic deposition microscopy.”Am.J.Trop.Med.Hyg.，2006，Vol.74，No.4，p.568-572
非专利文献2：“Enhanced detection of gametocytes by magnetic deposition microscopy predicts higher potential for Plasmodium falciparum transmission.”Malaria Journal，2008，7，66
非专利文献3：Physiological genetic studies on copper metabolism in the genus Drosophila.（1950）Genetics35，684-685
非专利文献4：Organization and function of the inorganic constituents of nuclei.（1952）Exp.Cell Res.，Suppl.2：161-179
非专利文献5：Ultrastructure of the copper-accumulating region of the Drosophila larval midgut.（1971）Tissue Cell.3，77-102
非专利文献6：Specification of a single cell type by a Drosophila homeoticgene.（1994）Cell.76，689-702
非专利文献7：Two different thresholds of wingless signalling with distinct developmental consequences in the Drosophila midgut.（1995） EMBO J.14，5016-5026.
非专利文献8：Calcium-activated potassium channel gene expression in the midgut of Drosophila.（1997）Comp.Biochem.Physiol.B Biochem.Mol. Biol.118，411-420
非专利文献9：Evidence that a copper-metallothionein complex is responsible for fluorescence in acid-secreting cells of the Drosophila stomach. （2001）Cell Tissue Res.304，383-389
非专利文献10：Peptidergic paracrine and endocrine cells in the midgut ofthe fruit fly maggot.（2009）Cell Tissue Res.336，309-323
非专利文献11：A luminescence probe for metallothionein in liver tissue：emission intensity measured directly from copper metallothionein induced in ratliver.（1989）FEBS Lett.257，283-286
非专利文献12：Direct visualization of copper-metallothionein in LEC ratkidneys：application of autofluorescence signal of copper-thiolate cluster. （1996）J.Histochem.Cytochem.44，865-873
非专利文献13：Incorporation of copper into the yeast Saccharomyces cerevisiae.Identification of Cu（I）--metallothionein in intact yeast cells. （1997）J.Inorg.Biochem.66，231-240
非专利文献14：Portmann B.Image of the month.Copper- metallothionein autofluorescence.（2009）Hepatology.50，1312-1313
非专利文献15：Luminescence properties of Neurospora copper metallothionein.（1981）FEBS Lett.127，201-203
非专利文献16：Copper transfer between Neurospora copper metallothioneinand type3copper apoproteins.（1982）FEBS Lett.142， 219-222
非专利文献17：Spectroscopic studies on Neurospora copper metallothionein.（1983）Biochemistry.22，2043-2048
非专利文献18：Metal substitution of Neurospora copper metallothionein. （1984）Biochemistry.23，3422-3427
非专利文献19：（Cu,Zn）-metallothioneins from fetal bovine liver. Chemicaland spectroscopic properties.（1985）J.Biol.Chem.260， 10032-10038
非专利文献20：Primary structure and spectroscopic studies of Neurosporacopper metallothionein.（1986）Environ.Health Perspect.65， 21-27
非专利文献21：Characterization of the copper-thiolate cluster in yeast metallothionein and two truncated mutants.（1988）J.Biol.Chem.263， 6688-6694
非专利文献22：Luminescence emission from Neurospora copper metallothionein.Time-resolved studies.（1989）Biochem J.260，189-193
非专利文献23：Establishment of the metal-to-cysteine connectivities in silver-substituted yeast metallothionein（1991）J.Am.Chem.Soc.113， 9354-9358
非专利文献24：Copper-and silver-substituted yeast metallothioneins： Sequential proton NMR assignments reflecting conformational heterogeneity at the Cterminus.（1993）Biochemistry.32，6773-6787
非专利文献25：Luminescence decay from copper（I）complexes of metallothionein.（1998）Inorg.Chim.Acta.153，115-118
