一株类芽孢杆菌及其在生产碱性果胶酶中的应用

摘要

本发明公开了一株类芽孢杆菌及其在生产碱性果胶酶中的应用。本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，命名为SJN-PL0602，保藏号为CGMCC No.5696。本发明还保护一种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤：(1)将类芽孢杆菌SJN-PL0602接种至发酵培养基，得到OD

说明书

技术领域

本发明涉及一株类芽孢杆菌及其在生产碱性果胶酶中的应用。

背景技术

碱性果胶酶(E.C.4.2.2.2)是一类能在碱性条件下高效分解植物组织中果胶质 (由D-半乳糖醛酸以α-1，4糖苷键连接形成的直链状的聚合物)的酶的总称。碱性果 胶酶是纺织用酶的一种，主要应用于棉织物的生物精练，除去棉纤维中的果胶等杂质。 酶处理法相比于传统碱处理法，具有条件温和、环境友好、能耗低、易实现清洁生产 等优势，也可提高棉织物的品质，所以酶处理工艺取代传统高温高碱的化学工艺具有 重要意义。

由于碱性果胶酶在生物精炼中发挥重要的作用，许多国内外学者从事这方面的研 究工作。现有菌株的碱性果胶酶产量往往处于较低的水平，即便经过了发酵优化，酶 活力也只有1～10U/mL。

发明内容

本发明的目的是提供一株类芽孢杆菌及其在生产碱性果胶酶中的应用。

本发明提供的类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，命名为SJN-PL0602，已于2012 年1月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地 址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏号为CGMCC No.5696。类芽孢杆菌 (Paenibacillus sp.)SJN-PL0602 CGMCC No.5696简称类芽孢杆菌SJN-PL0602。

所述类芽孢杆菌SJN-PL0602可用于生产碱性果胶酶。

本发明还保护一种生产碱性果胶酶的方法，包括如下步骤：

(1)将类芽孢杆菌SJN-PL0602接种至发酵培养基，得到OD_600nm＝0.05-0.15(如 0.05-0.1或0.1-0.15)的发酵初始体系；

(2)将发酵初始体系进行如下发酵：先30-37℃(如30-35℃或35-37℃)振荡 培养8-12小时(如8-10小时或10-12小时)，再22-26℃(如20-24℃或24-26℃) 振荡培养36-40小时(如36-38小时或38-40小时)，得到碱性果胶酶。

所述发酵培养基制备方法如下：取5-12g(如5-9g或9-12g)蛋白胨、10-24g(如 10-17g或17-24g)酵母提取物、3-5g(如3-4g或4-5g)甘油、3-6g(如3-5g或5-6g) 果胶、0.02-0.1g(如0.02-0.06g或0.06-0.1g)CaCl₂、2.31-3g(如2.31-2g或2-3g) 磷酸二氢钾和12.54-15g(如12.54-14g或14-15g)磷酸氢二钾，用水溶解并定容至 1L。

所述发酵培养基的pH可为7.0-7.5(如7.0-7.2或7.2-7.5)。

所述类芽孢杆菌SJN-PL0602可以以种子液的方式接种至所述发酵培养基。

所述种子液的制备方法如下：将类芽孢杆菌SJN-PL0602接种至种子培养基， 30-37℃(如30-35℃或35-37℃)振荡培养至OD_600nm＝1-3(如1-2或2-3)，即为种子 液。

所述种子培养基的制备方法如下：取10-24g(如10-17g或17-24g)胰蛋白胨、 5-12g(如5-9g或9-12g)酵母提取物和5-10g(如5-8g或8-10g)氯化钠，用水溶 解并定容至1L。

所述种子培养基的pH可为6.8-7.2(如6.8-7.0或7.0-7.2)。

以上任一所述振荡培养可为150-200r/min(如150-180r/min或180-200r/min) 的振荡培养。

以上任一所述方法生产得到的碱性果胶酶均属于本发明的保护范围。

所述碱性果胶酶可用于降解多聚半乳糖醛酸。

所述碱性果胶酶可用于以多聚半乳糖醛酸为底物生产不饱和多聚半乳糖醛酸。

所述碱性果胶酶为具有如下功能的物质：在碱性环境(如pH9.4)中，将多聚半 乳糖醛酸转化为不饱和多聚半乳糖醛酸。

本发明从天津盐碱地土壤分离筛选出一株类芽孢杆菌，具有生产碱性果胶酶的能 力。本发明还提供了基于该类芽孢杆菌生产碱性果胶酶的方法，即采用双阶段表达， 首先在较高温度条件下使菌体快速生长，再通过低温表达策略实现果胶裂解酶的高效 表达。低温培养有利于酶的正确折叠和实现其胞外分泌，同时也减少了发酵液中蛋白 酶的积累，有益于碱性果胶酶的保藏稳定性。采用本发明的方法，发酵上清的酶活力 可达到较高水平(28U/mL)，具备潜在工业化价值(如麻类脱胶、生物制浆、环境保 护等行业)，为后续的工业化研究奠定了基础。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明， 均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实 验，结果取平均值。

