拟南芥ERF蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用

摘要

本发明公开了一种ERF蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中的应用。本发明所提供的应用为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在调控植物花粉育性中的应用。实验证明，利用RNAi方法抑制ERF基因在拟南芥中的表达，结果造成拟南芥可育花粉数量大幅降低，雄性不育，不结实。本发明为找出更简单的创制作物高产性状的思路和方法奠定了基础，同时也对培育出新的雄性不育系具有重要意义。

说明书

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，涉及一种拟南芥ERF蛋白及其编码基因在 调控植物花粉育性中的应用。

背景技术

从上世纪70年代以来，杂种优势利用为我国水稻生产做出了重大的贡献。面临我 国经济发展对农业生产所提出“高产、优质、高效、安全、生态”的新的重大需求， 能否进一步发掘杂种优势的应用潜力以应对，就成为摆在当代科学家面前的一个严峻 挑战。

杂种优势的形成基于两个不同亲本的组合。要在现有应用的基础上进一步发掘其 潜力，除了需要加强杂种优势形成机制的研究之外，还急需建立有效的方法来创造雄 性不育性状，以便有效扩大杂交组合的筛选和优秀组合在生产上的应用。

目前，在育种工作和生产上广泛应用的雄性不育性状多来自于自然突变及其性状 转育株系。雄性不育性状的来源十分有限，是扩大杂交组合筛选特别是应用的严重制 约因子。虽然在20世纪90年代初美国科学家就已经证明通过生物技术的方法可以创 制人工控制的雄性不育性状，但是，按照目前国际通行的规则，所有具有应用潜力的 创新都受到知识产权保护。因此，寻找新的、具有自主知识产权的创制人工控制雄性 不育性状的思路和方法，已经成为希望把握发掘杂种优势应用潜力主动权的国家和地 区所面临的无法回避、亟待解决的关键问题之一。

长期以来，人们一直利用常规育种的方法选育不育系，或者把不育性从一个品种 转育到另一个品种中，这些方法周期长、见效慢，不能满足生产发展的迫切需要。目 前，也有许多控制植物雄性不育性的基因被克隆，但是由于植物的不育性受核基因、 线粒体基因、叶绿体基因和环境因素的影响，作用机理比较复杂，人们对其认识还不 足，所以难在短期内获得明显的效果，基因工程雄性不育与用常规方法选育雄性不育 相比具有一些特点：选育周期缩短，育性相对稳定，受环境影响小，对基因型依赖少， 环境污染少。Mariani等人在1990年开创了一个创造植物雄性不育的新途径。他们应 用来自于烟草的花药绒毡层特异启动子（TA29）和核糖核酸酶基因（Barnase）嵌合 后转化烟草和油菜，由于核糖核酸酶的作用，转基因烟草和油菜的花药绒毡层被破坏， 形成花粉败育，而转基因烟草的其他器官发育正常。目前除了Barnase基因以外，还 有许多其他功能基因被应用于基因工程雄性不育的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种拟南芥ERF蛋白及其编码基因在调控植物花粉育性中 的应用。

本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质 （命名为ERF蛋白）或其编码基因（命名为ERF基因）在调控植物花粉育性中应用。

上述应用具体体现在：所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的ERF蛋白 在所述植物中的表达量越低，所述植物的花粉育性越低；所述由序列表中序列1所示 的氨基酸序列组成的ERF蛋白在所述植物中的表达量越高，所述植物的花粉育性越 高。

由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的（ERF蛋白）或其编码基因（ERF基 因）在选育花粉育性降低或提高的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围。

在实际应用中，当所选育的植物品种为花粉育性降低的植物品种时，需将所述ERF 蛋白表达量较低的植株作为亲本进行杂交。当所选育的植物品种为花粉育性提高的植 物品种时，需将所述ERF蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交。

本发明的再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，具体可为如下（A）或（B）：

（A）培育花粉育性提高的转基因植物的方法，包括如下步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基 因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，花粉育性提高的转基 因植物；