非专利文献26：Solution Luminescence of Metal Complexes.（1970） Appl.Spectrosc.24，319–326
非专利文献27：Fluorescence of Cu，Au and Ag硫醇盐s.（1971） Photochem.Photobiol.13，279-281
非专利文献28：Luminescence of the copper--carbon monoxide complex of Neurospora tyrosinase.（1980）FEBS Lett.111，232-234
非专利文献29：Luminescence of carbon monoxide hemocyanins. （1980）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.77，2387-2389
非专利文献30：Photophysical properties of hexanuclear copper（I）and silver（I）clusters.（1992）Inorg.Chem.，31，1941-1945
非专利文献31：Photochemical and photophysical properties of tetranuclearand hexanuclear clusters of metals with d10and s2electronic configurations.（1993）Acc.Chem.Res.26，220-226
非专利文献32：Interaction of copper（I）with nucleic acids.（1990） Int.J.Radiat.Biol.58，215-234
非专利文献33：Copper（I）-Catalyzed Regioselective“Ligation”of Azidesand Terminal Alkynes.（2002）Ang.Chem.Int.Ed.41，2596-2599
发明内容
发明要解决的问题
在通过使用常规颜料的核染色进行观察细胞核的方法中，需要将细 胞、微生物等固定，重复浸渍到颜料溶液中并清洗，干燥等。因此，其需 要很多努力和时间。需要工作熟练。
本发明的主要目的是提供通过简单的操作对细胞、微生物等的核进行 染色并观察它们的形态的技术。
解决问题的手段
本发明人发现，通过利用紫外波长区域中的光进行照射，与铜接触的 核酸会发射荧光，并通过应用该发现设计出了根据本发明的细胞核观察基 板等。
换言之，为了解决所述问题，本发明提供一种细胞核观察基板，其包 含向其中引入含细胞的样品液的引入部；和其中容纳由所述引入部引入的 样品液中的细胞的观察区域，在所述引入部和所述观察区域中，以使得铜 能够与样品液接触的方式，在样品液的流动通道上布置有铜。
在细胞核观察基板中，当使由引入部引入的样品液中的细胞与铜接触 时，其中的核酸会发射荧光并被保持在观察区域中。因此，在细胞核观察 基板中，在观察区域可以观察到包含被荧光染色的核的细胞。
在细胞核观察基板中，优选在所述流动通道上形成和布置所述铜。
细胞核观察基板可包含可附着且可拆卸地布置并在所述观察区域内 形成磁场的磁体，并且基于磁力将流过所述流动通道的样品液中的细胞保 持在所述观察区域内。另外，在细胞核观察基板中，所述观察区域布置在 预定距离的两个相对基板之间的间隙中。所述细胞核观察基板包含向该间 隙引入样品液的引入部，和吸收由该引入部引入到所述间隙中的样品液的 吸收构件，其中在所述引入部和所述吸收构件之间的位置附着所述磁体。
此外，本发明提供一种细胞核观察装置，其包含：向其中引入含细胞 的样品液的引入部；其中容纳由所述引入部引入的样品液中的细胞的观察 区域；在所述引入部和所述观察区域中，以使得铜能够与样品液接触的方 式，在样品液的流动通道上布置有铜的基板；以及用于对所述观察区域照 射光并检测所产生的荧光的光检测装置。
在细胞核观察装置中，当使由引入部引入的样品液中的细胞与铜接触 时，其中的核酸会发射荧光并被保持在观察区域中。因此，在细胞核观察 装置中，利用光照射观察区域，并检测产生的荧光，由此可以观察细胞的 核荧光染色图像。
在细胞核观察装置中，通过所述光检测装置照射的光的波长为300 nm至420nm。
发明效果
本发明提供通过简单操作对细胞、微生物等的核进行染色并观察它们 的形态的技术。
附图说明
[图1]示出根据本发明第一实施方式的细胞核观察基板的构造的示意 图。
[图2]示出根据本发明第二实施方式的细胞核观察基板的构造的示意 图。
[图3]各自示出通过在S.A.浓度为50mM的条件下，使ssDNA与具 有不同浓度的CuSO4接触而获得的荧光光谱和RFU值的代替图画 （drawing）的曲线图（graph，图表）；（A）示出荧光光谱，（B）示出峰 值RFU值（实施例1）。
[图4]各自示出通过在S.A.浓度为50mM的条件下，使ssDNA与具 有不同浓度的CuSO4接触而获得的荧光光谱和RFU值的代替图画的曲线 图；（A）示出荧光光谱，（B）示出峰值RFU值（实施例1）。
[图5]各自示出通过在S.A.浓度为4mM的条件下，使寡聚DNA （oligo-DNA）与具有0.4mM浓度的CuSO4接触而获得的荧光光谱和RFU 值的代替图画的曲线图（实施例1）。
[图6]各自示出通过在S.A.浓度为4mM的条件下，使寡聚DNA与具 有0.4mM浓度的CuSO4接触而获得的荧光光谱和RFU值的代替图画的曲 线图（实施例1）。
[图7]各自示出通过在CuSO4浓度为0.4mM和S.A.浓度为4mM的 条件下，在寡聚DNA T（20）、T（6）和T（3）中获得的荧光光谱和吸收 光谱的经时变化的代替图画的曲线图（实施例1）；上面的曲线图各自示出 纵轴为RFU值（绝对值）的荧光光谱，中间的曲线图各自示出纵轴为RFU 值（相对值）的荧光光谱，而下面的曲线图各自示出吸收光谱。
[图8]各自示出通过在CuSO4浓度为0.4mM和S.A.浓度为4mM的 条件下，在寡聚DNA T（20）、T（6）和T（3）中获得的荧光光谱和吸收 光谱的经时变化的代替图画的曲线图（实施例1）；（A）示出峰值RFU值 的经时变化，而（B）示出在346nm波长处的经时变化。
[图9]各自示出在寡聚DNA T（20）、T（6）和T（3）中获得的二维 荧光光谱的代替图画的曲线图。
[图10]示出在寡聚DNA T（20）、T（6）和T（3）中获得的激发光 谱（虚线）和荧光光谱（实线）的代替图画的曲线图（实施例1）。
[图11]各自示出在通过组合腺嘌呤和胸腺嘧啶而包含3碱基长度序列 的寡聚DNA中获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例1）。
[图12]各自示出在通过组合腺嘌呤和胸腺嘧啶而包含3碱基长度序列 的寡聚DNA中获得的荧光光谱的最大RFU值（A）和峰值FRU波长（B） 的代替图画的曲线图（实施例1）。
[图13]各自示出在包含序列编号（SEQ ID NO.）19和20的序列的寡 聚DNA中获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例1）。