实施例1、类芽孢杆菌SJN-PL0602的筛选、鉴定和保藏

一、菌株的筛选

1、从北京果园、天津水果滩、天津盐碱地等分别收集腐烂的水果和土壤，作为菌 种分离的样本。

2、将各个样本用无菌水稀释，于富集培养基进行富集培养。

富集培养基(g/L)：果胶5-10、硫酸铵2-5、氯化钠1、硫酸镁1-3、磷酸氢二 钾1、磷酸二氢钾6，用5mol/L NaOH调pH至7.0-7.5。富集培养条件：250mL摇瓶(装 液量为25mL)，摇床转速为200r/min，37℃培养1d。

3、初筛

将富集培养物进行10⁶-10⁹倍稀释后，取0.1mL涂布于筛选培养基平板，37℃倒置 培养1-2d，获得单菌落，用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，1％)显影，选取有透明圈 产生的菌落进行转接，挑选透明圈与菌落直径比例大的单菌落进行发酵复筛。筛选培 养基(g/L)：果胶5-10、酵母膏5-10、蛋白胨5-10、硫酸镁1-2、磷酸氢二钾1、琼 脂20，pH7.0-7.5。获得40株菌。

4、复筛

将初筛得到的菌种进行纯种分离，再接种到摇瓶，于发酵培养基中培养，进行碱 性果胶酶酶活力验证。

发酵培养基(g/L)：蛋白胨5-12、酵母提取物10-24、甘油3-5、果胶3-5、CaCl₂0.02-0.2、磷酸二氢钾2.31、磷酸氢二钾12.54，pH 7.0-7.5。发酵培养条件：250mL 摇瓶(装液量为25mL)，摇床转速为200r/min，37℃培养1-3d。获得多株产碱性果胶 酶的菌株。将碱性果胶酶产量最高的菌株命名为SJN-PL0602。

二、菌株的鉴定

形态特征：菌落呈浅黄褐色或近于无色，表面湿润；显微镜下观察到细胞为杆状， 菌体长短不一。

生理生化特征见表1。

表1SJN-PL0602的生理生化特征(“+”表示阳性，“-”表示阴性)

  接触酶   +   L-阿拉伯糖   +   硝酸盐还原   +   V-P   +   D-木糖   +   2％NaCl   +   葡萄糖产酸   +   D-甘露醇   +   5％NaCl   +   葡萄糖产气   -   水解明胶   -   7％NaCl   +   丙氨酸脱氨酶   -   水解淀粉   +   10％NaCl   +   利用柠檬酸盐   -

16Sr DNA序列测定结果见序列表的序列1，与现有类芽孢杆菌属菌株的同源性为 98％。

三、菌株的保藏

步骤二的鉴定结果表明，SJN-PL0602属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus)。类芽 孢杆菌(Paenibacillus sp.)SJN-PL0602已于2012年1月9日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3号)，保藏号为CGMCC No.5696。类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)SJN-PL0602 CGMCC No.5696简称类芽孢杆菌SJN-PL0602。

实施例2、应用类芽孢杆菌SJN-PL0602生产碱性果胶酶

一、培养基的制备

种子培养基(pH6.8)：取10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和5g氯化钠，用水溶解 并定容至1L；121℃灭菌30min。

发酵培养基(pH7.0)：取5g蛋白胨、10g酵母提取物、3g甘油、3g果胶、0.02g CaCl₂、2.31g磷酸二氢钾和12.54g磷酸氢二钾，用水溶解并定容至1L；121℃灭菌 30min。

二、应用类芽孢杆菌SJN-PL0602生产碱性果胶酶

1、将类芽孢杆菌SJN-PL0602接种于种子培养基(采用250mL摇瓶，种子培养基 的装液量为25mL)，30℃振荡培养(150r/min)至OD_600nm＝1，即为种子液。

2、将步骤1的种子液转接至30mL发酵培养基(采用250mL摇瓶)，得到OD_600nm＝0.05 的发酵初始体系；发酵过程如下(共38小时)：先30℃振荡培养(150r/min)8小时 (菌体生长阶段)，再22℃振荡培养(150r/min)36小时(表达碱性果胶酶阶段)。

