一种基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法

摘要

本发明公开了一种基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，包括以下操作：将补骨脂粉末与表面活性剂溶液充分混合后，并在超声条件下提取；提取完成后收集提取液，离心，收集上清液并加入电解质调节离子强度，然后在恒温水浴平衡，离心后上清液分相为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层；在分成两相之后，表面活性剂富集层用超滤膜过滤，回收表面活性剂，滤液旋干，得到包含补骨脂素和异补骨脂素的脂溶性类粗提物。本发明的方法无需有毒有害的有机溶剂，增加了提取率，降低了环境污染，适合于工业化的大规模提取。

说明书

技术领域

本发明属于植物活性成分的提取技术领域，涉及一种基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法。 

背景技术

补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂中重要的有效成分。由于补骨脂等在植物中的含量低，而单体提取率更低。研究高效的补骨脂素和异补骨脂素提取方法具有重要意义。事实上，单体提取率低的主要原因是第一步从植物中得到有效部位（粗提物）时，多数使用传统有机溶剂提取法，该工艺回流温度高，有效成分被氧化或分解破坏、造成提取率低。可见提高补骨脂粗提物提取率是实现高产率提取的前提和关键。 

针对植物补骨脂中有效部位提取的方法很多，主要有： 

1）有机溶剂提取法： 

有机溶剂提取法是以有机溶剂作为分散相的一种提取手段，这种方法适用于许多有机成分的提取，例如黄酮类、苷类、香豆素类等。也是目前提取植物中有效部位使用最多的一种提取方法。但主要缺点是：操作繁琐、提取率低、富集率差。尤其是使用甲醇等有毒有机溶剂，环境污染大、溶剂残留毒性高等。 

2）其它方法： 

为了克服溶剂提取法的上述缺点，人们对有效部位提取进行了改进，主要包括超临界萃取法、微波或超声波辅助提取法等。 

超临界萃取法,是以二氧化碳等作为超临界流体溶剂，提取植物补骨脂有效部位。但是超临界流体萃取法设备属高压设备，投资较大，常常需要有机夹带剂才能达到理想的分离效果。此方法不能避免有机溶剂的使用。 

微波或超声波辅助提取法：是利用微波或超声波辅助增加溶质在溶剂中 的溶解性的一种方法。多数情况下在实验室中使用。但仍需使用有机溶剂，无法避免这些溶剂的毒性和污染问题。 

浊点萃取技术（cloud point extraction，简称CPE）是一种新兴的环保型液-液萃取技术。浊点萃取技术以水代替有机溶剂作为萃取剂，通过加入少量表面活性剂产生浊点现象而达到高效提取分离目的。其原理是：表面活性剂分子在水溶液中能够形成亲水基团向外、憎水基团向内的胶束。该胶束溶液可以使微溶或不溶于水的有机物溶解度大大增加。同时，表面活性剂水溶液在加热到一定温度（浊点温度）以上，溶液变浑浊并出现分相。通过改变实验参数(如溶液的离子强度、温度等)引发相分离，最终实现溶质的高效富集和分离。 

与传统的液液萃取过程相比，浊点萃取分离技术的操作在两水相之间进行，所以避免了对人体有害的有机溶剂的使用，也避免了挥发性有机溶剂对环境的影响，而且能够保护被萃取物的原有性质，加快萃取分离速度，提高萃取富集率。而且该技术对于微量甚至痕量物质有良好的富集作用。 

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，该方法无需有毒有害的有机溶剂，增加了提取率，降低了环境污染。 

本发明是通过以下技术方案来实现： 

一种基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，包括以下操作： 

1）将补骨脂粉末与表面活性剂溶液充分混合后，并在超声条件下提取； 

2）提取完成后收集提取液，离心，收集上清液并加入电解质调节离子强度，然后在恒温水浴平衡，离心后上清液分相为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层； 

3）在分成两相之后，表面活性剂富集层用超滤膜过滤，回收表面活性剂， 滤液旋干，得到包含补骨脂素和异补骨脂素的脂溶性类粗提物。 

进一步，具体包括以下步骤： 

1）将补骨脂植物粉末加入到体积分数浓度为10～15%的表面活性剂溶液中，其中液固比为150mL:1g～200mL:1g，在旋涡混合器中充分混合，并于25℃下、300W超声处理器超声处理下，提取30～35min； 