[图14]示出通过使包含ssDNA的样品与固体铜接触而获得的荧光光 谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图15]示出通过使包含ssDNA的样品与具有不同浓度的固体铜接触 而获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图16]各自示出通过使包含ssDNA的样品与包含具有不同种类或浓 度的盐的反应溶液接触而获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例 2）。
[图17]各自示出通过使包含具有不同浓度的ssDNA（A）或RNA（B） 的样品与固体铜接触而获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图18]各自示出通过使包含具有不同序列的DNA的样品与固体铜接 触而获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图19]各自示出通过使包含具有不同序列的寡聚DNA的样品与固体 铜接触而获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图20]各自示出通过使包含具有不同序列的寡聚DNA的样品与固体 铜接触而获得的激发-荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图21]示出在具有8碱基胞嘧啶和12碱基胸腺嘧啶的组合序列的寡 聚DNA中获得的荧光光谱的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图22]各自示出在包含错配的双链DNA中获得的荧光光谱的代替图 画的曲线图（实施例2）。
[图23]各自示出通过改变反应溶液的缓冲剂的种类和pH而获得的 RFU值的代替图画的曲线图（实施例2）。
[图24]各自示出通过使溅射在玻璃表面上的铜与ssDNA接触而获得 的荧光图像的代替图画的照片（实施例3）。
[图25]各自示出通过使溅射在玻璃表面上的铜与RNA接触而获得的 荧光图像的代替图画的照片（实施例3）。
[图26]示出通过使溅射在玻璃表面上的铜或银与包含DNA或RNA 的样品接触而获得的荧光强度的代替图画的曲线图（实施例3）。
[图27]示出通过使溅射在玻璃表面上的铜与ssDNA接触而获得的荧 光强度的经时变化的代替图画的曲线图（实施例3）。
[图28]示出在使溅射在玻璃表面上的铜与ssDNA接触之后改变温度 时荧光强度的变化的代替图画的曲线图（实施例3）。
[图29]各自示出铜溅射玻璃上的洋葱薄皮的荧光观察的结果的代替 图画的照片（实施例4）。
[图30]各自示出铜溅射玻璃上的人体白血球样品的荧光观察的结果 的代替图画的照片（实施例4）。
[图31]各自示出铜溅射玻璃上的Jurkat细胞的荧光观察的结果的代替 图画的照片（实施例4）。
[图32]各自示出铜溅射玻璃上的Jurkat细胞的荧光观察的结果的代替 图画的照片（实施例4）。
[图33]各自示出在实施例5中，通过磁体在基板的观察区域上累积的 磁性体标记抗体（EasySep-CD45）标记细胞的代替图画的照片。
[图34]各自示出在实施例5中，通过磁体在基板的观察区域上累积的 磁性体标记抗体（MACS-CD45）标记细胞的代替图画的照片。
[图35]各自示出在实施例5中，在溅射了铜的基板的观察区域上累积 的磁性体标记抗体（MACS-CD45）标记细胞的捕获的透过图像（A）和荧 光图像（B）的代替图画的照片。
具体实施方式
在下文中，将参考附图对根据本发明的实施方式进行说明。提供下述 实施方式仅用于例示性说明，且仅描述本发明的代表性实施方式，并且本 发明的范围不应被解释为更窄。以下列顺序对实施方式进行说明。
1.细胞核观察基板
（1）第一实施方式
（2）第二实施方式
2.细胞核观察装置
1.细胞核观察基板
（1）第一实施方式
图1是示出根据本发明第一实施方式的细胞核观察基板的构造的示 意图。（A）是俯视图，（B）是对应于（A）中的P-P截面的截面图，且（C） 是对应于（A）中的Q-Q截面的截面图。
在图中，以符号A表示的细胞核观察基板包含基板层a1和基板层a2。 基板层a1隔着间隔件a3以预定间隙面对基板层a2。所述间隙具有非限制 性厚度，但是所述厚度期望地为几微米至几百微米，优选约10微米至50 微米。在基板层a1和基板层a2之间的间隙的一部分中，布置观察区域2 以作为细胞的观察场所。
由基板层a1和基板层a2形成的间隙的一部分被间隔件a3封闭，并且 其剩余部分开放且与外部连通。具体地，在图（A）中，由基板层a1和基 板层a2形成的间隙的上下两边被间隔件a3封闭，且间隙的左右两边与外 部连通。基板层a1和基板层a2之间的间隙的开放部分的一部分（在图（A） 中，左边）是将样品液引入到布置在间隙的观察区域2中的引入部1。在 引入部1的相反侧的间隙的开发部分的一部分（在图（A）中，右边）中， 将吸收由引入部1引入到间隙中的样品液的吸收构件4插入并布置在基板 层a1和基板层a2之间。由引入部1引入的样品液在基板层a1和基板层a2之间的间隙中移动，且被吸收构件4吸收，由此将样品液中包含的细胞保 持在观察区域2中。
作为样品液，优选包含盐如氯化钠（NaCl）、氯化钾（KCl）、氯化镁 （MgCl2）的缓冲液（参见后述的实施例2）。可以包含一种盐或两种以上 盐，且其浓度没有特别限制。优选地，将浓度设定为0.025M以上。用于 样品液的缓冲剂可以不包含用于Cu（II）离子的螯合剂（参见实施例2）。 为了降低对细胞的损伤，将调节为具有与生理组织和细胞几乎等渗的盐浓 度的缓冲液（例如，生理盐水）理想地用作样品液。作为缓冲液，可以使 用利用磷酸盐缓冲液的磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）（参见实施例2）。
吸收构件4没有特别限制，只要可以吸收样品液即可，且可以为例如 滤纸、吸水纤维和吸水树脂。
在面对基板层a1的基板层a2的表面上，形成铜膜3。由引入部1引 入的样品液中的细胞在基板层a1和基板层a2之间的间隙中移动，同时与 溶出到样品液中的铜接触。在这种情况下，当核酸与铜接触时，通过利用 紫外波长区域中的光进行照射，细胞核中的核酸会发射荧光。
通过使用常规已知的方法在基板的表面上进行溅射或气相沉积而形 成铜膜3。铜膜3的厚度没有特别限制，但是为几nm至几十nm，优选约 20nm至40nm。在膜厚度范围内，铜膜3具有光透过性。因此，当利用 光照射容纳在观察区域2内的细胞并观察细胞的核荧光染色图像时，可以 透过铜膜3照射光或检测荧光。可以使用入射光光学系统在与铜膜3相反 的表面进行光照射和荧光检测。在这种情况下，铜膜可不具有光透过性。
在图中，标号5表示用于在观察区域2内形成磁场的磁体。磁体5 以与基板层a1的与观察区域2相反的表面邻接的方式布置在基板层a1上。 磁体5可以可附着且可拆卸地布置在基板层a1和基板层a2的任一侧。磁 体5基于在观察区域2内形成的磁场的磁力，在观察区域2内选择、浓缩 和保持在基板层a1和基板层a2之间的间隙中移动的样品液中的细胞。以 这种方式，可以在观察区域2内累积仅吸附到磁性物质上的细胞。
磁体5的材料没有特别限制，只要可以在观察区域2内形成磁场即可， 且可以为例如钕磁体，钐-钴磁体或铁氧体磁体。另外，磁体5的位置没 有限制，只要可以在观察区域2内形成磁场即可，且可以埋设到基板层a1或基板层a2中。在根据本发明的细胞核观察基板中，磁体5不是必要构成。
