用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂及其制备方法

摘要

用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂及其制备方法。其中，用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的多孔高分子载体和利用化学交联固定在所述载体表面的配基，其中配基为3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐。该用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂具有安全无毒、成本低等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于血液净化的免疫吸附剂及其制备方法，特别是用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂及其制备方法。

背景技术

据估计，扩张型心肌病(DCM)的年诊断率约为8/10 万，患病率约为37/10 万，在我国预计患者有50万人以上，其中半数患者年龄在55 岁以下， 5年生存率仅40% 。DCM的特点是以左心室(多数)或右心室有明显扩大，且均伴有不同程度的心肌肥厚，心室收缩功能减退，以心脏扩大、心力衰竭、心律失常、栓塞为基本特征。

近年来，科学家通过对DCM 临床和发病机制的研究发现, 自身抗体介导的免疫过程引起分子水平上的心肌细胞结构和功能紊乱，是引发DCM发病的重要机理之一。DCM患者的血清可检测出多种抗心肌的自身抗体，如抗β1 肾上腺素能受体抗体、抗M2胆碱受体抗体和抗肌球蛋白抗体等，这些抗体会扰乱心肌细胞的正常生理活性，同时这些抗体可以经由补体激活途径以及通过与自身抗原结合形成免疫复合物的途径而对组织产生直接损伤。基于对DCM的免疫发病机制的认识逐渐加深，免疫抑制剂治疗、血浆置换疗法和免疫吸附疗法等免疫相关治疗方法也不断引入到DCM的治疗中。

免疫吸附疗法是近年来发展起来的一种新的血液净化方法，它通过体外循环，利用抗原-抗体免疫反应或物理化学作用除去血浆中的致病性自身抗体或免疫复合物等致病因子，从而达到治病或减轻症状的目的。对于DCM患者，可以通过免疫吸附疗法清除患者体内的抗β1 肾上腺素能受体抗体、抗M2胆碱受体抗体和抗肌球蛋白重链抗体等多种抗心肌的自身抗体从而减少其对心肌的损伤。

费森尤斯医疗的Immunosorba蛋白A免疫吸附剂可以用于治疗扩张型心肌炎。有研究报道证实采用蛋白A免疫吸附柱治疗DCM患者后，可以增加左心室射血分数和心指数，降低左室直径，改善血流动力学。但是，蛋白A免疫吸附剂价格昂贵，治疗成本过高。另外，蛋白A免疫吸附剂采用硫柳汞溶液作为保存液，容易造成患者汞中毒。美国FDA的一起不良反应报道（Model Number 9797200）中显示一名患者在使用费森尤斯公司的immunoadsorba column（蛋白A免疫吸附剂）治疗一段时间后，其体内血液中汞含量达到107 ug/L。此外，任何免疫吸附剂的配基都存在脱落的可能，而蛋白A作为一种有生物活性的蛋白质，其作为配基一旦脱落容易造成免疫性反应，存在潜在的治疗隐患。因此蛋白A免疫吸附剂存在价格昂贵、配基的稳定性差等缺点，同时蛋白A作为一种有生物活性的蛋白质，其配基脱落容易造成免疫性反应

综上，有必要开发更多新的用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种新的可用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂，包括作为吸附剂基质的多孔高分子载体和利用化学交联固定在所述载体表面的配基，其中，所述配基为3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐。

本发明用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂可以安全、高效和有选择性地吸附体液中（例如血液、血浆）的抗β1 肾上腺素能受体抗体、抗M2胆碱受体抗体和抗肌球蛋白抗体等多种抗心肌的自身抗体，且价格便宜。3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐是一种同时含有吲哚基疏水基团和吡喃葡萄糖醛酸负电荷基团的物质，其中吡喃葡萄糖醛酸基团中的羟基可以作为活性点与载体通过化学键键合，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基可以通过电荷诱导作用和疏水作用达到对致病性抗体和循环免疫复合物的吸附作用。3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐作为一种糖类物质，安全无毒，由于其不属生物活性物质，即使作为配基脱落亦不会造成免疫性反应。此外，相对生物活性物质高昂的生产成本，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐作为配基的免疫吸附剂，成本低廉，易于保存。固载3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠的吸附剂只需保存在灭菌注射用水中即可，不会引入其它毒害物质。

另一技术方案为，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基的固载量至少为40μmol/mL。

另一技术方案为，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基的固载量为40－60μmol/mL。

另一技术方案为，多孔高分子载体采用亲水性天然高分子材料。由于亲水性天然高分子材料本身不会对蛋白质产生吸附，因此不会造成凝血机制激活等不良反应，具备优秀的血液相容性。本发明中的亲水性天然高分子材料可以是琼脂糖、纤维素、壳聚糖等。

本发明要解决的另一技术问题是提供一种制备上述免疫吸附剂的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：制备用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂方法，用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂包括作为吸附剂基质的多孔高分子载体和利用化学交联固定在所述载体表面的配基，其中配基为3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐；该方法包括以下步骤：