2）提取完成后收集提取液，离心，收集上清液并加电解质调节离子强度，其中电解质浓度为2.5～3mol·L^-1，然后在50℃恒温水浴平衡35～45min后离心，上清液分相为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层； 

3）将表面活性剂富集层用0.45μm的超滤膜过滤，回收表面活性剂，滤液旋干，即得包含补骨脂素和异补骨脂素的粗提物。 

所述步骤1）中，表面活性剂的体积浓度为15%，液固比在150mL:1g，提取时间为30min； 

所述步骤2）中，加入2.5mol·L^-1的氯化钠下在50℃恒温水浴平衡40min。 

所述的表面活性剂包括：阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂和非离子表面活性剂。 

所述的阴离子表面活性剂为硬脂酸或十二烷基苯磺酸钠； 

阳离子表面活性剂为季铵化合物； 

两性离子表面活性剂为卵磷脂、氨基酸型、甜菜碱型或月桂醇聚氧乙烯醚； 

非离子表面活性剂为聚乙二醇辛基苯基醚、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯。 

所述的月桂醇聚氧乙烯醚为GENAPOL X080。 

所述的聚乙二醇辛基苯基醚为Triton X-100、Triton X-114或Triton X-45。 

所述的电解质包括硫酸盐、硝酸盐、盐酸盐、亚硫酸盐、碳酸盐、亚硫酸盐。 

所述的过滤用超滤膜为天然膜或高分子聚合物膜。 

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果： 

本发明提供的基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，该方法无需有毒有害的有机溶剂，增加了提取率，降低了环境污染，适合于工业化的大规模提取。 

相比于用甲醇提取法，首先，在同样的条件下，本发明的有效成分萃取效率具有明显优势。以GENAPOL X080作为萃取剂，补骨脂和异补骨脂素的萃取率分别为8.9和10.6mg·g^-1，而甲醇法的萃取率为6.4和9.1mg·g^-1；再者，在提取操作中几乎不用有毒的有机溶剂，具有环境友好、操作简便的优势。 

本发明提供的基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，还有以下优点：①萃取率高；②经济环保；③表面活性剂用量少，且易于处理；④活性成分不易变性；⑤操作简便；省时省力；⑥成本低廉。 

本发明将浊点萃取法用于植物补骨脂中的补骨脂及异补骨脂等有效成分的工业化提取，以获得高效、低毒、简便的提取方法。而且，该方法也可以推广到其他植物的有效成分的提取分离中，对于中药现代化具有十分重要的意义。 

附图说明

图1为Genapol X-080的浓度对提取率的影响，其中横坐标为Genapol X-080的浓度(%,v/v)，纵坐标为提取率。 

图2为液固比对提取率的影响，其中横坐标为固液比，纵坐标为提取率； 

图3为氯化钠用量对提取率的影响，其中横坐标为氯化钠的浓度，纵坐标为回收率； 

图4为平衡温度对提取率的影响，其中横坐标为平衡温度，纵坐标为回收率； 

图5为平衡时间对提取率的影响，其中横坐标为平衡时间，纵坐标为回收率； 

图6为补骨脂和异补骨脂的HPLC谱图。 

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。 

本发明提供的基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，以浊点萃取法为主要技术，辅以超声提取技术和超滤技术，实现植物补骨脂中补骨脂和异补骨脂等活性成分的分离。主要包括以下操作： 

从药材中将有效成分提取至表面活性剂液层： 

将补骨脂粉末与表面活性剂溶液，于旋涡混合器上充分混合；这是由于补骨脂素、异补骨脂素是脂溶性化合物，不能被水等极性溶剂萃取，但是由于添加了形成了表面活性剂之后，形成内部非极性外部极性的胶束，所以添加表面活性剂之后可以实现补骨脂等化合物的提取；为了使此提取液充分增溶，在提取的时候辅助超声处理； 