在观察区域2内累积的细胞处于一旦细胞核的核酸与铜接触并被紫 外线照射，则发射荧光的状态。因此，利用紫外线照射观察区域2并检测 产生的荧光，由此观察细胞的核荧光染色图像。
照射的光的波长优选为300nm至420nm。作为基板层a1和基板层 a2的材料，优选选择具有光透过性、较少的自发荧光、和较少的由小波长 分布造成的光学误差的材料以透过对观察区域2照射的光和由细胞核产生 的荧光。作为基板层a1和基板层a2的材料，可以使用玻璃和各种塑料（聚 丙烯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、聚二甲基硅氧烷等）。另外，为了防止 对观察区域2照射的光和由细胞核产生的荧光被磁体5阻断，当观察核荧 光染色图像时，可以将布置在基板层a1上的磁体5除去。或者，使用入射 光学系统，可以从与磁体相反的表面观察光照射和荧光。
如上所述，在细胞核观察基板中A中，由引入部1引入的样品液中 具有磁性的细胞累积在观察区域2内并与铜膜3接触而处于细胞核内的核 酸发射荧光的状态，由此可以观察到细胞的核荧光染色图像。因此，在细 胞核观察基板A中，可以通过简单的操作对细胞核进行荧光染色，并可以 在不需要在通过包括Giemsa染色的使用常规颜料的核染色的细胞核观察 方法中需要的将细胞、微生物等固定、重复浸渍到颜料溶液中并清洗、干 燥等的情况下，观察到它们的形态。
特别地，在细胞核观察基板A中，由于细胞可以被磁体5累积在观 察区域2内且可以被观察到，所以适合于具有磁性的细胞的核观察。具有 磁性的细胞的实例包括利用磁性体标记抗体标记的细胞和上述非专利文 献1和2中描述的红细胞被感染的疟疾寄生虫细胞。
在细胞核观察基板A中，当使用包含通过利用磁性体标记抗体对特 定的细胞群体进行标记而提供的细胞的样品液时，基于磁体5和磁性体标 记抗体之间的磁性作用，仅特定的细胞群体可以在观察区域2内累积。因 此，可以通过仅浓缩血液样品中的白细胞而观察核，所述血液样品可用于 基于核形状而诊断白血病或基于嗜曙红细胞数而诊断变态反应。可以使用 特异地结合到特定的细胞表面抗原上的磁性体标记抗体，对特定的细胞群 体进行标记。还可以在引入部1和观察区域2之间布置抗体标记区域，以 及在该抗体标记区域中将磁性体标记抗体与细胞混合。
另外，在被疟疾寄生虫感染的红细胞中，已知的是，形成称为 Hemozoin的磁性物质。在细胞核观察基板A中，当使用从疟疾患者收集 的血液样品时，基于磁体5和Hemozoin之间的磁性作用，仅被疟疾寄生 虫感染的红细胞可以在观察区域2内累积。因此，可以将血液样品中被疟 疾寄生虫感染的红细胞浓缩以观察疟疾寄生虫核。可能的是，可以容易且 精确地判定疟疾感染和疟疾寄生虫种类。在这种情况下，在细胞核观察基 板A中，与通过常规Giemsa染色的疟疾诊断不同，可以在不需要固定、 染色、干燥等的情况下对核荧光染色图像进行观察和判定。
作为疟疾寄生虫，热带疟寄生虫、间日疟寄生虫、三日疟寄生虫、卵 形疟寄生虫等是已知的。另外，作为寄生虫体的增殖阶段，环状体、营养 体、裂殖体、配子母细胞等是已知的。适当地识别寄生虫的种类和增殖阶 段对于决定感染患者的治疗方针是非常重要的。
在如上所述的细胞核观察基板A中，描述了在面对基板层a1的基板 层a2的表面上形成铜膜3的情况作为实例。在细胞核观察基板A中，可 以在引入部1和观察区域2中的样品液的流动通道的任意区域形成铜膜3， 从而使得铜膜3可以与样品液接触。例如，可以在基板层a1的一部分或全 部表面形成铜膜3。在根据本发明的细胞核观察基板A中，铜不仅可以布 置为膜，而且可以布置为粉末、细粒子、线、板和箔。另外，在根据本发 明的细胞核观察基板A中，从将基板稳定储存的观点来看，铜优选为固态。 然而，可以使用铜溶液。当使用铜溶液时，优选的是，将还原剂与其混合 以保持将溶解的Cu离子从二价阳离子还原至一价阳离子的状态。作为还 原剂，可以如下文所述使用抗坏血酸钠（参见实施例1）。根据本发明，术 语“铜”涉及铜金属和铜合金。
（2）第二实施方式
图2是示出根据本发明第二实施方式的细胞核观察基板的构造的示 意图。（A）是俯视图，（B）是对应于（A）中的P-P截面的截面图。
在图中，由符号B表示的细胞核观察基板通过将基板层a1和基板层 a2粘合而构造。在基板层a1中，形成向其中引入样品液的引入部1和由其 排出样品液的排出部（outlet，出口）6。在基板层a2上，形成用于通过由 引入部1引入的样品液的流动通道。在流动通道的一部分处，布置观察区 域2以作为用于观察细胞的场所。
将送液装置（未示出）与引入部1和排出部6连接。由引入部1引入 的样品液通过流动通道，且从排出部6排出。送液手段由通用的泵、管、 样品液槽、废液槽等构成。另外，送液手段可包含利用离心力或重力进行 引入、送液和排出样品液的构造。
在基板层a2上形成的流动通道的表面上，形成铜膜3。可以在流动通 道表面上全部形成铜膜3。或者，如图中所示，可以不在观察区域2处， 在样品液的上游流动方向的流动通道的表面上部分形成铜膜3。或者，可 以在基板层a1上布置铜膜3。由引入部引入到流动通道中的样品液中的细 胞1与铜膜3或从铜膜3溶出的铜接触，并流入到观察区域2中。在这种 情况下，通过利用紫外线进行照射，与铜接触的细胞核中的核酸会发射荧 光。
使用常规已知的方法，通过溅射或气相沉积在基板的表面上而形成铜 膜3。铜膜3的厚度没有特别限制，但是为几nm至几十nm，优选约20nm 至40nm。在该厚度范围内，铜膜3具有光透过性。因此，当利用光照射 容纳在观察区域2内的细胞并观察细胞的核荧光染色图像时，可以透过铜 膜3照射光或检测荧光。
在图中，标号5表示用于在观察区域2内形成磁场的磁体。磁体5 以与基板层a1的与观察区域2相反的表面邻接的方式可附着且可拆卸地布 置在基板层a1上。磁体5基于在观察区域2内形成的磁场的磁力，将从引 入部1引入并在流动通道中流动的样品液中的细胞保持在观察区域2内。 以这种方式，通过磁体5，在观察区域2内累积与铜接触并会发射荧光的 细胞。由于磁体5的材料与第一实施方式中的细胞核观察基板A的类似， 在此将省略其说明。
在根据本实施方式的细胞核观察基板A中，磁体5也不是必要构成。 作为在观察区域2内累积细胞的构造，可以将用于捕捉流动的样品液中的 细胞的物质（例如，针对用于捕捉特定细胞的细胞膜抗原的抗体）固相化 而代替磁体5。或者，布置用于在观察区域2内形成电场的电极代替磁体 5，可以基于电场将细胞保持在观察区域2内。
在观察区域2内累积的细胞处于一旦细胞核的核酸与铜接触并被紫 外线照射，则发射荧光的状态。因此，利用紫外线照射观察区域2并对产 生的荧光进行检测，从而观察细胞的核荧光染色图像。
照射的光的波长优选为300nm至420nm。作为基板层a1和基板层 a2的材料，优选选择具有光透过性、较少的自发荧光、和较少的由小波长 分布造成的光学误差的材料以透过对观察区域2照射的光以及由所述光和 细胞核产生的荧光。作为基板层a1和基板层a2的材料，可以使用玻璃和 各种塑料（聚丙烯、聚碳酸酯、环烯烃聚合物、聚二甲基硅氧烷等）。另 外，为了防止对观察区域2照射的光和由细胞核产生的荧光被磁体5阻断， 当观察核荧光染色图像时，可以将布置在基板层a1上的磁体5除去。或者， 使用入射光光学系统，可以从与磁体相反的表面观察光照射和荧光。
如上所述，在细胞核观察基板B中，由引入部1引入的样品液中的 细胞与铜膜3接触并累积在观察区域2内而处于细胞核内的核酸发射荧光 的状态，由此可以观察到细胞的核荧光染色图像。因此，在细胞核观察基 板B中，可以通过简单的操作对细胞核进行荧光染色，并可以在不需要在 通过包括Giemsa染色的使用常规颜料的核染色的细胞核观察方法中需要 的将细胞、微生物等固定，重复浸渍到颜料溶液中并清洗，干燥等情况下， 观察到它们的形态。