（B）培育花粉育性降低的转基因植物的方法，包括如下步骤：

c）在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因 进行抑制表达，得到转基因植物；

d）从步骤c）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，花粉育性降低的转基 因植物。

在上述应用或方法中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质 （ERF蛋白）的编码基因（ERF基因）是如下（1）至（4）中任一所述的DNA分子：

（1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子；

（2）序列表中序列2所示的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序 列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

（4）与（1）-（3）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表 中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC， 0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

其中，序列2由660个核苷酸组成，整个序列2即为所述ERF基因的编码序列 （ORF）；序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质，序列1由219个氨基酸残基组成。

在上述方法（B）中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列 组成的蛋白质的编码基因进行抑制表达，可为任何可降低所述目的植物中所述ERF基 因的表达的方法。

在本发明中，所述在目的植物中对由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋 白质的编码基因进行抑制表达，具体是通过将序列表中序列表中序列4所示的DNA 片段（Artifical RNAi890）转入所述目的植物中实现的。

序列4共由269个核苷酸组成。其中，序列4所示的DNA片段在所述目的植物 体内表达得到Artificial RNAi ERF“TATATGAGGCTCCTAAGACTT”，它进一步通过 与序列2所示的ERF基因的第268-288位相互作用，从而实现对ERF基因的沉默。

进一步，所述序列表中序列4所示的DNA片段，是通过重组表达载体的形式转 入所述目的植物中的；所述序列表中序列4所示的DNA片段转录的启动子是35S启 动子。

更为具体的，所述重组表达载体为在pH7WG2D载体的attR1和attR2之间插入了 序列表中序列4所示DNA片段的重组质粒。

在上述方法（A）中，所述由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的 编码基因也可通过重组表达载体的形式导入所述目的植物中。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农 杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、 pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生 植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺 苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可 引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转 录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如 花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱 导型启动子rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用 本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子， 这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列 的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源 是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或 结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载 体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、 具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因， 直接以逆境筛选转化植株。

在上述培育转基因植物的方法（A）和方法（B）中，将携带有所述ERF基因的 所述重组表达载体，或携带有序列表中序列4所示的DNA片段的所述重组表达载体 导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA 转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转 化的植物组织培育成植株。

在上述各应用或各方法中，所述植物即可为双子叶植物，也可为单子叶植物。在 本发明中，所述植物具体为双子叶植物拟南芥，如哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis  ecotype,Col-0）。

序列表中序列4所示的DNA分子也属于本发明的保护范围。

含有所述DNA分子的重组载体、重组菌、表达盒或转基因细胞系也属于本发明 的保护范围。

所述重组载体既可以为重组表达载体，也可以为重组克隆载体。在本发明的一个 实施例中，所述重组表达载体中启动所述序列表中序列4所示的DNA分子转录的启 动子为35S启动子。更为具体的，所述重组表达载体为在pH7WG2D载体的attR1和 attR2之间插入了序列表中序列4所示DNA片段的重组质粒。

实验证明，利用RNAi方法抑制ERF基因在拟南芥中的表达，结果造成拟南芥可 育花粉数量大幅降低，雄性不育，不结实。本发明为找出更简单的创制作物高产性状 的思路和方法奠定了基础，同时也对培育出新的雄性不育系具有重要意义。

附图说明

图1为pBGWFS7载体图谱。

图2为转入重组载体pBGWFS7-pro890的转基因拟南芥的PCR鉴定。其中，泳 道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000，3000，2000，1000,750,500， 300,200bp；泳道1-7为阳性植株；泳道8为野生型拟南芥植株。

图3为用GUS染色法测定ERF启动子在拟南芥花器官的功能。其中，A为哥伦 比亚生态型拟南芥的GUS检测结果；B-J为转ERF启动子驱动的GUS基因植株中GUS 检测结果。

