红没药烷型倍半萜类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途

摘要

本发明属制药领域，涉及红没药烷型倍半萜类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途。本发明从菊科橐吾属植物准噶尔橐吾(Lifularia songarica Ling.)的石油醚和乙酸乙酯萃取部位提取红没药烷型倍半萜化合物并通过体外抗肿瘤活性试验证实其有显著抗肿瘤活性。本发明化合物可进一步作为活性成分，制备治疗肿瘤疾病的药物。

说明书

技术领域

本发明属制药领域，涉及红没药烷型倍半萜类化合物及其在制备抗肿瘤药 物中的用途。

背景技术

多年来抗肿瘤药物一直是世界药学研究的热点和重点。抗肿瘤化学药物因毒 副作用大，而使其临床应用受到很大限制，因此近年来从天然来源原料中寻找新 的具有抗肿瘤活性的药物受到人们越来越多的关注。据报道，国内外的学者从包 括海洋生物在内的天然产物中分离得到大量的具有生物活性的单体化合物，为抗 肿瘤药物的研究与开发提供了广阔的前景。菊科(Compositae)橐吾属(Ligularia) 植物主要分布在我国西北、西南各地，其中约30种的根、茎、叶、花是我国民 间药物，主要有止咳化痰、活血化瘀、清热解毒、催吐、利尿、利胆退黄等功效。 许多种类的根及根茎作为中药“紫菀”的代用品，有很长的药用历史。本属植物 所含化学成分主要是多种类型的倍半萜和吡咯里西啶类生物碱。

准噶尔橐吾(Ligularia songarica Ling.)主要分布在我国新疆地区，药用其根 及根茎，具有清热解毒、润肺止咳的功效。本发明首次从准噶尔橐吾中分离到新 的红没药烷型倍半萜类化合物，并发现该类的化合物具有较好的抗肿瘤活性。

发明内容

本发明的目的是提供新的抗肿瘤活性物质，具体涉及新的红没药烷型倍半萜 类化合物及其在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明中，所述的新的红没药烷型倍半萜类化合物优选化合物准噶尔橐吾丙 素～准噶尔橐吾戊素。

本发明中，所述的新的红没药烷型倍半萜类化合物特别涉及准噶尔橐吾丙素 (songaricalarin C)、准噶尔橐吾丁素(songaricalarin D)、准噶尔橐吾戊素 (songaricalarin E)、天山橐吾素A(narynensislarin A)和天山橐吾素B (narynensislarin B)在制备抗肿瘤药物中的用途。

本发明应用现代药理筛选方法，对植物药中抗肿瘤活性物质进行研究，从菊 科橐吾属植物准噶尔橐吾中石油醚和乙酸乙酯萃取部位提取红没药烷型倍半萜， 并经试验证实所述的化合物具有抗肿瘤活性。

本发明的红没药烷型倍半萜类化合物具有式I的化学结构：

其中，当时，化合物为(3S，3aR，4R，5S，6R，7S，7aS)- 1-Methylolefinic-3，6-bis[(2-methylbutanoyl)oxy]-4-chloromethyl-4-hydroxy-7-[(2S)- 2-methyloxiran-2-yl]-2-oxo-1H-inden-5-yl(2E)-3-methylpent-2-enoate(准噶尔橐吾 丙素，songaricalarin C，1)。

当R₄＝H，R₆＝＝时，化合物为(3S，3aR，5S，7S，7aS)-1-Methylolefinic-3- [(2-methylbutanoyl)oxy]-4-methylidene-7-propylene-2-oxo-1H-inden-5-yl(2E)-1-met hylethenly-2-enoate(准噶尔橐吾丁素，songaricalarin D，2)。

当R₁＝H，R₆＝＝时，化合物为(1A，3aR，5S，6R，7S，7aR)-1-(1-Acetoxyethyl) octahydro-6-[(2-methylbutanoyl)oxy]-4-methylidene-7-[(2S)-2-methyloxiran-2-yl]-2- oxo-1H-inden-5-yl(2E)-3-methylpent-2-enoate(准噶尔橐吾戊素，songaricalarin E， 3)。

当R₄＝H，R₆＝＝时，化合物为[7β-[3-ethylcrotonoyloxy]-1α-[2- methylbutyryloxy]-3，14-dehydro-Z-notonipetranone(天山橐吾素A，narynensislarin  A，4)。