2.细胞核观察装置
根据本发明的细胞核观察装置包含上述细胞核观察基板和用于对基 板的观察区域照射光的光检测装置，由此可以观察细胞的核荧光染色图 像。细胞核观察装置可以通过适当地改变常规已知的荧光显微镜而提供， 并包含下列构造作为光检测装置。
对观察区域照射的光优选在300nm至420nm的紫外区域内。作为 光源，可以使用激光、LED等。优选地，使用具有约360nm中心波长的 UV-LED。根据需要，通过由滤光器、反射镜、透镜等构成的光学通道将 源自光源的光引导至观察区域。
由观察区域产生的荧光通过光检测器如光电检测器、光电二极管、光 电倍增器、CCD摄像机、CMOS摄像机等来检测，并显示在图像显示装 置上。或者，由观察区域产生的荧光可以通过目镜等，利用肉眼观察。根 据需要，通过由滤光器、反射镜、透镜等构成的光学通道将由观察区域产 生的荧光引导至光检测器或目镜。所用的滤光器对于由与铜将接触的核酸 产生的具有在荧光波长区域内的约600nm的光具有选择性（参见以下实 施例1）。
实施例1
实施例1示出了，当将核酸与包含通过利用抗坏血酸将Cu（II）离 子还原而产生的Cu（I）离子的溶液混合时，通过特定条件下的紫外线照 射而发射橙色荧光。
<材料和方法>
Cu：CuSO4溶液和（+）-L-抗坏血酸钠（在下文中称为“S.A.”）购 自Sigma-Aldrich。
核酸：使用购自BioDynamics laboratory Inc.（Tokyo，Japan）的 Sonicated Salmon Sperm DNA（在下文中称为“ssDNA”）。另外，作为寡 聚DNA，使用购自Invitrogen Corporation的Custom Oligo。
缓冲液：通过按照由制造商提供的说明书将pH调节为8.5来使用购 自DOJINDO Laboratories（Kumamoto，Japan）的HEPPSO。
荧光光度计：使用NanoDrop3300（Thermo Fisher Scientific,Inc.， Waltham，MA，USA）或F-4500型分光荧光光度计（Hitachi High-Technologies Corporation）。在NanoDrop3300中，将UV LED光源 用于提供激发光。对由激发光激发的荧光光谱进行测量。使用附带软件， 获得在光谱强度变为最大的波长处的相对荧光单位（RFU）作为峰值RFU 值。在F-4500型分光荧光光度计中，使用由Helix Biomedical Accessories, Inc.制造的石英毛细管和专用适配子细胞（adapter cell）。除非下面另有说 明，否则使用NanoDrop3300。
分光光度计：将NanoDrop1000Spectrophotometer用于测量吸收光 谱。
样品制备和荧光测量：将50mM HEPPSO缓冲液与氯化钠（250 mM）、CuSO4（0至4mM）、S.A.（4，50mM）、ssDNA（1mg/ml）或寡 聚DNA（50，250，500μM）混合以提供20μl样品。已知的是，S.A.具 有将由溶液中的CuSO4产生的Cu（II）离子还原为Cu（I）的作用（参见 非专利文献33）。
<结果>
图3和4是各自示出通过在S.A.浓度为50mM的条件下，改变CuSO4的浓度而获得的荧光光谱和RFU值的曲线图；（A）示出荧光光谱，而（B） 示出峰值RFU值。
图5和6是各自示出在CuSO4具有0.4mM浓度和S.A.浓度为4mM 的条件下获得的荧光光谱的曲线图。具有20、10、6和3碱基长度的寡聚 DNA分别具有50μM、50μM、250μM和500μM的浓度。图5示出了序 列编号1至6中所述的碱基序列的寡聚DNA的结果。横轴表示波长，（A） 中的纵轴表示每个波长中的RFU值，且（B）中的纵轴表示通过将每个波 长的RFU值除以最大RFU值而获得的值。图6示出了具有序列编号2中 描述的碱基序列的寡聚DNA（在下文中描述为T（20））的结果（A），具 有序列编号10中描述的碱基序列的寡聚DNA（在下文中描述为T（6）） 的结果（B），具有序列编号12中描述的碱基序列的寡聚DNA（在下文中 描述为T（3））的结果（C），和具有序列编号11中描述的碱基序列的寡 聚DNA（在下文中描述为A（3））的结果（D）。每个横轴表示波长，且 每个纵轴表示每个波长中的RFU值。
如图中所示，确认了，荧光光谱的图案（峰值波长和强度）随核酸的 碱基序列而变化。
接下来，在CuSO4浓度为0.4mM和S.A.浓度为4mM的条件下在寡 聚DNA T（20）、T（6）和T（3）中获得荧光光谱和吸收光谱的经时变化。 在首次的荧光光谱和吸收光谱的测量之前直接添加S.A.。在8、14、24和 35分钟之后，对荧光光谱和吸收光谱进行测量。将结果示于图7和8中。 在图7中，上面的曲线图各自示出纵轴为RFU值（绝对值）的荧光光谱， 中间的曲线图各自示出纵轴为RFU值（相对值）的荧光光谱，而下面的 曲线图各自示出吸收光谱。图8示出了峰值RFU值的经时变化（A），并 示出了在346nm波长处的经时变化（B）。
如图中所示，在（T20）、T（6）和（T3）的所有寡聚DNA中，在 30分钟之后，荧光几乎都消失。特别地，在具有短碱基长度的寡聚DNA 中，荧光快速消失。在35分钟之后，测量荧光光谱。之后立即向样品中 再次添加1.8μl44mM S.A.溶液以进行测量。可以再次检测到荧光。由此， 可以认为荧光的消失是由于Cu（I）离子到Cu（II）离子的氧化。在寡聚 DNA T（6）和T（3）的各个荧光光谱中，当峰值强度下降时，在短波长 侧观察到新的峰。
另一方面，在各寡聚DNA的各个吸收光谱中，随着时间变化观察到 峰值强度的下降。与荧光光谱相比，吸收光谱的下降更加缓慢。
图9（A）至图9（C）示出了通过F-4500型分光荧光光度计在寡聚 DNA T（20）、T（6）和T（3）中获得的二维荧光光谱。图10示出了在 各寡聚DNA中获得的激发光谱（虚线）和荧光光谱（实线）。对于荧光波 长，以1nm的间隙测量光谱，且对于激发波长，以2nm的间隙测量光谱。
如图中所示，确认了，荧光光谱的图案随寡聚DNA的碱基长度而变 化。还确认了，激发光谱的图案随碱基长度而变化。
为了进一步检验碱基序列与光谱之间的关系，对各自通过序列编号 11和18中所述的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶（T）的组合而具有3碱基长度 序列的寡聚DNA测量荧光。将结果示于图11和12中。在图11中，纵轴 （A）表示通过Nanodrop测量的各波长中的RFU值，而纵轴（B）表示 通过将各波长的RFU值除以最大RFU值而获得的值。图12示出了通过 将RFU的最大值和峰值波长测量三次而获得的平均值和标准误差。
如图中所示，确认了，荧光强度和峰值波长随寡聚DNA的碱基序列 而变化。
图13示出了在包含序列编号19和20的序列的寡聚DNA中获得的 测量结果。确认了，尽管与具有序列编号19中所述的序列的寡聚DNA中 的荧光强度相比，具有序列编号20中所述的序列的寡聚DNA中的荧光强 度微弱，但是具有包含尿嘧啶（U）的序列编号20中所述的序列的寡聚 DNA发射光谱形状和峰位置类似于具有包含胸腺嘧啶（T）的序列编号19 中所述的序列的寡聚DNA。
<讨论>
