放射性标记T140类多肽化合物及其制备方法和应用

摘要

本发明公开了放射性标记T140类多肽化合物及其制备方法和应用。放射性核素

说明书

技术领域

本发明涉及放射性标记化合物，其制备方法以及所述化合物作为肿瘤显像剂的应用。 

背景技术

根据目前癌症的发病趋势，2020年全世界癌症发病率将比现在增加50％，全球每年新增癌症患者人数将达到1500万人（世界卫生组织(WHO)近期发表《世界癌症报告》）。及早发现、及早治疗是减少癌症死亡率最为有效的方法。实施对肠癌、宫颈癌、乳腺癌等的普查制度，可使全世界的癌症死亡人数减少三分之一。目前在发展中国家，80％的癌症患者都是在患病晚期才被发现。 

尽管癌症发生的确切机制目前仍然不清楚，但是如果能在早期对癌症进行诊断，并尽早采取手术，放射或化学治疗(或这几种方法的结合)，大多数肿瘤患者是有存活的可能性的。因此为了在癌细胞扩散之前对病人治疗，我们需要开发能灵敏检测癌症的技术，目前用于癌症诊断的成像方法主要有：X-射线CT，超声(CS)，核磁共振成像(MRI)以及核医学SPECT/PET。US和MRI技术可以用于实体肿瘤的解剖分析，但这些技术的缺点是：它们不能在分子水平上检测肿瘤组织的生化变化，因为MRI和CT技术需要肿瘤组织中含有很多对比药剂以并正常组织形成很强的对比，这些技术的另一个缺点是它们对于高发性肿瘤(例如乳腺癌，胆囊癌，肺癌和前列腺癌)的特异性以及灵敏性较差，因此我们亟需开发一种新的肿瘤特异性的放射性示踪物，它不但能够用于肿瘤的早期诊断，而且能够监测肿瘤的生长以及肿瘤对于药物治疗的反应。 

趋化因子家族是一类与糖蛋白结构相近的小分子分泌性蛋白质，主要作用是趋化细胞的迁移，其中基质细胞衍生因子SDF-1α被认为在血管再生过程中起着重要作用。SDF-1α与其受体CXCR4结合，刺激受体形成二聚体，激活下游信号转导分子，包括联络粘附激酶、细胞外信号调节激酶、蛋白激酶C、JAK/Stat和NF-KB转录通路。 

现有研究表明趋化因子受体CXCR4在很多种人类肿瘤细胞的表面有过度表达，比如CXCR4受体在原位淋巴瘤、神经胶质瘤、卵巢癌以及胰腺癌中有表达，在转移的乳腺癌、肺癌、甲状腺癌、成神经细胞瘤、血癌和炎症性疾病中也有发现。在正常组织如脾、胰腺和骨髓中也有表达。而且研究表明，CXCR4受体与肿瘤预后差、化疗耐药和转移有密切 关系。CXCR4受体也被确定为HIV病毒入侵的两个主要共受体之一，因此CXCR4受体拮抗剂被开发为AIDS的治疗药物，其通过占领共受体来防止病毒附着和融入细胞，因此可用于阻断HIV病毒进入宿主细胞。由此可见，CXCR4受体的配体或拮抗剂可以有效地用于肿瘤治疗和显像目的。事实上，一种小分子CXCR4受体拮抗剂AMD3100（Plerixafor）已经在临床上作为免疫刺激剂用于保护造血干细胞移植。 

发展CXCR4受体特异性的放射性示踪剂，通过正电子发射计算机断层(PET)显像用于在活体内评估受体的表达水平可以为肿瘤的诊断和治疗提供指导。 

由于SDF-1α/CXCR4系统在肿瘤发生、发展尤其在肿瘤转移方面有关键作用，因此目前正在研究的针对CXCR4靶点的分子探针多用于肿瘤显像（ID Weiss,O Jacobson.Molecular Imaging of Chemokine Receptor CXCR4.Theranostics,2013;3(1):76-84）。 