当R₁＝H，R₆＝＝时，化合物为(1S，3aR，5S，6R，7S，7aR)-1-(1- acetoxyethyl)octahydro-6-[(2-methylbutanoyl)oxy]-4-methyllidene-7-[(2S)-methyloxi  ran-2-yl]-2-oxo-1H-inden-5-yl(2E)-4-Acetoxy-3-methylpent-2-enoate(天山橐吾素 B，narynensislarin B，5)。

本发明所述的红没药烷型倍半萜化合物通过下述方法制备：

取准噶尔橐吾根和根茎粗粉7.3kg，用乙醇室温冷浸(20L×3次)，合并提取 液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，分别以石油醚(2L×3)、乙酸乙酯(2L×3) 萃取，得到萃取物360g和40g。由于两部分经薄层色谱对比，发现它们显色点 的状态和位置基本相同，故将两部分合并。取提取物380g进行硅胶柱色谱，以 石油醚、石油醚-丙酮、丙酮梯度洗脱，所得流分以不同洗脱剂进行反复硅胶柱 色谱，分离得到化合物1～5。

其中，准噶尔橐吾丙素(1)：无色胶状物；分子 式C₃₁H₄₅O₉Cl，分子量596；红外光谱υ_max(CH₂Cl₂)：3443，2970，1731，1644，1461， 1133，737cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：2.05(1H，dd，J＝11.3，4.7，H-1)， 5.28(1H，d，J＝4.7，H-2)，6.50(1H，dq，J＝7.4，2.7，H-4)，3.01(1H，d，J＝11.3，H-6)， 2.14(1H，d，J＝11.3，H-7)，5.45(1H，dd，J＝11.3，3.1，H-8)，5.39(1H，d，J＝3.1， H-9)，2.59，2.81，(2H，d，J＝4.4，H-12)，1.48(1H，s，H-13)，3.55，3.92，(2H，d，J＝ 11.3，H-14)，2.22(1H，d，J＝7.4，H-15)，Mesen：5.62(1H，br s，H-2′)，2.20(1H，q，J＝ 7.0，H-4′)，1.08(3H，t，J＝7.0，H-5′)2.15(3H，br s，H-6′)，Mebu(C-2)：2.36(1H，m， H-2′)，1.70(2H，m，H-3′)，0.89(3H，t，J＝7.4，H-4′)，1.12(3H，d，J＝7.0，H-5′)，Mebu (C-8)：2.33(1H，m，H-2′)，1.46(2H，m，H-3′)，0.88(3H，t，J＝7.4，H-4′)，1.15(3H，d， J＝7.0，H-5′)；和¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：45.4(d，C-1)，71.6(d，C-2)， 199.1(s，C-3)，139.7(d，C-4)，136.9(s，C-5)，38.7(d，C-6)，44.8(d，C-7)，71.9(d， C-8)，69.1(d，C-9)，73.0(s，C-10)，56.2(s，C-11)，51.8(t，C-12)，23.0(q，C-13)，48.5 (t，C-14)，15.3(q，C-15)，Mesen：164.3(s，C-1′)，113.0(d，C-2′)，164.7(s，C-3′)，33.0 (t，C-4′)，11.8(q，C-5′)，19.0(q，C-6′)，Mebu(C-2)：175.3(s，C-1′)，41.0(d，C-2′)，26.3 (t，C-3′)，11.6(q，C-4′)，16.1(q，C-5′)，Mebu：175.7(s，C-1′)，40.8(d，C-2′)，26.5(t， C-3′)，11.4(q，C-4′)，16.2(q，C-5′)；EIMS m/z 596[M]⁺(0.7)，278[M-MesenOH-2 ×MebuOH]⁺(1.5)，231(1.0)，229(2.4)，203(0.8)，201(2.2)；TESLA FTMS：m/z 619.2651[M+Na]⁺(计算值C₃₁H₄₅O₉ClNa，619.2644)