图4为RS300载体的载体图谱。

图5为amiRNA载体的构建过程中的PCR扩增示意图。

图6为重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的PCR鉴定结果。其中，泳道M 为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000，3000，2000，1000，750，500， 300，100bp；泳道1-12为12个质粒克隆，泳道1,5,6,7,8,9,10和12为鉴定阳性的质粒。

图7为重组农杆菌EHA105/Artificial RNAi890的PCR鉴定结果。泳道M为DNA 分子量标准，各条带从大到小依次为5000，3000，2000，1000,750,500，300,200bp； 其余各泳道均为鉴定阳性的重组农杆菌。

图8为部分T₁代转入pH7WG2D-artificial RNAi890载体的拟南芥植株的PCR鉴 定结果。其中，泳道M为DNA分子量标准，各条带从大到小依次为5000，3000，2000， 1000,750,500，300,200bp；泳道1-3为未转基因的哥伦比亚生态型拟南芥；泳道4-8 为鉴定阳性的转入pH7WG2D-artificial RNAi890载体的拟南芥植株。

图9为转基因拟南芥植株的表型。其中，A为哥伦比亚生态型拟南芥（左）和鉴 定阳性的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的转基因拟南芥（右）植 株整体表型；B和C均为鉴定阳性的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890 的拟南芥转基因植株整体表型；D为哥伦比亚生态型拟南芥（左）和鉴定阳性的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的转基因拟南芥（右）的角果；E-H为 哥伦比亚生态型拟南芥（左）和鉴定阳性的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial  RNAi890的转基因拟南芥（右）的花；I为哥伦比亚生态型拟南芥（左）和鉴定阳性 的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的转基因拟南芥（右）的花的解 剖图。

图10为转基因拟南芥花粉育性检测结果（亚历山大染色）。其中，A为哥伦比亚 生态型拟南芥；B-I为鉴定阳性的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的 转基因拟南芥。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pENTR/D载体：Invitrogen公司，其产品目录号为K2420-20。

pBGWFS7载体：中科院遗传所；

http://gateway.psb.ugent.be/search/index/transcriptional_reporters/any。

pH7WG2D载体：记载于“阎淑滑，周波，赵霞等.以木糖异构酶基因xy1A为选 择标记的Gateway系统植物表达载体的构建.生物技术通讯，2010年01期”一文中。 http://gateway.psb.ugent.be/search/index/transcriptional_reporters/any。

哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis ecotype Col-0）：购自Arabidopsis Biological  Resource Center，USA。

农杆菌EHA105：北京全式金生物工程有限公司。

下述实施例中获得转基因拟南芥的过程中所涉及的培养基如下：

MS固体培养基：MS粉末（购自于sigma公司）4.4g/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L； pH5.8。以上各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。

LB固体培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L，琼脂20g/L；pH7。 以上各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。

LB液体培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl10g/L；pH7。以上各浓 度为相应组分在培养基中的终浓度。

实施例1、ERF转基因植物的获得及鉴定

本实施例中所涉及的ERF基因来源于拟南芥（Arabidopsis thaliana），其核苷酸序 列如序列表中序列2所示，序列2由660个核苷酸组成，整个序列2即为编码序列 （ORF）；序列2编码序列表中序列1所示的蛋白质（ERF蛋白），序列1由219个氨 基酸残组成。

一、amiRNA载体的构建

1、含有拟南芥内源ERF启动子的重组载体pBGWFS7-pro890的构建

（1）引物设计

根据NCBI上的拟南芥内源ERF启动子序列（GenBank：NC_003070.9(Up date: 2013-3-28)所示的拟南芥基因组序列的第4391152-4391733位，序列3），按照pENTR/D 载体的要求，正向引物5’端的序列为CACCACAAA，设计如下用于扩增ERF启动子 的引物对：

pENTRpro890F：5’-CACCACAAAGATATCTGTCTGTTTGA-3’（该序列中非下划 线处的序列为序列3的第1-17位）；

pENTRpro890R：5’-GTTCACAATATTCAGA-3’（序列表中序列3的第567-582位 的反向互补序列）。

（2）PCR扩增

以哥伦比亚生态型拟南芥（Arabidopsis ecotype Col-0）的基因组DNA为模板，采 用上述引物对，通过RT-PCR方法获得有ERF启动子功能的序列，经测序鉴定PCR 产物的核苷酸序列为“CACCACAAA+序列表的序列3”，将该PCR产物记为attB-PCR 产物。