通过大量广泛深入研究，Tamamura及其合作者发展并优化了一种14氨基酸的CXCR4受体抑制剂：T140多肽及其衍生物（Tamamura H,Omagari A,Oishi S,Kanamoto T,Yamamoto N,Peiper SC,et al.Pharmacophore identification of a specific CXCR4inhibitor,T140,leads to development of effective anti-HIV agents with very high selectivity indexes.Bioorg Med Chem Lett.2000;10:2633-7）。本课题组先前报道了经放射性标记后TN14003，尽管其与CXCR4的亲和力很高，但是与红细胞的高度结合严重影响了显像效果，特别是大大降低了肿瘤与背景的比值。而且多肽侧链第7和8位Lys残基也需要保护，增加了脱保保步骤（Jacobson O,Weiss ID,Kiesewetter DO,Farber JM,Chen X.PET of Tumor CXCR4Expression with4-18F-T140.J Nucl Med.2010;51:1796-804.）。进一步利用第7和8位Lys残基进行⁶⁴Cu核素标记，仍能保持很高的受体亲和力，但是血红细胞的结合并未降低（Jacobson O WI,Szajek LP,Niu G,Ma Y,Kiesewetter DO,Farber JM,Chen X..PET imaging of CXCR4using copper-64labeled peptide antagonist.Theranostics.2011;1:251-62）。再一次利用多肽N-端进行64Cu核素标记，得到的标记配合物尽管在受体亲和力上降低1～2个量级，但是其与血红细胞的结合几乎消失，因此可以得到对比度更好的肿瘤显像结果（Jacobson O,Weiss ID,Szajek LP,Niu G,Ma Y,Kiesewetter DO,et al.Improvement of CXCR4tracer specificity for PET imaging.J Controlled Release.2012;157:216-23）。除上述放射性探针之外，目前已报道的放射性核素标记的靶向CXCR4受体的示踪剂还有多种，所用核素包括碘-125(¹²⁵I)、锝-99m(^99mTc)、氟-18(¹⁸F)、铜-64(⁶⁴Cu)和镓-68(⁶⁸Ga)等，所用配体包括小分子和多肽。但是到目前为止还没有一种满意的放射性显像剂，因此发展一种性能优异的显像剂仍在进行中。 

从核素选择来看，适用于PET的显像核素氟-18、铜-64和镓-68具有优势。¹⁸F是目前世界上最为常用的正电子核素，其核性能优良，原子半径小几乎不影响标记性质，发射正电子能量低可以有更好的空间分辨率，半衰期何时适合标记和配送，加速器生产方便易得。¹⁸F是PET显像检查中最常用的放射性核素，目前全世界应用的PET显像药物中，¹⁸F标记化合物占90%以上，广泛用于心、脑、骨、肿瘤等多种脏器疾患的检查。 

在T140系列衍生物中，最新报道的Ac-TC14012展现出很高的亲和力（29nM）和抗HIV活性（Tamamura H,Hiramatsu K,Kusano S,Terakubo S,Yamamoto N,Trent JO,et al.Synthesis of potent CXCR4inhibitors possessing low cytotoxicity and improved biostability based on T140derivatives.Org Biomol Chem.2003;1:3656-62）。而且该多肽侧链仅有一个第7位的Lys残基可用于放射性标记，可以保证得到单一组分的标记物，提高放射化学纯度。而且研究表明该位置的Lys与配体活性无关，可以进行改造或标记而不影响多肽与受体结合的活性。 

为此，本发明采用¹⁸F为放射性核素，通过一定方式与Ac-TC14012多肽相连，获得 ¹⁸F标记的针对CXCR4受体的显像剂，结合PET显像技术用于CXCR4高度表达的肿瘤诊断或疗效评价。 

发明内容

本发明的首要目的在于提供具有优良性能的新的放射性标记的T140化合物； 

本发明的另一目的在于提供新的放射性标记的T140化合物的制备方法； 

本发明的再一目的是提供所述的化合物作为肿瘤显像剂的应用。 

本发明提供了两种含有T140结构的放射性¹⁸F标记的化合物（化合物1和2）。 

式1 

本发明的目的可以通过如下技术方案实现： 

放射性核素标记的含有T140多肽衍生物的放射性药物，所述的放射性核素为¹⁸F，所述的T140多肽为Ac-TC14012。所述的放射性核素标记的T140多肽放射性药物为所述的放射性核素与所述的T140多肽结合获得，为无色透明的液体针剂。化合物1和2的化学结构式参见式1。 