步骤一：在浓度为0.05-0.5M、pH值为10-12的磷酸钠缓冲溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配制成质量分数在2-8%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐溶液；

步骤二：将环氧活化后的多孔高分子载体投入到步骤一所制得的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐溶液中，所述3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐溶液与载体的体积比为1-5:1，将反应温度升至40-60 ℃，反应6-24h，用水冲洗至中性，并洗净未反应的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐，即得用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂。

通过本发明上述方法制备的吸附剂可以用于清除多种抗心肌的自身抗体，可以作为治疗扩张型心肌病一种新选择。其中本发明所述的用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂可以根据患者需求选用血浆吸附用的吸附剂或全血灌流用的吸附剂，因此本发明为扩张型心肌病患者提供了更多的治疗方法。  

另一技术方案为，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基的固载量至少为40μmol/mL。

另一技术方案为，3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基的固载量为40－60μmol/mL。

另一技术方案为，多孔高分子载体采用亲水性天然高分子材料。由于新水性天然高分子材料本身不会对蛋白质产生吸附，因此不会造成凝血机制激活等不良反应，具备优秀的血液相容性。本发明中的亲水性天然高分子材料可以是琼脂糖、纤维素、壳聚糖等。琼脂糖、纤维素及壳聚糖等载体的制备方法可以与现有技术相同。下面以琼脂糖载体为例，举例说明其制备及环氧活化方法。

琼脂糖载体制备及环氧活化方法可以包括以下步骤：

步骤1：琼脂糖凝胶球的制备：

将配制好的质量分数为2-6%的琼脂糖溶液缓慢倾入含有质量分数为0.1-3%聚山梨酯-80（吐温-80）的甲苯和三氯甲烷混合液的三口瓶中，其中三口瓶置于40-60 ℃水浴中，甲苯和三氯甲烷的体积比为0.5-5:1；调节搅拌速度，使琼脂糖溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。待琼脂糖液滴冷却成凝胶球后，过筛并用大量水冲洗，血浆用DCM免疫吸附剂粒径以50μm-300μm为宜；全血灌流用DCM免疫吸附剂粒径以300-1000μm为宜。

步骤2：琼脂糖凝胶球的交联

将步骤1所得的琼脂糖凝胶球，加入到浓度为0.5-2.5M的NaOH水溶液中，NaOH水溶液和凝胶球体积比为0.5-5:1，加入体积为琼脂糖凝胶球体积0.1-1倍的环氧氯丙烷，在25-50℃的条件下反应0.5-2h，反应完成后先用水冲洗至中性，再用酒精冲洗净未反应完全的环氧氯丙烷，最后再用水将酒精冲净。如果用于制备血浆吸附用DCM吸附剂则按上述步骤进行一次交联即可；如果用于制备全血灌流用DCM吸附剂则需按上述条件进行一次交联反应后，再按上述条件再进行第二次交联，经过两次交联后，琼脂糖载体强度大幅提高，既能满足全血灌流要求。

步骤3：琼脂糖凝胶球的环氧氯丙烷活化

取步骤2所得交联琼脂糖载体，加入体积为交联琼脂糖载体的体积0.1-1二甲基亚砜，加入体积为交联琼脂糖载体的体积0.1-1环氧氯丙烷，加入体积为琼脂糖凝胶球体积0.5-2倍NaOH水溶液，其中NaOH水溶液浓度为0.5-2.5M，并在30-60℃反应2-6h，用水冲洗至中性，并洗净未反应的二甲基亚砜和环氧氯丙烷，即得到环氧氯丙烷活化的琼脂糖微球，采用硫代硫酸钠法滴定环氧密度值，活化密度在60-120μmol/mL之间为宜。

本发明制备用于治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂的方法可以通过控制吸附剂的粒径范围，根据需要选择制备用于全血灌流用吸附剂或制备血浆用吸附剂。如，制备用于全血灌流用吸附剂时，可以将吸附剂粒径范围控制在300-1000μm。制备血浆用吸附剂时，可以将吸附剂粒径范围控制50-300μm。

下面结合具体实施方式对本发明予以详细介绍。                                                          

具体实施方式

实施例1

一种血浆吸附用DCM免疫吸附剂制备方法如下：

步骤1：琼脂糖凝胶球的制备：

将装有搅拌装置的500mL 三口瓶置于60 ℃水浴中，向瓶内加入甲苯145 mL、三氯甲烷55mL、聚山梨酯-80（吐温-80）5 mL。搅拌均匀并保温。将100mL配制好的质量分数为4%的琼脂溶液缓慢倾入三口瓶中，调节搅拌速度，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。待分散均匀后(约 30min)撤去水浴，在室温下搅拌使体系自然冷却。体系冷却后，弃去上层有机溶剂，用大量水冲洗合成的球状琼脂凝胶载体，筛选出50～300μm的凝胶球，用蒸馏水洗涤数次，于4 ℃冰箱中湿态保存。