（3）载体构建

利用invitrogen公司的pENTR/D载体，将ERF启动子片段通过同源重组的方法连 接入pBGWFS7载体（图1）中，得到含有拟南芥内源ERF启动子的重组载体 pBGWFS7-pro890。具体如下：

A）BP反应

BP反应体系：

attB-PCR产物（>10ng）                  1-7μl

pENTR/D载体（150ng/μl）                1μl

5×BP Clonase enzyme mix                2μl

TE Buffer,pH8.0                      补足至10μl

25℃温浴1-16h。反应结束后，取1-5μl BP反应液转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性 克隆，获得转入目的片段（ERF启动子）的中间载体，将其命名为pENTR/D-pro890。 经测序pENTR/D-pro890重组质粒结构表述为：在pENTR/D载体的attP1和attP2之间 插入序列表中序列3所示DNA片段的重组质粒。

B）LR反应

pENTR/D-pro890（50-150ng）               1-7μl

目的载体pBGWFS7（150ng/μl）              1μl

5×LR Clonase enzyme mix                  2μl

TE Buffer,pH8.0                       补足至10μl

25℃温浴1-16h。终止反应后，取1-5μl LR反应液转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性 克隆，获得转入目的片段（ERF启动子）的重组质粒。将经测序表明在pBGWFS7载 体的attR1和attR2之间插入序列表中序列3所示DNA片段的重组质粒命名为 pBGWFS7-pro890。在重组载体pBGWFS7-pro890中，ERF启动子（序列3）位于GUS 基因上游，可驱动GUS基因转录。

2、重组载体pBGWFS7-pro890中ERF启动子功能鉴定

将步骤1获得重组载体pBGWFS7-pro890采用电击法（具体方法参见步骤二相关 内容）转入农杆菌EHA105，28℃培养48h，获得重组农杆菌。再将重组农杆菌采用蘸 花法（具体方法参见步骤二相关内容）将重组农杆菌转入哥伦比亚生态型拟南芥 （Arabidopsis ecotype Col-0）中。

提取以上获得的转入重组载体pBGWFS7-pro890的转基因拟南芥的基因组DNA， 以引物1和引物2进行PCR扩增，经鉴定得到大小约为798bp目的条带的植株即为转 入重组载体pBGWFS7-pro890的阳性植株（图2）。

引物1：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’；

引物2：5’-TTATCTAGATCCGGTGGAT-3’。

将以上鉴定阳性的转入重组载体pBGWFS7-pro890的拟南芥植株的花器官进行 GUS染色分析。具体如下：

（1）将待检测的拟南芥花及阴性对照材料（哥伦比亚生态型拟南芥）均加入GUS 染色液【配方为：200mM PBS(PH7.0)；100mM亚铁氰化钾；100mM铁氰化钾；0.5mM EDTA(PH8.0)；X-Gluc(10mg/ml)；吐温20】中，37℃保温数小时或过夜。

（2）样品（花）用70％乙醇脱色2-3次，至阴性对照材料呈白色。

（3）显微镜观察，白色背景下的蓝色即为GUS表达位点。

结果见图3，从图中可以看到，ERF启动子（序列3）可以正常发挥功能，这说 明由ERF启动子启动表达的拟南芥内源ERF基因在拟南芥雄蕊和心皮中特异性的高 表达。

3、amiRNA载体的构建

（1）引物设计

根据RS300载体（载体图谱如图4所示）中所含的前体mir319a序列（序列表中 序列5），按照pENTR/D载体的要求，正向引物5’端的序列为CACCACAAA，设计如 下引物890-A和890-B。另外，根据序列表中序列2所示的ERF基因，用weigelworld 软件预测得到的4条寡核苷酸链：890ⅠmiR-s、890ⅡmiR-a、890ⅢmiR-*s和890Ⅳ miR-*a，来设计Artifical RNAi890。