化合物1的制备方法，包括以下步骤： 

1）4-硝基苯基-2-[¹⁸F]氟丙酸酯（[¹⁸F]FPA）的制备 

将适量（20～300mCi）[¹⁸F]F^-从分离柱（CHROMAFIX）上淋洗下来，置于反应瓶中，通过真空干燥方法将溶剂除去，得到无水[¹⁸F]F^-，冷却后加入适量（1～5mg）乙基2-溴丙酸酯（0.1～1mL乙腈），加热至70～150°C反应5～20min，得到乙基2-[¹⁸F]氟丙酸酯。反应结束时，加入适量（50～200μL）0.2mol/L氢氧化钾溶液和乙腈溶液（200～500μL），再次加热到70～150°C反应5～20min，得到乙基2-[¹⁸F]氟丙酸钾盐，然后以适量（0.2～2mL）乙腈稀释并真空干燥除去溶剂，之后加入适量（2～40mg）二-(4-硝基苯基)碳酸酯的乙腈 溶液，在70～150°C条件下反应5～20min，生成4-硝基苯基-2-[¹⁸F]氟丙酸酯（[¹⁸F]FPA），冷却后，反应混合物以半制备HPLC分离纯化并以C18柱浓缩体积。整个反应时间约100min，未经衰变校正的产率约10～15%。 

2）[¹⁸F]FP-Ac-TC14012（化合物1）的制备 

将上述所得并吸附于C18柱上的[¹⁸F]FPA以适量（0.2～2mL）二氯甲烷淋洗下来，手动除去上层水相，在室温下充氩气蒸发二氯甲烷溶剂，然后加入适量（20～600μg）溶于DMSO中的Ac-TC14012多肽（订制于美国多肽公司）和适量（1～10μL）的DIPEA，加热至在50～120°C条件下反应5～20min，反应结束时，冷却并以含TFA的水溶液稀释。经HPLC纯化后得到化合物1，该步反应时间约50min，衰变校正后的产率约30～40%，放射化学纯度大于95%。 

化合物2的制备方法，包括以下步骤： 

1）N-琥珀酰亚胺-4-¹⁸F-氟苯甲酸酯([¹⁸F]SFB)的制备 

将适量（20～300mCi）[¹⁸F]F^-从分离柱（CHROMAFIX）上淋洗下来，置于反应瓶中，通过真空干燥方法将溶剂除去，得到无水[¹⁸F]F^-，冷却后加入适量（1～5mg）4-三甲基胺苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐（0.1～2mLDMSO），加热至90～150°C反应5～20min，反应结束时，加入适量（200～1000μL）0.2mol/L氢氧化钠溶液，再次加热到90～150°C反应5～20min，冷却反应液，加入适量（0.1～1mL）1mol/L HCl进行酸化，得到4-¹⁸F-氟苯甲酸（[¹⁸F]FB），然后将反应混合物通过C18柱纯化，并以乙腈淋洗得到纯化后的[¹⁸F]FB，之后加入适量（2～20μL）40%氢氧化四丁基胺，吹干乙腈溶剂后再次加入适量（8～20mg）TSTU（N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐）溶液，在70～100°C条件下反应5～20min，生成[¹⁸F]SFB，冷却后，反应混合物以半制备HPLC分离纯化并以C18柱浓缩体积。整个反应时间约120min，未经衰变校正的产率约20%。 

2）[¹⁸F]FB-Ac-TC14012（化合物2）的制备 

将上述所得并吸附于C18柱上的[¹⁸F]SFB以适量（0.2～2mL）二氯甲烷淋洗下来，手动除去上层水相，在室温下充氩气蒸发二氯甲烷溶剂，然后加入适量（20～600μg）溶于0.1mL Na₂HPO₄（pH8.5，100mM）中的Ac-TC14012多肽（订制于美国多肽公司），加热至在20～60°C条件下反应5～30min，反应结束时，冷却并以含TFA的水溶液稀释。经HPLC纯化后得到化合物2，该步反应时间约60min，衰变校正后的产率约30～40%，放射 化学纯度大于98%。 

化合物1的稳定参考化合物合成（FP-Ac-TC14012） 

将适量（1～20mg）Ac-TC14012多肽溶于适量（100～1000μL）DMSO中，加入适当过量的（1.1eq）4-硝基苯基2-氟丙酸酯和适量（1～10μL）DIPEA，室温反应8～40min。以适量（1～20μL）TFA终止反应。产品经半制备HPLC分离纯化，收集目标物馏分并冻干。得到化合物1的稳定参考化合物：FP-Ac-TC14012。结果经质谱确认。 

