一种大菱鲆精子高效超低温冷冻保存的方法

摘要

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种大菱鲆精子高效超低温冷冻保存的方法。将大菱鲆的精液与抗冻液按体积比3:1-4:1的比例混合，混合后经过两步降温处理，一步平衡后投入到液氮（-196℃），分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成。本发明的大菱鲆精子高效冷冻保存方法获得的高质量的冻精对于大菱鲆人工繁育、种质保存、遗传多样性及可持续养殖等方面有着重要意义。

说明书

技术领域

本发明属海洋生物技术领域，具体地说是一种大菱鲆精子高效超低温冷冻保存的 方法。

背景技术

大菱鲆(Scophthalmus maximus)隶属于鲆科、菱鲆属,英文名Turbot,又称 “多宝鱼”,是一种欧洲沿海特有的比目鱼,属冷温性鱼类,主要分布于大西洋 东北部沿岸,黑海、波罗的海和地中海也有分布。由于其生长速度快、肉质鲜美、 病害较少且便于密养,是工厂化养殖的理想品种。我国于1992年首次从英国引进 大菱鲆苗种,通过驯化、试养和人工繁殖,1999年突破生产性育苗技术,大菱鲆 养殖业在我国得到蓬勃发展,目前已建立起一整套亲鱼调控、人工苗种培育及工 厂化养殖生产技术。大菱鲆目前已经成为我国北方最重要的海水鱼类养殖品种之 一，具有极高商业价值。由于大菱鲆雄鱼产精时间短，产精量少等特点，严重制 约了其优质受精卵的获得和苗种的产量。冷冻大菱鲆精子可以通过人工性腺发育 调控一批成熟雄性大菱鲆亲鱼，集中批量保存优质大菱鲆精液，在需要时解冻进 行人工授精获得受精卵，从而克服了大菱鲆在繁育期优质精液供不应求的困难。 近年来，由于养殖规模的不断扩大，加之对大菱鲆种质需求的不断扩大，大菱鲆 的精子冷冻技术急需建立起来。建立大菱鲆精子大容量超低温保存的可靠方法对 促进海水养殖业的发展以及种质资源的保护都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大菱鲆精子高效超低温冷冻保存的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种大菱鲆精子高效超低温冷冻保存的方法，将大菱鲆的精液与抗冻液按体 积比3:1-4:1的比例混合，混合后经过两步降温处理，一步平衡后投入到液氮 （-196℃），分装保存；抗冻液由稀释液、抗冻剂、添加剂三部分组成.

其中，稀释液为NaCl8g/L，KCl0.4g/L，MgSO₄·7H₂O0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.1g/L，Na₂HPO₄·2H₂O0.06g/L，KH₂PO₄0.06g/L，NaHCO₃0.35g/L；抗冻剂为终 浓度60%（V/V）的DMSO（二甲基亚砜）或终浓度60%（V/V），的丙二醇（PG）； 添加剂：蔗糖34.2g/L和终浓度10%的蛋黄（V/V）。

进一步的说，抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，秤取NaCl8g， KCl0.4g，MgSO₄·7H₂O0.1g，MgCl₂·6H₂O0.1g，Na₂HPO₄·2H₂O0.06g，KH₂PO₄0.06g，NaHCO₃0.35g，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配 置抗冻液，其中含60%DMSO（V:V）（即100mL抗冻液含60mLDMSO）或60%PG（V:V） （即100mL抗冻液含60ml PG)；然后将已配置好的抗冻液作为基础液，加入蔗糖 3.42g，蛋黄10ml,定容至100mL。

所述抗冻液在使用前放置于0℃冰箱中预冷过夜，待用。所述经抗冻液混合 稀释的大菱鲆的精液置于2ml或5ml的冻存管中。

所述大菱鲆的精液与抗冻液在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀30s-1min， 然后以-8℃/min降温至-80℃，然后以-10℃/min降温至-120℃，平衡2分钟后投 入到液氮（-196℃），分装保存。

将分装保存于液氮中的大菱鲆冻精进行解冻，具体方法为：将存有精液的冻 存管直接放入37-40℃水浴中解冻100-110s，然后置于室温（18-20℃）条件下完 全融化，自然海水中激活。

进一步的说，所述冻精直接放入37-40℃水浴中100-110s进行解冻，期间不 断摇动冻存管。

冻精激活具体为，载玻片滴入100μL海水，然后加入1-2μL冻精，吸打3-5 次使其充分混匀，随即取3个视野，检测运动精子的数量占视野中所有精子的比 例，经检测解冻后精子的运动率与鲜精差异不显著，80%以上做快速的直线运动。

本发明具有如下优点：

1.本发明冷冻保存过程中采用高浓度的DMSO或PG作抗冻剂，保持较好渗透 性的同时又降低了毒性；

2.本发明抗冻液中加入了蔗糖34.2g/L，10%蛋黄（V/V）作为细胞外部保 护剂，对精子的质膜起到很好的保护作用；

3.本发明冷冻保存过程中采用2-5ml冻存管，容积较大，保存精液量大；降 温前鲜精与抗冻液震荡混匀30s-1min,直接放入程序降温仪中，节省了时间，操 作简便易行；同时精子与抗冻液的比例为3:1－4:1比以往1:3－1:1的保存比例 提高了十余倍，相同体积的冻存管精子保存量大，具有重要生产意义。

4.本发明冷冻保存过程分段降温时，采用以-8－-10℃/min速度降温，适 宜的速度是精子可以充分脱水同时又可使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然 后投入液氮，整个保存过程不超过15min；冷冻保存降温程序精密，重复性稳定 性好，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于80%，与鲜精活力状态差异不显 著；