其中，准噶尔橐吾丁素(2)：无色胶状物；分子 式C₂₆H₃₆O₅，分子量428；红外光谱υ_max(CH₂Cl₂)：2968，1743，1644，1459， 1377，1218，1140，997cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：2.62(1H，dd，J＝ 10.5，4.3，H-1)，5.53(1H，d，J＝4.3，H-2)，6.43(1H，dq，J＝7.4，2.3，H-4)，2.78(1H， dd，J＝10.5，10.2，H-6)，2.65(1H，m，H-7)，1.78，1.98(each 1H，m，H-8)，5.50(1H， dd，J＝2.7，3.1，H-9)，4.86，4.92(each 1H，brs，H-12)，1.76(3H，s，H-13)，4.83，5.30 (each 1H，br s，H-14)，2.12(3H，d，J＝7.4，H-15)，Mebu：2.40(1H，m，H-2′)，1.45， 1.66(each 1H，m，H-3′)，0.88(3H，t，J＝7.4，H-4′)，1.13(3H，d，J＝7.0，H-5′)，Mesen： 5.64(1H，br s，H-2′)，2.17(2H，q，J＝7.4，H-4′)，1.07(3H，t，J＝7.4，H-5′)，2.15(3H， br s，H-6′)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：45.2(d，C-1)，72.2(d，C-2)，199.8 (s，C-3)，138.5(d，C-4)，137.7(s，C-5)，44.6(d，C-6)，44.2(d，C-7)，38.4(t，C-8)，75.5 (d，C-9)，140.2(s，C-10)，146.7(s，C-11)，112.8(t，C-12)，19.1(q，C-13)，113.5(t， C-14)，14.9(q，C-15)，Mebu：175.4(s，C-1′)，40.9(d，C-2′)，26.7(t，C-3′)，11.4(q， C-4′)，16.4(q，C-5′)；TESLA FTMS：m/z 451.24557[M+Na]⁺(计算值C₂₆H₃₆O₅， 451.24550)。

其中，准噶尔橐吾戊素(3)：无色胶状物；分子 式C₂₈H₄₀O₈，分子量504；红外光谱υ_max(CH₂Cl₂)：3466，2970，1724，1647，1460， 1374，1244，1141，1037cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：2.63(1H，ddd，J ＝11.4，10.2，6.6，H-1)，2.15，2.44(2H，dd，J＝15.2，11.4，6.6，H-2)，5.12(1H，dq，J＝ 6.6，3.6，H-4)，2.63(1H，dd，J＝11.4，3.6，H-5)，1.53(1H，ddd，J＝11.4，11.4，11.4， H-6)，2.00(1H，dd，J＝11.4，10.2，H-7)，5.15(1H，dd，J＝10.2，3.6，H-8)，5.78(1H，d， J＝3.6，H-9)，2.68，2.80(each 1H，d，J＝3.9，H-12)，1.22(3H，s，H-13)，4.90，5.28 (each 1H，br s，H-14)，1.23(3H，d，J＝6.6，H-15)，Ac：2.10(3H，s)，Mesen：5.63(1H， br s，H-2′)，2.15(2H，q，J＝7.0，H-4′)，1.06(3H，t，J＝7.0，H-5′)，2.11(3H，br s，H-6′)， Mebu：2.40(1H，m，H-2′)，1.47，1.75(each 1H，m，H-3′)，0.89(3H，t，J＝7.8，H-4′)， 1.15(3H，d，J＝6.6，H-5′)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：40.8(d，C-1)，41.7 (t，C-2)，212.6(s，C-3)，68.5(d，C-4)56.4(d，C-5)45.7(d，C-6)48.5(d，C-7)72.7(d， C-8)72.1(d，C-9)142.2(s，C-10)54.9(s，C-11)52.8(t，C-12)15.2(q，C-13)113.0(t， C-14)15.1(q，C-15)；TESLA FTMS：m/z 527.26241[M+Na]⁺(计算值C₂₈H₄₀O₈Na， 527.26154)