本实施例示出了，当将DNA与其中混入了CuSO4和S.A.的包含氯化 钠的HEPPSO缓冲溶液混合时，通过紫外线照射观察到具有约500nm至 700nm的波长的橙色荧光。确认了，荧光强度取决于CuSO4的浓度，且 荧光强度和光谱也受核酸的碱基序列影响。
在至少包含胸腺嘧啶（T）、腺嘌呤（A）或尿嘧啶（U）的寡聚DNA 中观察到荧光。在使用各自具有包含胸腺嘧啶（T）和腺嘌呤（A）的三 碱基长度的寡聚DNA的实验中，在任意序列中都观察到荧光。另外，示 出了，荧光强度和光谱不仅受胸腺嘧啶（T）或腺嘌呤（A）的量影响， 而且受寡聚DNA上的位置（序列顺序）影响。
在S.A.的添加之后随着时间的过去，荧光强度随时间推移而降低，但 是通过S.A.的再添加而恢复。同时，Cu（I）离子在氧的存在下非常不稳 定，且一失去S.A.的还原效果就变为Cu（II）或固体铜。由此，认为荧光 源自Cu（I）离子和核酸的复合体。为了通过铜与核酸之间的相互作用而 检测荧光，期望的是，使反应溶液与空气中的氧的接触最小化。
[实施例2]
实施例2示出了，当使包含核酸的溶液与固体铜接触时，通过特定条 件下的紫外线照射而发射与实施例1中观察到的荧光类似的橙色荧光。
<材料和方法>
作为与核酸接触的铜，使用铜粉末（Copper，Powder，-75um，99.9% /Cat.No.030-18352/由Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Osaka，Japan 制造）。
作为RNA，通过将Rat Brain Total RNA（Cat.No.636622，Takara Bio Inc.，Otsu，Japan）溶于DEPC处理后的水（Cat.No.312-90201／Wako Pure Chemical Industries，Ltd.，Japan）中而使用它。
PIPES、ACES、BES、TAPSO、HEPPSO、EPPS、TAPS、CAPS、 TES、Tricine和OPSO购自DOJINDO Laboratories（Kumamoto，Japan）。 通过按照由制造商提供的说明书对pH进行调节而使用它们中的每一种。 其他试剂与实施例1中相同。
通过将各种核酸、盐和铜粉末混入到总量40微升的溶液中，并将其 搅拌15分钟而使核酸与铜接触。除非另有说明，否则铜粉末的添加量为 375mg/毫升溶液。除非另有说明，否则盐或氯化钠（NaCl）的量为500mM。
在将样品离心以沉淀铜粉末之后，对上清液测量荧光光谱和强度。荧 光光谱和强度的测量以与实施例中类似的步骤进行。
<结果>
对添加了1.5mg/ml ssDNA的反应溶液测量荧光三次。将结果示于图 14（横轴：波长，纵轴：RFU）中。如图中所示，当使包含核酸的样品与 固体铜接触，然后进行UV激发时，可以检测到具有600nm附近的峰的 荧光。
接下来，通过基于1mL反应溶液，以375mg、250mg、125mg、 62.5mg、37.5mg、12.5mg和0mg的量添加铜粉末而制备反应溶液。向 反应溶液中，添加1.5mg/ml ssDNA。对荧光测量三次。将结果示于图15 中。如图中所示，荧光强度取决于Cu粉末的量。在本实施例中使用的Cu 粉末中，当量为37.5mg/ml以上时，观察到明显的荧光。另一方面，当量 为12.5mg/ml以下时，没有观察到明显的荧光。
然后，改变反应溶液中盐的种类和浓度。向反应溶液中添加1.5mg/ml ssDNA。对检测到的荧光强度进行比较。将结果示于图16中。（A）示出 了在添加了0.5、0.25、0.1、0.05、0.025和0M氯化钠（NaCl）的反应溶 液中检测到的荧光强度。（B）示出了在添加了0.45M氯化钠（NaCl）、0.45 M氯化钾（KCl）、0.45M氯化镁（MgCl2）和45%乙醇（EtOH）的反应 溶液中检测到的荧光强度。荧光强度由604nm处的RFU表示，且测量三 次。将结果显示为平均值和标准误差。如图中所示，荧光强度取决于氯化 钠的量。另外，在氯化钾和氯化镁与氯化钠的共存下检测到荧光。
图17示出了当改变添加到反应溶液中的核酸的浓度时检测到的荧光 强度的比较结果。（A）示出了在添加了5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05 和0mg/ml ssDNA的反应溶液中检测到的荧光强度。（B）示出了在添加了 2.5，0.25,和0mg/ml RNA的反应溶液中检测到的荧光强度。横轴表示核 酸的浓度，而纵轴表示在604nm荧光波长处的RFU。将测量进行三次。 氯化钠（NaCl）的浓度为0.25M，且铜粉末的量为200mg/1ml。除非另 有说明，否则在下列实验中使用该条件。如图中所示，荧光强度取决于 DNA的浓度和RNA的浓度。
接下来，对添加了具有序列编号1、2、5、6和9中所述的不同序列 的0.1mM寡聚DNA的反应溶液测量荧光。将结果示于图18中。纵轴（A） 表示通过Nanodrop测量的RFU值，且纵轴（B）表示当将峰高度设定为 1时的相对RFU值。如图中所示，荧光强度和峰值波长受碱基序列影响。 特别地，可以确认，当胸腺嘧啶（T）的百分比高时，荧光强度高且峰值 波长变高。
还使用F-4500型分光荧光光度计，对添加了具有序列编号1、2、5 和6中所述的序列的寡聚DNA的反应溶液进行测量。图19示出了当照射 360nm的激发光（缝宽为10nm）时，在400nm至700nm内的荧光光谱 （缝宽为2.5nm）的结果。再次，可以确认，当胸腺嘧啶（T）的百分比 高时，在包含胸腺嘧啶（T）和腺嘌呤（A）的序列中，荧光强度高且峰 值波长变长。图20示出了通过扫描330nm至390nm（缝宽为3nm）和 400nm至700nm（缝宽为2.5nm）处的激发光以测量激发–荧光光谱的结 果。（A）表示三维，且（B）表示等高线。轴EX表示激发波长（nm）， 轴EM表示荧光波长（nm）且高度方向表示荧光强度。基于结果，可以读 出，激发、荧光的光谱和强度因DNA的不同碱基序列而改变。
为了进一步检验碱基序列和光谱之间的关系，对各自具有序列编号 21和26中所述的具有8碱基的胞嘧啶（C）和具有12碱基的胸腺嘧啶（T） 的组合的寡聚DNA测量荧光。将结果示于图21中。如图中所示，即使 DNA的碱基组成相同，当序列不同时，荧光强度也不同。
接下来，对包含错配的双链DNA测量荧光光谱的图案。作为双链 DNA，使用三种：各自具有序列编号1中所示的序列的寡聚DNA和各自 具有序列编号2中所示的序列的寡聚DNA的混合物（（e）+（f）），各自 具有序列编号5中所示的序列的寡聚DNA和各自具有序列编号2中所示 的序列的寡聚DNA的混合物（（d）+（f）），以及各自具有序列编号1中 所示的序列的寡聚DNA和各自具有序列编号6中所示的序列的寡聚DNA 的混合物（（e）+（c））。以0.5mg/ml的最终浓度将任意寡聚DNA混合。 将结果示于图22中。纵轴（A）表示通过Nanodrop测量的RFU值，且纵 轴（B）表示当将峰高度设定为1时的相对RFU值。横轴表示波长（nm）。 如图中所示，双链DNA中的荧光强度低于单链DNA中的荧光强度。然 而，在具有胸腺嘧啶（T）的错配的双链DNA中，确认了强荧光。