5.本发明冷冻精子从液氮中取出后，采用37℃-40℃解冻，可使精子快速度 过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤。

具体实施方式

实施例1：

1）2013年4月份正值大菱鲆亲鱼生殖期，于黄岛胶南增养殖站，亲鱼养殖 车间，将雄性亲鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸 巾擦净，轻轻从后向前挤压腹部获得十余尾雄鱼的新鲜精液约30ml，存于干净的 离心管中，避光，显微镜检测活力高于90%，置于冰盒中带回实验室进行冷冻保 存；

2）抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃ 冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：NaCl：8g/L，KCl:0.4g/L，MgSO₄·7H₂O： 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O:0.1g/L，Na₂HPO₄·2H₂O:0.06g/L，KH₂PO₄:0.06g/L，NaHCO₃: 0.35g/L；抗冻剂终浓度为60%DMSO（V/V）；添加剂：蔗糖34.2g/L，10%蛋黄（V/V）， 所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白后并搅拌均匀所得。

抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，称取NaCl8g，KCl0.4g， MgSO₄·7H₂O0.1g，MgCl₂·6H₂O0.1g，Na₂HPO₄·2H₂O0.06g，KH₂PO₄0.06g， NaHCO₃0.35g，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻 液，具体为:取一烧杯加入60ml DMSO或PG,加入蔗糖3.42g，蛋黄10ml，加入 容量瓶中定容至100mL。

3）将上述鲜精与抗冻液以体积3:1或4:1（鲜精：抗冻液）的比例混合，而 后在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀30s-1min，分装至2ml或5ml冻存管中， 同时程序降温仪开启，预冷至0℃；

4）将冻存管置于降温仪中以-8℃/min降温速率降温至-80℃，然后以-10℃ /min降温速率降温至-120℃，平衡2分钟，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫 盒中，然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮（-196℃）容器中长期贮存；

5）将上述冷冻保存2周后精液进行解冻，任意选取3个冻存管解冻，解冻前 将冻存盒先置于盛有液氮的保温盒中，然后将冻存管快速从盒中取出放入 37-40℃水浴中，轻轻摇动100-110s，然后置于室温(18-20℃)至完全融解；

6）将上述融解后精液用自然海水激活，具体为，载玻片滴入100μL海水，然后 加入1-2μL冻精，吸打3-5次使其充分混匀，随即取3个视野，检测运动精子的 数量占视野中所有精子的比例，经检测解冻后精子的运动率与鲜精差异不显著，

激活后在显微镜检测冻精活力80-90%，且80%以上的冻精均作快速的直线运 动。

7)激活后的冻精在平均直线运动速度，平均曲线运动速度和平均路径运动速 度上均与鲜精差异不显著。

实施例2

1）2012年4-5月份正值大菱鲆生殖期，与黄岛胶南增养殖站，亲鱼养殖车 间，将雄鱼从养殖池中捞出，放置于海绵上，蒸馏水冲洗生殖孔三次，纸巾擦净， 轻轻从后向前挤压腹部获得鲜精。共采集大菱鲆50余尾，共计鲜精70ml，显微 镜检测活力75-90%，置于冰盒中回实验室进行冷冻保存；

2）抗冻液配制，由稀释液、抗冻剂、添加剂和蒸馏水组成，配置后置于0℃ 冰箱预冷，待用；其中，稀释液为：NaCl：8g/L，KCl:0.4g/L，MgSO₄·7H₂O： 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O:0.1g/L，Na₂HPO₄·2H₂O:0.06g/L，KH₂PO₄:0.06g/L，NaHCO₃: 0.35g/L；抗冻剂为终浓度60%的DMSO（V/V）或终浓度60%的PG（V/V）；添加剂： 蔗糖34.2g/L，10%蛋黄（V/V），所述蛋黄由鸡蛋分离蛋白并搅拌均匀所得。

抗冻液的配置过程：首先用蒸馏水配置稀释液，称取NaCl8g，KCl0.4g， MgSO₄·7H₂O0.1g，MgCl₂·6H₂O0.1g，Na₂HPO₄·2H₂O0.06g，KH₂PO₄0.06g， NaHCO₃0.35g，然后定容至1L备用；采用已配置的稀释液作为基础液配置抗冻 液，具体为:取一烧杯加入60ml DMSO或PG,加入蔗糖3.42g，蛋黄10ml，加入 容量瓶中定容至100mL。

3）将上述鲜精与抗冻液以体积3:1-4:1（鲜精：抗冻液）的比例混合，而后 在碎冰中（0℃）轻轻震荡、充分混匀30s-1min，分装至2ml或5ml冻存管中， 同时程序降温仪开启，预冷至0℃；

4）将冻存管置于降温仪中以-8℃/min降温速率降温至-80℃，然后以-10℃ /min降温速率降温至-120℃，平衡2分钟，将所有的冻存管倒入盛有液氮的泡沫 盒中，然后逐一顺序放入冻存盒然后放入液氮容器中长期贮存（-196℃）；

5）将上述冻精长期冷冻保存，2012年12月份，由通用水产有限公司取走20 余管冻精进行人工授精，苗种培育。解冻方法：将冻存管快速从盒中取出放入 37-40℃水浴锅中，轻轻摇动100-110s，然后置于室温18-20℃完全融解；

6）将上述融解后精液用自然海水激活，激活后在显微镜检测冻精活力 80-90%，且80%以上的冻精均作快速的直线运动。

6）将冻精用于人工授精，受精率、孵化率均在80%以上，苗种成活率与鲜 精无显著差异。