890-A：5’-CACCACAAACTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC-3’（该序列的第 15-34位为序列4的第1-20位）；

890-B：5’-GCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAG-3’（该序列为序列4的第 780-807位的反向互补序列）。

用于表达Artificial RNAi ERF“TATATGAGGCTCCTAAGACTT”的引物：

890I miR-s：5’-gaTATATGAGGCTCCTAAGACTTtctctcttttgtattcc-3’（大写字母部 分为序列4的第397-417位）；

890II miR-a：5’-gaAAGTCTTAGGAGCCTCATATAtcaaagagaatcaatga-3’（第3-40 位为序列4的第380-417位的反向互补序列）；

890III miR-*s：5’-gaAAATCTTAGGAGCGTCATATTtcacaggtcgtgatatg-3’（序列4 的第244-283位）；

890IV miR-*a：5’-gaAATATGACGCTCCTAAGATTTtctacatatatattcct-3’（序列4的 第229-268位的反向互补序列）。

其中，Artificial RNAi ERF“TATATGAGGCTCCTAAGACTT”通过与序列2所 示的ERF基因的第268-288位相互作用，从而实现对ERF基因的沉默。

（2）PCR扩增

PCR扩增示意图如图5所示。

以RS300载体为模板，分别用引物对890-A/890IV miR-*a、890III miR-*s/890II miR-a、890I miR-s/890-B进行三次单独PCR，扩增得到3个DNA片段。引物对 890-A/890IV miR-*a扩增得到上游DNA序列；引物对890III miR-*s/890II miR-a扩 增得到茎环结构区域的DNA序列；引物对890I miR-s/890-B扩增得到下游DNA片段。

再以3次PCR产物的混合物（3个DNA片段，摩尔比为1：1：1）为模板，用引 物对890-A/890-B进行PCR扩增。对PCR终产物进行序列测定，结果表明PCR终产 物的序列如序列表中序列4所示，将其记为Artificial RNAi890序列。

（3）载体构建

将步骤（2）得到的PCR产物Artificial RNAi890（当然也可以采用人工合成的序 列表中序列4所示的DNA片段），与pENTR/D载体进行连接，得到重组中间载体 pENTR/D-Artificial RNAi890。再将重组中间载体pENTR/D-Artificial RNAi890转入大 肠杆菌DH5a中，在LB/kanal液体培养基中进行扩大培养，用天根公司的质粒小提试 剂盒得到质粒pENTR/D-Artificial RNAi890。再将质粒pENTR/D-Artificial RNAi890 与载体pH7WG2D，在Invitrogen公司的LR clonase II plus enzyme中置换连接，得到 pH7WG2D-artificial RNAi890。具体如下：

A）重组中间载体pENTR/D-Artificial RNAi890的构建（BP反应）

BP反应体系：

Artificial RNAi890序列（>10ng）        1-7μl

pENTR/D载体（150ng/μl）                 1μl

5×BP Clonase enzyme mix                 2μl

TE Buffer,pH8.0                   补足至10μl

25℃温浴1-16h。反应结束后，取1-5μl BP反应液转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性 克隆，获得转入目的片段（Artificial RNAi890序列）的重组中间载体，将其命名为 pENTR/D-Artificial RNAi890。经测序pENTR/D-Artificial RNAi890重组质粒结构表述 为：在pENTR/D载体的attP1和attP2之间插入序列表中序列4所示DNA片段的重组 质粒。