再将有效成分从表面活性剂中过滤出： 

提取完成后，提取物离心，上清液加入电解质调节溶液离子强度，在一定温度下恒温水浴平衡，离心后溶液即可分相--分为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层；其中电解质的加入和升高温度可以便于两相的分离，适当的电解质浓度下可获得最高的萃取率，而当浓度再增加时，表面活性剂层浮于溶液表面，使萃取层难于形成两相，从而使萃取率大大降低；同时只有平衡温度达到所用表面活性剂的浊点温度时，体系才能分为两相，温度过高，会导致成分分解； 

在分成两相之后，表面活性剂富集层用超滤膜过滤，回收表面活性剂，滤液旋干，即得包含补骨脂素和异补骨脂素的脂溶性类粗提物。 

具体的，基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，包括以下步骤： 

1）将补骨脂植物粉末用水浸泡之后，加入到一定浓度的表面活性剂，然后在旋涡混合器上充分混合，并在25℃下300W超声处理器超声处理； 

2）提取完成后，提取物3500rpm离心，上清液加入电解质调节溶液离子强度，恒温水浴平衡一段时间后离心，溶液分层：分为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层； 

3）将表面活性剂富集层用超滤膜过滤，回收表面活性剂，滤液旋干，即得包含补骨脂素和异补骨脂素的粗提物。 

其中，表面活性剂包括： 

阴离子表面活性剂：如硬脂酸，十二烷基苯磺酸钠等； 

阳离子表面活性剂：如季铵化合物等； 

两性离子表面活性剂：如卵磷脂，氨基酸型，甜菜碱型、月桂醇聚氧乙烯醚（GENAPOL X080）等； 

非离子表面活性剂：如聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X系列）、脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦，聚山梨酯等； 

所述的电解质包括硫酸盐、硝酸盐、盐酸盐、亚硫酸盐、碳酸盐、亚硫酸盐等； 

所述的过滤用超滤膜温生物膜等天然膜或高分子聚合物膜等合成膜。 

按照上述操作，下面通过实施例给出上述操作中一些参数的确定： 

实施例1表面活性剂的选择 

尝试了阴离子表面活性剂：如硬脂酸，十二烷基苯磺酸钠等；阳离子表面活性剂：如季铵化物等；两性离子表面活性剂：如卵磷脂，氨基酸型，甜菜碱型、月桂醇聚氧乙烯醚（GENAPOL X080）等；非离子表面活性剂：如聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X系列）、脂肪酸甘油酯，脂肪酸山梨坦，聚山 梨酯等； 

结果表明上述的表面活性剂均适用于基于浊点萃取提取补骨脂素和异补骨脂素的方法，其中GENAPOL X080的提取效果最好，可能是由于GENAPOL X080是一种不含有芳香环的脂肪型表面活性剂，在210nm下无紫外吸收，不会干扰补骨脂和异补骨脂的含量测定。 

下面实施例中采用GENAPOL X080作为浊点萃取的表面活性剂。 

实施例2表面活性剂浓度对补骨脂素和异补骨脂素提取效率的影响。 

在其他提取条件不变的情况下，表面活性剂浓度变化对补骨脂素和异补骨脂素提取效率的影响如图1所示，其中，psoralen是补骨脂素的提取效率的变化曲线，ispsoralen是异补骨脂素提取效率的变化曲线； 

可以看出，当表面活性剂浓度从1.0%增加到15%(v/v，体积比)，补骨脂素、异补骨脂素的提取率增加，而表面活性剂浓度从15%增加到20%时，其提取率虽然有所增加但是变化不显著。而且当表明活性剂浓度增加到20%后，提取率继续增大，可是粘性也增加，难于处理，所以本条件下，采用10～15%表面活性剂作为提取的优选条件，其中15%为最佳条件。 

实施3液固比对补骨脂素和异补骨脂素的提取回收率影响。 

在其他提取条件不变的情况下，考察液固比对补骨脂素和异补骨脂素的提取率影响，其中液固比是指所用的表面活性剂溶剂与补骨脂粉末之间的比例，是影响提取效率的另一关键因素。结果如图2所示，优选液固比在50:1～400:1（mL/g），当液固比在150:1(15mL/0.1g)时，提取效率最高。 