其中，天山橐吾素A(4)：无色油状物；分子式C₂₀H₂₈O₄，分子量434；红外光谱υ_max(CH₂Cl₂)：1750，1720，1660cm^-1；EIMS m/z： 434(0.2)，328(2)，316(2)，214(20)，171(20)，97(100)；¹H NMR(CDCl₃，400MHz) δppm：5.51(1H，brs，H-1)，2.66(1H，m，H-4)，2.02(1H，m，H-5)，1.51～1.99(2H，m， Hz，H-6)，2.37～2.85(2H，m，H-6)，5.51(1H，brs，H-7)，2.66(2H，m，H-9)，4.79，5.15 (2H，br s，H-10)，2.30(1H，ddq，J＝3.6，1.2，4.0Hz，H-11)，0.97(3H，d，J＝7.0Hz， H-12)，0.88(3H，d，J＝6.6Hz，H-13)，6.38(1H，q，J＝7.4Hz，H-14)，2.12(3H，d，J＝ 7.4Hz，H-15)，Mesen(C-7)5.66(1H，brs，H-2′)，2.12(2H，q，J＝7.0Hz，H-4′)，1.06 (3H，d，J＝7.0Hz，H-5′)，2.12(3H，s，H-6′)，Mebu(C-1)2.38(1H，dd，J＝7.6，7.0Hz， H-2′)，1.46～1.45(2H，m，H-3′)，0.86(3H，d，J＝7.4Hz，H-4′)，1.15(3H，d，J＝6.6， H-5′)；¹³C NMR(CDCl₃，100MHz)δppm：73.2(d，C-1)，200.1(s，C-2)，139.1(s， C-3)，44.6(d，C-4)，40.0(d，C-5)，29.7(t，C-6)，72.3(d，C-7)，140.7(s，C-8)，45.7(d， C-9)，112.5(t，C-10)，27.4(d，C-11)，21.2(q，C-12)，15.5(q，C-13)，136.7(t，C-14)， 15.0(q，C-15)，Mesen(C-7)165.8(s，C-1′)，114.4(d，C-2′)，162.1(s，C-3′)，33.7(t， C-4′)，11.8(q，C-5′)，18.8(q，C-6′)，Mebu(C-1)175.4(s，C-1′)，40.8(d，C-2′)，26.7(t， C-3′)，11.4(q，C-4′)，16.4(q，C-5′)。

其中，天山橐吾素B(5)：无色胶状物；分子式C₃₀H₄₂O₁₀，分子量562，红外光谱υ_max(CH₂Cl₂)：2923，1734，1655，1372，1242，1152， 1075，1039，756cm^-1；¹H NMR(CDCl₃，400MHz)δppm：2.67(1H，ddd，J＝14.0， 11.0，6.8Hz，H-1)，2.15，2.43(2H，dd，J＝16.5，6.8Hz，H-2)，5.12(1H，dq，J＝3.6， 6.8Hz，H-4)，2.65(1H，dd，J＝11.0，3.6Hz，H-5)，1.52(1H，ddd，J＝11.0，11.0，6.8 Hz，H-6)，1.98(1H，dd，J＝11.0，10.4Hz，H-7)，5.15(1H，dd，J＝10.4，3.1Hz，H-9)， 2.70，2.81(2H，d，J＝4.2Hz，H-12)，1.20(3H，s，H-13)，4.91，5.29(2H，br s，H-14)， 1.21(3H，d，J＝6.6Hz，H-15)，MesenOAc(C-9)5.83(1H，brs，H-2′)，5.24(1H，q，J＝ 7.0Hz，H-4′)，1.31(3H，d，J＝7.0Hz，H-5′)，2.10(3H，br s，H-6′)，2.09(3H，s，H-8′)， Mebu(C-8)2.40(1H，m，H-2′)，1.45～1.75(2H，m，H-3′)，0.87(3H，t，J＝7.4Hz， H-4′)，1.13(3H，d，J＝7.0Hz，H-5′)，Ac(C-4)2.14(1H，s)；¹³C NMR(CDCl₃，100 MHz)δppm：40.8(d，C-1)，41.6(t，C-2)，212.4(s，C-3)，68.4(d，C-4)，56.3(d，C-5)， 45.6(d，C-6)，48.9(d，C-7)，72.6(d，C-8)，72.5(d，C-9)，141.8(s，C-10)，54.9(s， C-11)，52.8(t，C-12)，15.1(q，C-13)，113.3(t，C-14)，15.0(q，C-15)，MesenOAc(C-9) 164.8(s，C-1′)，114.8(d，C-2′)，158.1(s，C-3′)，73.5(d，C-4′)，169.8(s，C-5′)，21.1(q， C-6′)，19.0(q，C-7′)，15.1(q，C-8′)，Mebu(C-8)176.0(s，C-1′)，41.0(d，C-2′)，26.2(t， C-3′)，11.4(q，C-4′)，16.1(q，C-5′)，Ac(C-4)170.6(s，C-1′)，21.2(q，C-2′)。

上述红没药烷型倍半萜化合物经体外抗肿瘤活性筛选试验，结果证实，获得 的5种化合物对人肺癌(A549)、乳腺癌(MCF-7)、口腔表皮样癌(KB)和口腔表皮 样癌耐药株(KBVIN)四种肿瘤细胞株具有显著细胞毒活性(如表1所示)。其中， 准噶尔橐吾丁素活性最显著，对A549，MCF-7，KB和KBVIN四种肿瘤细胞株 的EC₅₀值分别为4.97，0.82，3.42和3.23μg/ml，比较显示，准噶尔橐吾丙素、准 噶尔橐吾戊素、天山橐吾素A和天山橐吾素B的活性稍弱于准噶尔橐吾丁素。