B）重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的构建（LR反应）

pENTR/D-Artificial RNAi890（50-150ng）          1-7μl

目的载体pH7WG2D（150ng/μl）                      1μl

5×LR clonase II plus enzyme                      2μl

TE Buffer,pH8.0                            补足至10μl

25℃温浴1-16h。终止反应后，取1-5μl LR反应液转化大肠杆菌DH5α。挑取阳性 克隆，获得转入目的片段（artificial RNAi890）的重组质粒。将得到的重组质粒进行 PCR鉴定，所采用的引物为890-A和890-B。结果如图6所示。进而将经PCR鉴定得 到大小约为807bp目的条带的质粒送样测序。将经测序表明在pH7WG2D载体的attR1 和attR2之间插入了序列表中序列4所示DNA片段的重组质粒命名为 pH7WG2D-artificial RNAi890。在重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890中，启动 Artificial RNAi890序列（序列4）转录的启动子为35S启动子。

二、转基因拟南芥的获得及鉴定

1、转基因拟南芥的获得

（1）amiRNA载体转化农杆菌

A.抽提纯化质粒

将含有步骤一构建的amiRNA载体（pH7WG2D-artificial RNAi890载体）或 pH7WG2D空载体的大肠杆菌DH5α菌种接种于5ml LB（含壮观霉素50mg/L）液体 培养基中，37℃，200rpm震荡培养过夜。按V-GENE公司的质粒提取试剂盒提取重组 质粒。

B.取电击杯用无水乙醇浸泡，晾干。

C.农杆菌EHA105电击预备处理

I.农杆菌EHA105接种于5ml YEP（含链霉素Sm50mg/L）液体培养基中，28℃， 200rpm震荡培养过夜至OD600值为0.4。

II.1.5ml离心管中收集1ml菌液，4℃，8000rpm，离心30s。

III.去残液，沉淀用200μl ddH₂O充分悬浮，4℃，8000rpm，离心30s。

IV.重复步骤III三次。

V.去残液，沉淀用ddH₂O充分悬浮，即为电击用农杆菌EHA105感受态。加入 200μl灭菌甘油混匀后置于-80℃备用。

D.电击

I.取质粒（步骤一构建的pH7WG2D-artificial RNAi890载体，或pH7WG2D空载 体）至200μl EHA105感受态中，轻打混匀，然后转移至电击杯中，置冰上。

II.准备好电击装置（BioRad），电压为2.5V，用手按住电击按钮，直到啪的一声 电击完毕。

III.室温静置2min后加入YEP液体培养液，28℃静置1h，然后28℃，200rpm培 养2h。

IV.8000rpm离心30s，收集菌液，沉淀用ddH₂O悬浮，用玻璃棒涂布含壮观霉素 50mg/L和含链霉素Sm50mg/L的YEB固体培养基平板，28℃培养48h。刮取菌苔重 新悬浮于YEB液体培养基，在28℃培养至对数生长晚期；再从中取0.5ml转接至100ml 同样的YEB液体培养基中2-3h后至OD600为0.5左右，将培养好的重组农杆菌4000g 离心10分钟，沉淀用100ml的LB液体培养基悬浮成重组农杆菌悬浮液。

E.重组农杆菌的鉴定

对转化后的重组农杆菌用引物890A和890B进行PCR鉴定，鉴定结果见图7。将 经鉴定表明含有Artificial RNAi890序列（序列4，PCR目的条带大小为807bp）的农 杆菌EHA105命名为EHA105/Artificial RNAi890；另外，将转入pH7WG2D空载体的 农杆菌EHA105命名为EHA105/pH7WG2D。

（2）重组农杆菌转化拟南芥

采用农杆菌花序侵染的方法（Bechtold N等，(1993)In planta  Agrobacterium-mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R.Acad.Sci.316:1194–1199）将上述所得的重组农杆菌EHA105/Artificial RNAi890 或EHA105/pH7WG2D转化哥伦比亚生态型拟南芥。