化合物2的稳定参考化合物合成（FB-Ac-TC14012） 

将适量（1～20mg）Ac-TC14012多肽溶于适量（100～1000μL）100mM的Na₂HPO₄(pH8.5)中，加入适当过量的（1.5eq）N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯（10～1000μL乙腈），室温反应10～40min。以适量（1～60μL）TFA终止反应。产品经半制备HPLC分离纯化，收集目标物馏分并冻干。得到化合物2的稳定参考化合物：FB-Ac-TC14012。结果经质谱确认。 

上述合成步骤中的所使用的其它化学物质为市售商品。 

本发明的有益效果： 

1.本发明在T140系列衍生物中，选择与CXCR4受体亲和力最高的Ac-TC14012为配体，引入放射性¹⁸F作为显像部分。可以有效获得亲和力高的肿瘤显像剂，增加肿瘤摄取值，有利于肿瘤的早期诊断。 

2.本发明所述的两种标记物的标记方法易于实现自动化合成，这对于半衰期较短的放射性核素来说非常重要，更加有利于放射性标记物的商业化应用与临床推广。 

3.本发明所述的T140配体与放射性核素形成的化合物结构更加单一，有利于提高标记化合物的化学纯度和放射化学纯度，而且避免了放射性混合物对显像质量的影响。 

4.本发明所采用的配体Ac-TC14012的标记位点是侧链第7位的Lys，该位点与配体的活性关系不大，经过放射性标记或修饰后不会影响其生物活性。 

5.本发明所述的放射性标记化合物与血红细胞的结合很低，加快示踪剂在血液中的清除速度，增加靶/非靶比值，使得显像更加清晰，通过提高显像质量达到更好的诊断效果。 

附图说明

图1为A：流式细胞仪分析CXCR4受体在CHO-CXCR4和CHO细胞中的表达情况；B:原型化合物（Ac-TC14012）、化合物1的稳定参考化合物（FP-Ac-TC14012）和化合物2的稳定参考化合物（FB-Ac-TC14012）在CHO-CXCR4细胞内与[125I]CXCL12的竞争结合分析。 

图2为化合物1（A：摄取；B：滞留）和化合物2（C：摄取；D：滞留）分别在CHO-CXCR4和CHO细胞内的摄取与滞留。 

图3为化合物1（上）和化合物2（下）在荷瘤（CHO-CXCR4和CHO）裸鼠中给药120min后的生物分布及其共注射Ac-TC14012多肽（50μg）抑制结果。4-6只小鼠的平均值。 

图4为化合物1在荷瘤裸鼠（右肩：CHO-CXCR4；左肩：CHO）中的PET显像冠状面断层（上，1只裸鼠的代表性图片）和由此计算的定量摄取值（下，4-6只小鼠的平均结果）。A图为给药后30min的结果，B图为给药后60min的结果。 

图5为化合物2在荷瘤裸鼠（右肩：CHO-CXCR4；左肩：CHO）中的PET显像冠状面断层（上，1只裸鼠的代表性图片）和由此计算的定量摄取值（下，4-6只小鼠的平均结果）。A图为给药后30min的结果，B图为给药后60min的结果。 

具体实施方式

以下通过具体的制备例和实施例可使本发明得到更清楚地说明： 

一、制备例： 

1.化合物1的制备： 

1）4-硝基苯基-2-[¹⁸F]氟丙酸酯（[¹⁸F]FPA）的制备 

用1mL含有15mg K222（氨基聚醚）和3.5mg K₂CO₃的90%乙腈溶液将100mCi[¹⁸F]F^-从分离柱（CHROMAFIX）上淋洗下来，置于玻璃反应瓶中，通过抽真空方法将溶剂除去，得到无水[¹⁸F]F^-。冷却后加入溶于0.5mL乙腈的5mg乙基2-溴丙酸酯，加热至100°C反应10min，得到乙基2-[¹⁸F]氟丙酸酯。反应结束时，加入125μL0.2mol/L氢氧化钾溶液和375μL乙腈溶液，再次加热到100°C反应10min，得到乙基2-[¹⁸F]氟丙酸钾盐，然后以1mL乙腈稀释并真空干燥除去溶剂，之后加入适量1mL二-(4-硝基苯基)碳酸酯的乙腈溶液（20mg二-(4-硝基苯基)碳酸酯），在100°C条件下反应10min，生成4-硝基苯基-2-[¹⁸F]氟丙酸酯（[¹⁸F]FPA）。冷却后，反应混合物以1mL乙腈和5%醋酸溶液 （25%：75%）稀释，然后以半制备HPLC分离纯化，收集保留时间为21min的峰，以30mL0.1%的醋酸溶液稀释，然后通过C18柱（Waters Sep-Pak Plus）将放射性产物吸附在柱子上，以1mL水淋洗除去水溶性杂质。整个反应时间约100min，未经衰变校正的平均产率约12.4±3.4%(n=4)。 