3、将完成步骤2的发酵体系离心(12000r/min，5min)收集上清液。

三、酶活测定

将步骤二得到的上清液用甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.4)稀释后进行酶活 测定，具体方法如下：

实验组：在2ml溶液甲中加入20μL待测溶液，45℃反应15min，加入3mL0.03mol/L H₃PO₄水溶液(终止液)，测定235nm的吸光度值；

对照组：在2ml溶液甲中依次加入3mL 0.03mol/L H₃PO₄水溶液和20μL待测溶液， 测定235nm的吸光度值。

溶液甲的配方：含0.2g/100ml多聚半乳糖醛酸(购自Sigma-Aldrich公司，货号 81325-50G)和0.44mmol/L CaCl₂的甘氨酸-NaOH缓冲液(0.2mol/L，pH9.4)。

碱性果胶酶一个标准酶活单位(1U)定义为：在上述条件下，1min反应时间内使 PGA产生1μmol的不饱和聚半乳糖醛酸所需的酶量。

碱性果胶酶酶活(U/mL)计算公式如下：

PGL

ΔOD₂₃₅＝实验组235nm的吸光度值-对照组235nm的吸光度值；

4600为不饱和聚半乳糖醛酸在235nm处的摩尔吸光系数，单位为L·mol^-1·cm^-1；

t为酶促反应时间(在酶反应的线性范围内)，单位为min，本实验中为15min；

b为比色杯厚度，单位为cm，本实验中为1cm；

V₀为体系总体积数，单位为mL，本实验中为5.02mL；

V₁为酶液体积数，单位为mL，本实验中为0.02mL。

步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为28U/mL。

实施例3、应用类芽孢杆菌SJN-PL0602生产碱性果胶酶

一、培养基的制备

种子培养基(pH7.2)：取24g胰蛋白胨、12g酵母提取物和10g氯化钠，用水溶 解并定容至1L；121℃灭菌30min。

发酵培养基(pH7.5)：取12g蛋白胨、24g酵母提取物、5g甘油、6g果胶、0.1g CaCl₂、3g磷酸二氢钾和15g磷酸氢二钾，用水溶解并定容至1L；121℃灭菌30min。

二、应用类芽孢杆菌SJN-PL0602生产碱性果胶酶

1、将类芽孢杆菌SJN-PL0602接种于种子培养基(采用250mL摇瓶，种子培养基 的装液量为25mL)，37℃、振荡培养(200r/min)至OD_600nm＝3，即为种子液。

2、将1mL步骤1的种子液转接至20mL发酵培养基(采用250mL摇瓶)，即为发酵 初始体系，发酵初始体系的OD_600nm＝0.15；发酵过程(共52小时)如下：先37℃振荡 培养(200r/min)12小时(菌体生长阶段)，再26℃振荡培养(200r/min)40小时(表 达碱性果胶酶阶段)。

3、将完成步骤2的发酵体系离心(12000r/min，5min)收集上清液。

三、酶活测定

同实施例2的步骤三。

步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为23U/mL。

实施例4、应用类芽孢杆菌SJN-PL0602生产碱性果胶酶

一、培养基的制备

种子培养基(pH7.0)：取17g胰蛋白胨、9g酵母提取物和8g氯化钠，用水溶解 并定容至1L；121℃灭菌30min。

发酵培养基(pH7.2)：取9g蛋白胨、17g酵母提取物、4g甘油、5g果胶、0.06g CaCl₂、2.6g磷酸二氢钾和14g磷酸氢二钾，用水溶解并定容至1L；121℃灭菌30min。

二、应用类芽孢杆菌SJN-PL0602生产碱性果胶酶

1、将类芽孢杆菌SJN-PL0602接种于种子培养基(采用250mL摇瓶，种子培养基 的装液量为25mL)，35℃、180r/min摇床培养至OD_600nm＝2，即为种子液。

2、将1mL步骤1的种子液转接至25mL发酵培养基(采用250mL摇瓶)，即为发酵 初始体系，发酵初始体系的OD_600nm＝0.1；发酵过程(共46小时)如下：先35℃、180r/min 振荡培养10小时(菌体生长阶段)，再24℃、180r/min振荡培养38小时(表达碱性 果胶酶阶段)。

3、将完成步骤2的发酵体系离心(12000r/min，5min)收集上清液。

三、酶活测定

同实施例2的步骤三。

步骤二得到的上清液的碱性果胶酶酶活力为20U/mL。