当改变缓冲液的种类的反应溶液中的pH时，对检测到的荧光强度进 行比较。将结果示于图23中。（A）示出了在各种缓冲条件下包含ssDNA 的样品（+）和不包含核酸的样品（-）的峰值RFU值的相对值。（B）示 出了在相同条件下包含具有序列编号1中所示的序列的寡聚DNA的样品 的峰值RFU值的相对值。（C）示出了在相同条件下包含具有序列编号2 中所示的序列的寡聚DNA的样品的峰值RFU值的相对值。各缓冲液的浓 度为50mM，ssDNA的最终浓度为0.5mg/ml，且寡聚DNA的最终浓度 为25mM。峰值RFU值的相对值是指，将在非缓冲条件下测量的峰值RFU 值设定为1。荧光强度取决于缓冲液的种类。当在缓冲液中不存在核酸时， 几乎未检测到荧光。
<讨论>
基于本实施例中的结果，揭示了，当使核酸与固体铜粉末接触时，在 包含盐浓度的适当条件下，与使核酸与Cu（I）离子接触的情况一样，可 以检测到荧光。看起来，通过相同的机理提供在铜离子和固体铜的每种情 况下观察到的荧光，因为它们的性质如波长性质和序列依赖性几乎相同。 另外，当将RNA用作核酸时，观察到荧光。另外，在双链DNA中，当尤 其在胸腺嘧啶（T）中存在错配时，观察到强荧光。这暗示了，通过将核 酸与铜结合，与互补序列的结合可能抑制荧光物质的形成。另外，认为， 在错配位点处荧光强度的增大可以应用于检测核酸的碱基序列中的变异 的方法。
在用于比较在各缓冲条件下的荧光的实验中，在PIPES、BES、 HEPPSO、EPPS、TAPS、CAPS、TES和POPSO的缓冲液中观察到荧光。 特别地，在PIPES、HEPPSO、EPPS和POPSO的缓冲液中检测到强荧光。 在7.0至10.5的pH范围内可以观察到荧光。发现取决于缓冲液种类和pH 的荧光强度的变化呈现出取决于核酸的碱基序列的不同图案。在另一方 面，有螯合和稳定Cu（II）离子特性的缓冲液存在观察不到荧光的倾向。 尽管在本实施例中未提供数据，但是当使用包含例如三羟甲基氨基甲烷 （tris）缓冲液、EDTA等的反应溶液时，几乎观察不到荧光。
[实施例3]
在实施例3中，确认了，在使核酸与在玻璃表面上溅射的铜接触之后， 可以检测到荧光，且对荧光的性质进行了分析。
<材料和方法>
作为DNA，使用实施例1中所述的ssDNA。作为RNA，使用实施例 2中所述的RNA。
使用其上安装有Cu靶，99.99%（Kojundo Chemical Laboratory Co.， Ltd，Saitama，Japan）的由ULVAC，Inc.（Kanagawa，Tokyo）制造的装 置SH-350将铜溅射在玻璃表面上。在溅射时，将厚度设定为40nm，并 且基于预先测量的沉积速度来设定适当的溅射时间。用于溅射银的玻璃由 Kyodo International,Inc.，Kanagawa，Japan制造。
在其上溅射有铜或银的载玻片或未处理的载玻片上，放置样品溶液， 并在其上覆盖Gap盖玻片，24×25No.4/#CG00024/Matsunami Glass Ind., Ltd.，Osaka，Japan。在使其静置约5分钟之后，对荧光进行观察。对于 观察，使用倒置显微镜Ti-U（Nikon Co.，Tokyo，Japan）。为了捕捉荧光， 使用滤波器组（filter set）UV-1A（Ex：365/10，DM：400，BA：400/Nikon）。 为了捕捉和记录图像，使用digital CCD camera Retiga2000R（QImaging， BC，Canada）和20倍的物镜。
<结果>
图24示出了在使包含5mg/ml DNA和0.5M NaCl的样品在铜溅射玻 璃上静置5分钟之后捕捉的图像。图25示出了在使包含5mg/ml RNA和 0.5M NaCl的样品在铜溅射玻璃上静置5分钟之后捕捉的图像。
如图24（A）中所示，当使用包含DNA的样品时，在全部捕捉的图 像上观察到平滑的荧光。另一方面，如图25（A）和（B）中所示，当使 用包含RNA的样品时，在捕捉的图像内观察到具有特有的波状图案的荧 光。RNA特有的图案的预期原因是单链RNA相互杂交而形成高阶结构 （higher order structure）。
接下来，将捕捉的图像内的荧光强度转化为数值。如图24（B）中所 示，将各捕捉的图像分为9段。将9段中的一个（图中的符号C）设定为 测量范围。对测量范围内的荧光强度的平均值进行计算。对于每种样品， 捕捉载玻片上的五个部分以由每个图像计算平均值。对所得的五个平均值 进行进一步平均并计算标准偏差。
图26示出了当使包含DNA或RNA的样品与在玻璃上溅射的铜或银 接触时获得的荧光强度。在图26中，“DNA/Cu”、“RNA/Cu”和“（-）/Cu” 表示包含5mg/ml DNA的样品、包含5mg/ml RNA的样品和不包含核酸 的样品；在Cu溅射玻璃上测量荧光强度。另外，“DNA/Ag”、“RNA/Ag” 和“（-）/Ag”表示包含5mg/ml DNA的样品、包含5mg/ml RNA的样品 和不包含核酸的样品；在Ag溅射玻璃上测量荧光强度。每种样品包含0.5 M NaCl。由于“DNA/Cu”中的荧光强度显著大于其他样品的荧光强度， 所以其曝光时间为1秒钟。在“DNA/Cu”之外的所有样品中，曝光时间 为5秒。
如图中所示，在Cu溅射玻璃中，“DNA/Cu”和“RNA/Cu”的荧光 强度高于“（-）/Cu”的荧光强度。特别是在DNA样品中，检测到强荧光。 另一方面，在Ag溅射玻璃中，与“（-）/Ag”相比，“DNA/Ag”和“RNA/Ag” 未显示荧光强度的增加。与“（-）/Cu”相比，“（-）/Ag”显示更高的测量 值。这可能由源自Ag溅射表面上的反射光、散射光或自发荧光的背景造 成的。
接下来，对伴随核酸与铜的接触时间的过去的荧光强度的变化进行检 验。将包含5mg/ml ssDNA和0.5M NaCl的样品放在Cu溅射玻璃和Gap 盖玻片之间的时间点指定为起点以测量预定时间的荧光强度。每隔15秒 钟捕捉图像，并对每个捕捉时间（session）开关用于激发光的快门。使用 10倍物镜，且曝光时间为1秒。在每一次中，将一个捕捉的图像用于测量 荧光强度。将结果示于图27中。
如图中所示，在引入样品之后，荧光强度在几分钟内逐渐增大，且在 约3分钟内达到最大值。
在从核酸与铜的接触过去预定时间之后，对由温度变化造成的荧光强 度的变化进行检验。在捕捉图像之后立即将其保持在室温下。在50秒之 后，将加热至65°C的加热块轻轻地放在Cu溅射玻璃上。在100秒之后， 除去加热块。每隔5秒捕捉图像。在150秒之后，暂时停止测量并关闭用 于激发光的快门。在900秒之后，再次进行测量。将结果示于图28中。
如图中所示，荧光强度从第一个50秒逐渐下降。这可能由荧光退色 造成。在下一个50秒期间，荧光以与荧光退色明显不同的速度消失。在 除去加热块并将其恢复至室温之后，荧光逐渐恢复。在900秒之后，荧光 强度恢复到从起初的荧光强度中减去退色荧光强度的水平。这些结果显 示，由与铜接触的核酸发射的荧光是热敏性的，且随着温度升高而可逆地 消失。
[实施例4]
实施例4示出了通过将包含细胞的样品引入到铜溅射玻璃上，可以进 行细胞核的荧光观察。
<材料和方法>
作为PBS，使用不含Ca/Mg的Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline （Invitrogen Corporation，CA，USA）。
在洋葱薄皮实验中，通过镊子将市售的洋葱薄皮小心剥离，浸泡到蒸 馏水中，漂洗并使用。将洋葱薄皮放在Cu溅射玻璃上，浸泡到PBS中， 被盖玻片覆盖，然后进行观察。