2）[¹⁸F]FP-Ac-TC14012（化合物1）的制备 

将上述所得并吸附于C18柱上的[¹⁸F]FPA以1mL二氯甲烷淋洗下来，并置于1.5mL聚丙烯反应管中，用注射器手动除去二氯甲烷的上层水相，然后在室温下充氩气蒸发二氯甲烷溶剂，加入200μg溶于0.1mL DMSO（二甲基亚砜）中的Ac-TC14012多肽和5μLDIPEA（N,N-二异丙基乙胺），将反应管加热至80°C条件下反应10min。反应结束时，冷却反应液并以0.5mL含0.1%TFA（三氟乙酸）的水溶液稀释。经半制备HPLC纯化后得到化合物1，收集保留时间为18.9min的峰，以10mL水稀释后上样到C18柱（Varian Bond Elute，100mg）使放射性产物滞留于柱中，然后以0.15mL10mM HCl乙醇溶液淋洗，以氩气吹去乙醇，最后的产品溶于PBS中。该步反应时间约50min，衰变校正后的产率约38.1±10.5%(n=4)，基本上从9.4mCi[¹⁸F]FPA开始可以得到2.4mCi产物（化合物1）。以分析型HPLC分析放射化学纯度大于95%，相对保留时间为17.5min。 

2.化合物2的制备： 

1）N-琥珀酰亚胺-4-¹⁸F-氟苯甲酸酯([¹⁸F]SFB)的制备 

用1mL含有15mg K222和3.5mg K₂CO₃的90%乙腈溶液将160mCi[¹⁸F]F^-从分离柱（CHROMAFIX）上淋洗下来，置于玻璃反应瓶中，通过加热到110°C并充氮气的方法将溶剂除去，得到无水[¹⁸F]F^-，冷却后加入0.5mL4-三甲基胺苯甲酸乙酯三氟甲基磺酸盐（3mg溶于0.5mL DMSO），加热至120°C反应10min，反应结束时，加入500μL0.2mol/L氢氧化钠溶液，再次加热到120°C反应10min，冷却反应液，加入0.5mL1mol/L HCl进行酸化，得到4-¹⁸F-氟苯甲酸（[¹⁸F]FB），然后将反应混合物通过C18柱纯化，并以乙腈淋洗得到纯化后的[¹⁸F]FB，之后加入5μL40%氢氧化四丁基胺，充氮气吹干乙腈溶剂后，加入0.5mL TSTU（N,N,N′,N′-四甲基脲四氟硼酸盐）乙腈溶液（15mg），在90°C条件下反应5min，生成[¹⁸F]SFB。冷却反应液后，反应混合物以半制备HPLC分离纯化，得到约20mCi[¹⁸F]SFB，并以C18柱吸附该产品。反应时间约100min，未经衰变校正的平均产率约17.4±5.7%(n=4)。 

2）[¹⁸F]FB-Ac-TC14012（化合物2）的制备 

将上述所得并吸附于C18柱上的[¹⁸F]SFB以1mL二氯甲烷淋洗下来，并置于1.5mL的聚丙烯管中，用注射器手动除去上层水相，在室温下充氩气蒸发二氯甲烷溶剂，然后加入200μg溶于0.1mL100mM Na₂HPO₄（pH8.5）溶液中的Ac-TC14012多肽，并在室温条件下反应20min，反应结束时，冷却并以0.5mL含0.1%TFA的水溶液稀释。经半制备HPLC纯化后得到化合物2，收集保留时间为20.5min的峰，以10mL水稀释后上样到C18柱（Varian Bond Elute，100mg），然后以0.15mL10mM的HCl乙醇溶液淋洗，以氩气吹去乙醇溶剂后，最终产品溶于PBS中。该步反应时间约60min，衰变校正后的平均产率为31.6±7.0%(n=4)，一般来说，从10.7mCi[¹⁸F]SFB开始可以得到2.0mCi产品。最后以分析型HPLC检测放射化学纯度大于98%，相对保留时间为19.5min。 