转化后进行Hyg抗性筛选，收集具有Hyg抗性的转基因拟南芥的种子（T₁代）， 并在含有Hyg抗生素的平板上培养。再次通过Hyg抗性筛选，获得具有Hyg抗性的 转基因苗，即转入pH7WG2D-artificial RNAi890载体的拟南芥植株和转入pH7WG2D 空载体的拟南芥植株。

2、转基因拟南芥的鉴定

（1）PCR鉴定

从步骤1获得的T₁代转入pH7WG2D-artificial RNAi890载体的拟南芥植株和转 入pH7WG2D空载体的拟南芥对照植株中分别提取基因组DNA。对于转入 pH7WG2D-artificial RNAi890载体的转基因拟南芥，以引物Hyg-F和Hyg-R进行PCR 扩增，经鉴定得到大小约为274bp目的条带的植株即为转入pH7WG2D-artificial RNAi 890载体的阳性植株。对于转入pH7WG2D空载体的对照植株，以引物Hyg-F和Hyg-R 进行PCR扩增，经鉴定表明含有Hyp基因的（PCR产物大小约为274bp）植株即为转 入pH7WG2D空载体的阳性植株。部分转基因植株的鉴定结果如图8所示。

Hyg-F：5’-CCCGAACATCGCCTCGCTCC-3’；

Hyg-R：5’-CGGGTTCGGCCCATTCGGAC-3’。

实施例2、转基因拟南芥功能鉴定

以32株实施例1鉴定阳性的T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的 拟南芥转基因植株、未转基因的哥伦比亚生态型拟南芥，以及实施例1得到的转入 pH7WG2D空载体的对照植株为实验材料。将各实验材料的种子播种在MS培养基后 转移至土壤中培养（每种实验材料播种80-100粒）。对各实验材料进行如下几方面的 分析鉴定：

1、植株表型分析

结果显示，与未转基因的哥伦比亚生态型拟南芥相比，32株实施例1鉴定阳性的 T₁代转入pH7WG2D-artificial RNAi890载体的转基因拟南芥植株雄蕊发育异常以至于 导致种子发育异常。部分材料的植株表型特别是花器官表型如图9所示，从图中可以 看出，实施例1鉴定阳性的T₁代转入pH7WG2D-artificial RNAi890载体的转基因拟 南芥植株表现出花丝变短，花药不育性状。而对于实施例1得到的转入pH7WG2D空 载体的对照植株，其花器官表型与未转基因的哥伦比亚生态型拟南芥基本一致，无统 计学差异。以上结果说明在拟南芥中下调ERF基因的表达，会导致花药发育受到抑制。

2、花粉育性检测

利用亚历山大染料对各实验材料的花粉育性进行检测，具体如下：摘取拟南芥成 熟花浸泡在亚历山大染色液中2-4小时，然后在体视镜下观察。其中，亚历山大染色 液配制方法如下：取10ml A液、5ml B液、5g苯酚、5ml C液、0.5ml D液、2mL冰 醋酸、25mL甘油、50mL H₂O混合，使用时用水按照1:50稀释。

A液：浓度为95%的乙醇水溶液；

B液：向A液中加入孔雀绿，至其终浓度为1%（1g/100mL），得到B液；

C液：浓度为1%（1g/100mL）的酸性品红水溶液；

D液：浓度为1%（1g/100mL）的橙黄G染料水溶液。

结果显示，与未转基因的哥伦比亚生态型拟南芥相比，32株实施例1鉴定阳性的 T₁代转入重组载体pH7WG2D-artificial RNAi890的转基因拟南芥植株的花粉明显出现 了败育的现象。见图10。而对于实施例1得到的转入pH7WG2D空载体的对照植株， 其花粉育性与未转基因的哥伦比亚生态型拟南芥基本一致，无统计学差异。以上结果 表明，在拟南芥中特异的下调ERF基因的表达会减低植株花粉育性。