在人类白血球样品的实验中，如下处理IMMUNO-TROL Cells （Cat.No.6607077，Beckman Coulter，Inc.，Fullerton，CA，USA）：首先， 将500微升IMMUNO-TROL Cells分离，用PBS清洗，并使用离心机沉淀 （1200rpm，5分钟）。之后，将上清液丢弃以剥落（flake）小丸，将水溶 血处理重复两次以提供样品。利用PBS对样品进行稀释，由此制备白血球 样品。如下进行水溶血处理：在将作为离心的结果而获得的小丸充分剥落 之后，添加9ml去离子水，颠倒混合30秒，添加1mL10x PBS Buffer （Nippon Gene Co.，Ltd.，Tokyo，Japan）并充分搅拌。将细胞离心（1200 rpm，5分钟）并沉淀以除去上清液。将白血球样品放在Cu溅射玻璃上， 通过盖玻片覆盖，然后进行观察。
铜溅射玻璃、盖玻片、显微镜等与实施例3中相同。在溅射时，将厚 度设定为20、40或100nm。除非另有说明，否则在下列实验中，将厚度 设定为40nm。当仅在盖玻片的一部分上溅射Cu时，将聚酰亚胺带粘合 在除了中央部的5mm见方之外的盖玻片表面上，从而进行溅射。然后， 除去聚酰亚胺带。由此，制造了具有仅在中央部的5mm见方上形成的Cu 层的Cu溅射玻璃。
使用激发滤光片：365/10nm，二色镜：400nm和荧光滤光片：590LP 对洋葱薄皮进行荧光观察。使用滤波器组UV-1A（Ex：365/10，DM：400， BA：400/Nikon）对白血球样品和Jurkat细胞进行荧光观察。
<结果>
图29示出了铜溅射玻璃上的洋葱薄皮的荧光观察和捕捉的图像。（a） 和（b）示出了Cu溅射玻璃上的观察图像。（c）和（d）示出了其上未溅 射Cu的载玻片上的观察图像。（a）和（c）是亮视野的观察图像。（b）和 （d）是荧光图像。（a）至（d）是使用10倍物镜捕捉的图像。（e）是使 用40倍物镜捕捉的图像。
如图中所示，在Cu溅射玻璃上的细胞上观察到细胞核所特有的强荧 光。尽管在细胞壁等的一部分上观察到了轻微的荧光，但是将其看作细胞 壁等的自发荧光，因为在其上未溅射Cu的载玻片上的细胞上也观察到了 该荧光。
接下来，对动物细胞进行观察。图30示出了通过对铜溅射玻璃上的 人类白血球样品进行荧光观察和捕捉而获得的图像。（a）是亮视野的观察 图像。（b）是荧光图像。使用40倍物镜。
在荧光图像中，明显观察到白血球所特有的分叶中性粒细胞 （segmented neutrophil）。
图31示出了通过使用其中仅在载玻片的一部分上溅射Cu的Cu溅射 玻璃观察到的图像。在Cu溅射玻璃上，散布人类白血球细胞株，即Jurkat 细胞，覆盖盖玻片，然后使用20倍物镜观察。在Cu溅射玻璃上的Cu沉 积区域和非Cu沉积区域之间的界限捕捉图像。（a）和（c）是亮视野的观 察图像；占据大于一半的黑色区域为不透光的区域，因为形成了Cu层。 （b）和（d）是荧光图像。
仅在Cu沉积区域中的细胞的细胞核上观察到强荧光。图32示出了 使用其上以20nm（a）或100nm（b）的厚度形成Cu层的Cu溅射玻璃 的Jurkat细胞的观察结果。在每种厚度都观察到源自细胞核的荧光。
<讨论>
本实施例中的结果示出，也可以通过使细胞核与铜接触而检测荧光。 很明显，该现象仅在其上溅射铜的玻璃基板上发生，且是细胞核和铜之间 的作用的结果。
作为洋葱薄皮细胞和白血球细胞的荧光观察的结果，明显示出细胞中 的细胞核的形状之间的区别。由此，根据本发明的检测核酸的方法，可以 识别取决于细胞种类的细胞核的不同形状。
尽管在本实施例中未示出，但是在使用在其一部分上溅射有铜的载玻 片的实验中，在仅由Cu沉积区域上的细胞观察到荧光之后，将载玻片倾 斜以将细胞从Cu沉积区域移动到非Cu沉积区域。在移动之后，连续观 察到荧光。由此，即使使铜与细胞接触的部位远离荧光观察细胞的部位， 也发现，可以通过布置用于在两个部位之间移动样品的装置来检测荧光。
在确认了源自Cu溅射玻璃和盖玻片之间的细胞的细胞核的荧光之 后，将盖玻片除去并将包含细胞的溶液暴露至空气。然后，荧光快速消失。 在使用实施例1中的Cu（II）离子和S.A.的实验中，发现在将反应溶液在 空气中暴露长时间之后，荧光消失。可以认为荧光的消失是因为由与空气 的接触而造成的Cu（I）离子的氧化。因此，可以通过使样品溶液与空气 接触（特别地，暴露至空气中包含的氧）而抑制荧光产生。认为根据本发 明的检测核酸的方法优选通过将限制与空气的接触例如在微芯片中进行。
[实施例5]
在实施例5中，使用根据本发明的细胞核观察基板，且选择并浓缩用 磁性体标记抗体标记的细胞以观察核荧光染色图像。
<材料和方法>
基板：对Micro Slide Glass（Matsunami，Japan）和Gap盖玻片 （Matsunami，Japan）进行压制。将BEMCOT，M-3（Asahi Kasei Corp.， Japan）插入到Gap盖玻片的一端作为吸收构件。在使用铜溅射的实验中， 以40nm在Micro Slide Glass的表面上溅射Cu。
磁性体标记抗体：MACS CD45MicroBeads（在下文中称为 “MACS-CD45”）得自Miltenyi Biotech GmbH（Germany）。EasySep Human CD45Depletion Cocktail（在下文中称为“EasySep-CD45”）得自StemCell Technologies，Inc.（Canada）。EasySep-CD45具有比MACS-CD45更强的 磁性。
细胞：使用Jurkat细胞。将细胞样品调节为1.75×107个细胞/mL。向 200μl样品中，添加5μl EasySep-CD45或10μl MACS-CD45，将其培育 15分钟。向EasySep-CD45样品中，进一步添加10μl EasySep magnet reagent（磁体试剂），将其培育10分钟。在使用铜溅射的实验中，在培育 后利用PBS将细胞洗涤两次。
细胞的磁体吸附：所用的磁体为具有直径为5mm且高度为3mm的 圆柱形的钕磁体。磁体以与Gap盖玻片的上表面接触的方式布置。利用磁 性物质标记的细胞流入到在Gap盖玻片的下表面和载玻片之间形成的深 度为20微米的间隙中，由此在布置的磁体周围累积利用磁性物质标记的 细胞。
图33示出了在基板的观察区域上累积的EasySep-CD45标记细胞的 照片，而图34示出了MACS-CD45标记细胞的照片。在图中，在左手边， 设置引入样品液的引入部。在右手边，设置用于吸收样品的吸收构件。在 中央部，设置布置磁体的观察区域。在除去磁体之后拍摄照片。确认了， EasySep-CD45标记细胞和MACS-CD45标记细胞累积在对应于布置磁体 的位置的观察区域。下面的照片是观察区域的一部分（引入部侧）的放大 照片。
图35示出了在其上溅射了铜的基板的观察区域上累积的 MACS-CD45标记细胞的捕捉的透过图像（A），以及通过照射紫外线获得 的荧光图像（B）。在荧光图像（B）中，累积的细胞核示出荧光，且明显 观察到核形态。
[工业实用性]
通过根据本发明的细胞核观察基板，可以通过简单的操作对细胞、微 生物等的核进行染色并观察他们的形态。因此，根据本发明的细胞核观察 基板可以有效地用于在包括医药领域、药物发现领域、食品领域、农业领 域等的各种领域中，基于细胞核的形态而判定细胞、微生物等的种类或性 质
符号说明
A细胞核观察基板 1引入部
2观察区域 3铜膜
4吸收构件 5磁体
6排出部 a1，a2基板层
a3间隔件
机译： 细胞核观察基板和细胞核观察装置
机译： 细胞核观察基板和细胞核观察装置
机译： 细胞核观察基质和细胞核观察装置