3.化合物1的稳定参考化合物合成（FP-Ac-TC14012） 

将3mg Ac-TC14012多肽溶于400μL DMSO中，加入1.1倍当量的4-硝基苯基2-氟丙酸酯和5μL DIPEA，室温反应20min。以适量10μL TFA终止反应。产品经半制备HPLC分离纯化，收集目标物馏分（保留时间为27min）并冻干。得到白色粉末状化合物1的稳定参考化合物：FP-Ac-TC14012。产率约为56%，结果经质谱确认，高分辨质谱（C₉₅H₁₄₆FN₃₄O₂₁S₂）：[M+H]⁺:2182.4392，计算值：2181.0827(m/z)。 

4.化合物2的稳定参考化合物合成（FB-Ac-TC14012） 

将3mg Ac-TC14012多肽溶于500μL100mM的Na₂HPO₄(pH8.5)缓冲液中，加入1.5倍当量的100μL N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯乙腈溶液，室温反应20min。以20μL TFA终止反应。产品经半制备HPLC分离纯化，收集目标物馏分（保留时间31min）并冻干。得到白色粉末状化合物2的稳定参考化合物：FB-Ac-TC14012。产率约42%，结果经高分辨质谱确认（C₉₉H₁₄₆FN₃₄O₂₁S₂），[M+H]+:2230.1590，计算值：2230.0827(m/z)。 

5.HPLC梯度条件 

制备型HPLC：C18制备柱（Phenomenex Luna,5μm,250×10mm）。线性淋洗梯度：0～5分钟：5%B（0.1%TFA乙腈溶液）和95%A（0.1%TFA水溶液），5～35分钟：增加到65%B和35%A；流速：5mL/min；化合物1保留时间为21.6min。 

分析型HPLC：C18分析柱（Phenomenex Luna,5μm,150×4.6mm）。线性淋洗梯度：0～30分钟：5%A（0.1%TFA乙腈溶液）和95%A（0.1%TFA水溶液）增加到50%A和 50%B；流速：1mL/min。 

二、实施例： 

按上述制备例制备得到化合物1和2，及其相应的稳定的参考化合物（非放射性标记）FP-Ac-TC14012和FB-Ac-TC14012。以下是对它们的性能测定描述： 

1．细胞实验。选取野生型CHO（Chinese hamster ovarian）细胞和确定转染CXCR4受体的CHO细胞（CHO-CXCR4），CHO细胞生长在F-12K培养液中，含有10%胎牛血清、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酸和一些非必需氨基酸，在37°C和5%CO₂环境下培养。通过流式细胞计数法分别测定CHO-CXCR4细胞和CHO细胞内CXCR4受体定量表达，结果显示转染CXCR4受体的CHO细胞(CHO-CXCR4)比未转染的野生型CHO细胞的荧光强度高出30倍，表明CXCR4受体转染是成功的，详细结果参见图1A。 

2.Ac-TC14012，FP-Ac-TC14012和FB-Ac-TC14012与CXCR4受体的亲和力测定 

采用细胞竞争结合实验方法，分别测定未修饰的Ac-TC14012多肽（原型）、本发明化合物1的稳定参考化合物FP-Ac-TC14012多肽和化合物2的稳定参考化合物FB-Ac-TC14012多肽与CHO-CXCR4细胞表达的CXCR4受体结合能力，实验以 ¹²⁵I-CXCL12作为受体CXCR4蛋白特异性结合的放射性配基。实验结果显示：所有含T140多肽结构单元的化合物与CXCR4受体蛋白均具有较高的亲和力，它们的半抑制浓度（IC₅₀）分别为2.47nM（Ac-TC14012）、7.52nM（FP-Ac-TC14012）和25.1nM（FB-Ac-TC14012）。由此可见本发明改造后T140多肽的半抑制浓度与原化合物相当，其中改造体积较大而且脂溶性较强的FB基团引入稍微降低了亲和力。结果详见附图1B。 