本发明所述的红没药烷型倍半萜化合物，可作为活性成分，进一步制成治疗 肿瘤疾病的药物。

附图说明

图1是准噶尔橐吾石油醚和乙酸乙酯萃取部位中准噶尔橐吾丙素～准噶尔 橐吾戊素以及天山橐吾素A和天山橐吾素B的提取分离流程图。

具体实施方式

实施例1制备红没药烷型倍半萜类化合物的

取准噶尔橐吾根和根茎粗粉7.3kg，用乙醇室温冷浸(20L×3次)，合并提取 液浓缩至无醇味，提取液加水稀释至2L，分别以石油醚(2L×3)、乙酸乙酯(2L×3) 萃取，得到萃取物360g，40g。由于两部分经薄层色谱对比，发现它们显色点 的状态和位置基本相同，故将两部分和并为石油醚和乙酸乙酯的总提取物。取总 提取物380g干法上样进行硅胶柱色谱，以石油醚、石油醚-丙酮、丙酮梯度洗脱， 进一步具体操作如下：

1、石油醚-丙酮(5∶1)洗脱所得流份，石油醚-乙酸乙酯(7∶1)进行反复硅胶柱 色谱，分成两个部分。第一部分用石油醚-乙酸乙酯(7∶1)再反复洗脱得到无色胶 状物天山橐吾素A(4)(46mg)。第二部分用石油醚-乙酸乙酯(6∶1)再反复洗脱，后 用Sephadex LH-20(80％甲醇)反复洗脱得到无色胶状物天山橐吾素B(5)(76 mg)。

2、石油醚-丙酮(4∶1)洗脱所得流份，石油醚-乙酸乙酯(6∶1)进行反复硅胶柱 色谱，分成两个部分。第一部分用石油醚-乙酸乙酯(6∶1)再反复洗脱得到无色胶 状物准噶尔橐吾戊素(3)(77mg)。第二部分用石油醚-丙酮(20∶1)薄层色谱板制备 得到无色胶状物准噶尔橐吾丁素(2)(11mg)。

3、石油醚-丙酮(2∶1)和(1∶1)洗脱所得流份，石油醚-乙酸乙酯(3∶1)进行反复 硅胶柱色谱，得到无色胶状物准噶尔橐吾丙素(1)(12mg)。

实施例2体外抗肿瘤试验(SRB法)

A549，MCF-7，KB和KBVIN四种肿瘤细胞株在含25mM HEPES、0.2％(w/v) 碳酸氢钠和100μg/ml卡那霉素的10％小牛血清RPMI1640培养液4ml的T-25 烧瓶中，37℃，5％CO₂的条件下培养。经胰蛋白酶消化后的细胞悬浮液加入96 孔板中，细胞浓度为0.25-1×104/孔。肿瘤细胞加入不同浓度的待测组分在37℃ 培养72小时后，用冰冷的50％三氯乙酸固定并用0.4％的(SRB)染色，待染料溶 解后，562nm下测定吸收值。EC₅₀细胞半数生长抑制时的药物浓度按照量效数 据进行换算。每个实验重复三次，吸收值差异小于5％，EC₅₀差异小于30％。

上述红没药烷型倍半萜类化合物经体外抗肿瘤活性筛选试验结果证实，所述 化合物1～5对A549(人肺癌)，MCF-7(乳腺癌)，KB(口腔表皮样癌)和KBVIN (口腔表皮样癌耐药株)四种细胞株均具显示出抑制作用(如表1所示)。其中， 准噶尔橐吾丁素活性最强，对上述四种肿瘤细胞株的EC₅₀值分别为4.97，0.82， 3.42和3.23μg/ml。准噶尔橐吾丙素、准噶尔橐吾戊素、天山橐吾素A和天山橐 吾素B的对MCF-7的抑制活性稍弱于准噶尔橐吾丁素。

本发明所述的准噶尔橐吾丙素～准噶尔橐吾戊素以及天山橐吾素A和天山 橐吾素B，可作为活性成分，进一步制成治疗肿瘤疾病的药物。

表1是红没药烷型倍半萜类化合物对肿瘤细胞的抑制作用(EC₅₀，μg/ml)。

表1