步骤2:琼脂糖凝胶球的交联：

在装有搅拌装置的500mL 三口瓶中，依次投入上述琼脂凝胶球100mL， 1.5M的NaOH溶液200mL，环氧氯丙烷10mL，轻微搅拌并于40℃反应30min。反应完成后，将交联后琼脂糖微球滤出，并用大量水冲洗至中性。

步骤3：交联琼脂糖载体的环氧氯丙烷活化

取交联琼脂糖载体20 mL，依次加入20 mL二甲基亚砜、15 mL的环氧氯丙烷和20 mL 2M 的NaOH溶液，并在40℃反应2h，用水冲洗至中性，并洗净未反应的二甲基亚砜和环氧氯丙烷，即得到环氧氯丙烷活化的琼脂糖微球，采用硫代硫酸钠法滴定环氧密度值，为117μmol/mL。

步骤4：3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基固载

在36.8g浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐3.2g，搅拌溶解获得质量分数为8%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐溶液，之后投入10mL环氧活化琼脂糖微球，于40 ℃下反应15h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐冲洗干净，即得血浆吸附用治疗扩张型心肌病的免疫吸附剂。利用凯氏定氮法测得吸附剂上3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基的固载量为54.8μmol/mL。

吸附剂性能评价：

取扩张型心肌病患者血浆3mL加入到1mL实施1的吸附剂中，在37℃下震荡2h后，采用ELISA法（酶联免疫吸附测定法）分别测定上清液中抗β1 肾上腺素能受体抗体、抗M2胆碱受体抗体和抗肌球蛋白抗体的变化，结果值参见表1。

实施例2

一种全血灌流用DCM免疫吸附剂制备方法如下：

步骤1：琼脂糖凝胶球的制备：

将装有搅拌装置的500mL 三口瓶置于60 ℃水浴中，向瓶内加入甲苯145 mL、三氯甲烷55mL、吐温80 5 mL。搅拌均匀并保温。将100mL配制好的质量分数为6%的琼脂溶液缓慢倾入三口瓶中，调节搅拌速度，使琼脂溶液在有机相中分散成大小适宜的液滴。待分散均匀后(约 30min)撤去水浴，在室温下搅拌使体系自然冷却。体系冷却后，弃去上层有机溶剂，用大量水冲洗合成的球状琼脂凝胶载体，筛选出300～800μm的凝胶球，用蒸馏水洗涤数次，于4 ℃冰箱中湿态保存。

步骤2:琼脂糖凝胶球的一次交联和二次：

在装有搅拌装置的500mL 三口瓶中，依次投入上述琼脂凝胶球100mL， 1.5M的NaOH溶液200mL，环氧氯丙烷10mL，轻微搅拌并于40℃反应30min，即完成一次交联。将一次交联后的琼脂糖载体按上述条件再进行第二次交联，将二次交联后琼脂糖微球滤出，并用大量水冲洗至中性，即得到高强度琼脂糖载体。

步骤3：高强度琼脂糖载体的环氧氯丙烷活化

取高强度琼脂糖载体20 mL，依次加入20 mL二甲基亚砜、15 mL的环氧氯丙烷和20 mL 2M 的NaOH溶液，并在40℃反应2h，用水冲洗至中性，并洗净未反应的二甲基亚砜和环氧氯丙烷，即得到环氧氯丙烷活化的高强度琼脂糖微球，采用硫代硫酸钠法滴定环氧密度值，为136μmol/mL。

步骤4：3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐配基固载

在38g浓度为0.2M、pH值为11的磷酸钠缓冲溶液中，投入3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐2g、搅拌溶解获得5%的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐溶液，之后投入10mL上述环氧活化后的高强度琼脂糖微球，于40 ℃下反应15h，反应结束后用pH值为11的磷酸钠缓冲溶液冲洗若干次，将未反应的3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐冲洗干净，即得全血灌流用DCM免疫吸附剂。利用凯氏定氮法测得吸附剂的配基固载量为45.3μmol/mL。

吸附剂性能评价：

由于无法获得DCM患者全血样品，仍然采用DCM患者血浆对实施例2的吸附剂进行性能评价。取DCM患者血浆3mL加入到1mL实施2的吸附剂中，在37℃下震荡2h后，采用ELISA法分别测定上清液中抗β1 肾上腺素能受体抗体、抗M2胆碱受体抗体和抗肌球蛋白抗体的变化，结果值参见表1。

表1：DCM吸附剂对多种抗心肌自身抗体的吸附率

   抗β1 肾上腺素能受体抗体的吸附率抗M2胆碱受体抗体的吸附率抗肌球蛋白抗体的吸附率实施例147%43%39%实施例239%37%31%

从表1可以看出，本发明以多孔高分子载体为基质，利用化学交联固载3-吲哚基-BETA-D-葡萄糖醛酸钠盐的吸附剂对血浆中的抗β1 肾上腺素能受体抗体、抗M2胆碱受体抗体、抗肌球蛋白抗体具有良好的吸附作用，可以用于清除多种抗心肌的自身抗体，可以作为治疗扩张型心肌病一种新选择。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案和技术构思作出其他各种相应的改变和变形，而所有这些改变和变形都应属于本发明权利要求的保护范围。