3.细胞摄取与滞留实验 

将CHO-CXCR4细胞与CHO细胞分别接种在24孔板中，每孔种10⁵个细胞，每孔加入约25μCi本发明化合物1（[¹⁸F]FP-Ac-TC14012）或化合物2（[¹⁸F]FB-Ac-TC14012），在37°C条件下培养5，15，30，60和120min。然后以冷的PBS洗涤细胞两次，然后以酸洗缓冲液（50mM甘氨酸，0.1M NaCl，pH=2.8）孵育1min以除去细胞表面吸附的放射性试剂。然后细胞再次以冷却的PBS洗涤两次并每孔加入250μL0.1M NaOH消化细胞并收集，测定放射性计数。每个时间点重复三次取平均值。结果示于图2A。由此可见，本发明化合物1在CHO-CXCR4细胞内的摄取在孵育2h后达到29.94±1.16%，而同样条 件下在CHO细胞内的摄取值仅为13.17±1.04%，说明该化合物1的摄取是CXCR4受体特异性的。对于化合物2来说，细胞摄取与化合物1类似，在CHO-CXCR4细胞内孵育2h后摄取达到46.18±1.05%，而同样条件下在CHO细胞内的摄取值仅为27.23±0.46%，说明该化合物2的摄取也是CXCR4受体特异性的。该结果示于图2C。 

对于放射性试剂在CHO-CXCR4细胞内的流出（Efflux）实验，在24孔板中，每孔加入25μCi本发明化合物1（[¹⁸F]FP-Ac-TC14012）或2（[¹⁸F]FB-Ac-TC14012），在37°C条件下培养60min，然后以冷的PBS洗涤细胞两次，将细胞在F-12K培养液中孵育0，30和60min，然后细胞再次以冷却的PBS洗涤两次并每孔加入250μL0.1M NaOH消化细胞并收集，测定放射性计数。每个时间点重复三次取平均值。结果示于图2B，由此可见，本发明化合物1在CHO-CXCR4细胞内的滞留要明显高于CHO细胞，孵育60min后在细胞内的摄取分别为21.97±0.73%和6.47±0.47%，因此化合物1在CHO-CXCR4细胞和CHO细胞内的滞留率分别为73%和49%。同样可见，本发明化合物2在CHO-CXCR4细胞内的滞留要明显高于CHO细胞，孵育60min后化合物2在CHO-CXCR4细胞和CHO细胞内的摄取分别为37.38±0.77%和18.76±0.26%，因此化合物2在CHO-CXCR4细胞和CHO细胞内的滞留率分别为81%和68%。详细结果参见图2D。 

上述细胞实验结果可见，脂溶性更强的化合物2在细胞内的摄取更高，很有可能是非特异性摄取增加所致。 

4.¹⁸F标记化合物在荷瘤裸鼠体内的生物分布 

在4-6周龄的裸鼠的上肢两侧皮下分别接种CHO细胞和CHO-CXCR4细胞（每侧接种107个细胞），生长大概2周时间后用于生物分布和PET显像实验。 

从荷瘤裸鼠的尾静脉注射0.1mL（约50μCi）制备好的¹⁸F标记化合物（化合物1或2）注射液（PBS），然后于给药后120分钟将小鼠处死，取其血、心、肝、肺、肾、肌肉、骨髓、脾和瘤等组织进行称重并测量放射性计数，计算每克组织的百分注射剂量率（%ID/g）。骨髓由骨内冲洗得到。为了验证肿瘤摄取的特异性，共同注射未标记的Ac-TC14012，再次进行生物分布实验。每组4-6只小鼠。生物分布结果见附图3。由此可见，在给药后120min时，本发明化合物1和2均在CHO-CXCR4肿瘤内摄取高于CHO肿瘤（化合物1:4.30±0.86vs.0.93±0.06%ID/g,p<0.01;化合物2:1.86±0.19vs.0.44±0.02%ID/g,p<0.01)）。在使用50μg（约过量50倍）Ac-TC14012抑制时，CHO-CXCR4肿瘤摄取明显降低，此时CHO-CXCR4和CHO两种肿瘤的摄取差别不大（p>0.05）。尽 管抑制后CXCR4低表达的CHO肿瘤摄取有所升高，但是差别并不显著（p>0.05）。 