实施例4超声萃取时间对萃取回收率的影响 

在其他提取条件不变的情况下，对5-60min的超声辅助萃取时间进行考察。当时间在30min时，补骨脂素和异补骨脂素的萃取率最高，如果时间再延长至35min以上，可能是由于有效成分在长时间超声状态下易于发生变化。所以在以下的实施例步骤中，都采用30min作为超声助溶时间。 

电解质的加入和升高温度可以便于两相的分离，所以考察了实验中平衡时间、平衡温度、电解质的用量对萃取率的影响。 

实施例5电解质用量的影响 

本实施例中，选用氯化钠。在其他条件不变的情况下，于平衡温度50℃下，平衡时间为30min，考察浓度在1.0-5.0mol·L^-1氯化钠溶液对提取率的影响。当离子强度增加时，胶束粒径增加，临界胶束浓度保持恒定。 

从图3中可以看出，2.5mol·L^-1的盐浓度下可获得最高的萃取率。当浓度再增加时，表面活性剂层浮于溶液表面，使萃取层难于形成两相，从而使萃取率大大降低。所以，2.5～3mol·L^-1为优选条件，2.5mol·L^-1的氯化钠溶液下获得最优的离子强度。 

实施例6平衡温度对萃取回收率的影响 

此萃取方法中，只有平衡温度达到所用表面活性剂的浊点温度时，体系才能分为两相，温度过高，会导致成分分解，所以需要采用能实现两相分离的最低温度。从理论上来讲，一般是采用高于表面活性剂浊点温度10–20℃为宜，然而图4显示了萃取率与平衡温度的关系，在50℃的温度下，获得了最高的萃取效率。 

实施例7平衡时间对萃取效率的影响。 

在其他提取条件不变的情况下，尝试了从20min到60min下萃取率的变化，在确定平衡温度50℃的情况下，如图5所示，在20min到40min，时间延长，萃取率增加，但时间再延长至50min，萃取率下降，所以在35～45min范围内，可以获得最高的提取率。 

综合以上实施例条件筛选可知，优化的提取条件为： 

1）将补骨脂植物粉末加入到体积浓度为10～15%的表面活性剂溶液中，其中液固比为150mL:1g～200mL:1g，于旋涡混合器上充分混合，并在25℃下、300W超声处理器超声处理辅助下，提取30～35min； 

2）提取完成后，提取物离心，上清液加入电解质调节溶液离子强度，其中电解质浓度为2.5～3mol·L^-1，50℃恒温水浴平衡35～45min后离心，溶液分层：分为表面活性剂的水溶液层和表面活性剂富集层； 

3）将表面活性剂富集层用超滤膜过滤，回收表面活性剂，滤液旋干，即得包含补骨脂素和异补骨脂素的粗提物。 

进一步的最优的条件为： 

采用GENAPOL X080作为表面活性剂，表面活性剂的体积浓度为15%，液固比在150mL:1g，超声辅助萃取30min；而加入2.5mol·L^-1的氯化钠下在50℃平衡40min；所提取的补骨脂素和异补骨脂素的萃取回收率分别为：79.37±1.79%和76.54±1.04%(n=6). 

对所提取的补骨脂素和异补骨脂素的检测： 

1）对粗提物用HPLC法测定粗提效率。 

在药典的色谱条件下，补骨脂和异补骨脂的保留时间分别为10.6min和12.7min.保留因子分别为6.75和9.04，如图6所示。 

色谱条件： 

色谱柱：Diamonsil C18柱(150mm×4.6mm，5μm)； 

流动相：甲醇-水55:45； 

检测波长：246nm； 

流量：1.0mL·min^-1； 

柱温：30℃； 

进样量：10μL。 

2）与传统的提取方法比较的提取效率 

相比于用甲醇提取法，在同样的条件下，本发明的有效成分萃取效率具有明显优势。以GENAPOL X080作为萃取剂，补骨脂和异补骨脂素的萃取率分别为8.9和10.6mg·g^-1，而甲醇法的萃取率为6.4和9.1mg·g^-1。