5．肿瘤模型鼠MicroPET显像 

制备好¹⁸F标记化合物（化合物1或2）溶液（PBS），取0.1mL（约100μCi）注射于荷瘤裸鼠尾静脉，分别在给药后30min和60min进行静态MicroPET断层扫面（Siemens Inveon）。为了验证放射性摄取的特异性，在注射放射性制剂的同时，注入不同剂量（10，50和200μg）的未标记多肽Ac-TC14012进行受体抑制。图像采集后进行三维重建，所得全身衰变校正冠状图像勾画感兴趣区（ROI）。从多个ROI平均像素值中获得肿瘤、肌肉、肝、肾和尿等器官中的放射性活度并转化为MBq/mL，所得值除以注射剂量得到%ID/g（假定组织密度为1g/mL）。每组4-6只小鼠。 

显像结果图见附图4和5。由此可见，本发明标记化合物1和2在给药后30min在CHO-CXCR4肿瘤中均有明显摄取和很好的肿瘤背景比值，而在CXCR4受体低表达的CHO肿瘤内的摄取要明显低很多。与以前报道的有关化合物相比，本发明化合物在血液中的滞留要少得多，可能源于较低的血红细胞结合。除了肿瘤组织外，其它代谢器官，比如肝脏和肾脏也有较高摄取。共同注射未标记的Ac-TC14012多肽进行的抑制试验结果表明，对于化合物1来说，共注射10μg（约过量10倍）Ac-TC14012可以明显提高CHO-CXCR4肿瘤的摄取（给药后30min，抑制后与抑制前摄取：4.81±0.33vs.2.43±0.13%ID/g;给药后60min，抑制后与抑制前摄取：4.52±0.24vs.2.37±0.16%ID/g,P<0.01)，可能的原因是在10μg抑制剂条件下，肝摄取被抑制造成的（给药后30min，抑制前与抑制后摄取：14.27±0.66vs.20.36±1.15%ID/g；给药后60min，抑制前与抑制后摄取：11.66±0.46vs.19.37±1.56%ID/g，P<0.01)。当共注射抑制剂量更高时（50或200μg，～50或～200倍过量），CHO-CXCR4肿瘤的放射性摄取显著降低（30min:1.53±0.09和2.20±0.17%ID/g；60min:1.45±0.17和1.65±0.14%ID/g；与共注射10μg抑制剂相比P<0.01）。同时可见，对于CXCR4受体表达阴性的CHO肿瘤来说，抑制前后放射性摄取差别并不显著（P>0.05）。共注射未标记的多肽也导致肝摄取降低和肾摄取增加，显示肝脏有可能有CXCR4受体特异性的摄取，而肾脏是主要的代谢和排泄器官。 

对于本发明化合物2来说，其在CHO-CXCR4和CHO肿瘤内的摄取规律与化合物1类似，然而其在抑制剂量分别为0和10μg时的摄取水平很低，这可能是由于化合物的亲和力较低造成的。进一步来看，在高剂量抑制时（200μg），化合物2的肝摄取高于相应的化合物1（P<0.05）。总之，化合物2的非特异性摄取较高与细胞摄取实验是一致的（细 胞实验结果参见图2）。 

两种化合物均显示出较高的脾摄取（化合物1：8.00±1.07；化合物2：7.53±0.58%ID/g），主要是因为脾是CXCR4受体表达的器官。而且这一特异性摄取也可以通过共注射抑制剂来抑制，抑制效果约为50%，与CXCR4阳性表达的肿瘤抑制效果相当。除此之外，本发明化合物在肝脏和肾脏中的高摄取与之前基于T140多肽的显像剂类似（Jacobson O WI,Szajek LP,Niu G,Ma Y,Kiesewetter DO,Farber JM,Chen X.PET imaging of CXCR4using copper-64labeled peptide antagonist.Theranostics.2011;1:251-62；Jacobson O,Weiss ID,Szajek LP,Niu G,Ma Y,Kiesewetter DO,et al.Improvement of CXCR4tracer specificity for PET imaging.J Controlled Release.2012;157:216-23；Demmer O,Dijkgraaf I,Schumacher U,Marinelli L,Cosconati S,Gourni E,et al.Design,Synthesis,and Functionalization of Dimeric Peptides Targeting Chemokine Receptor CXCR4.J Med Chem.2011;54:7648-62；Kuil J,Buckle T,Yuan H,van den Berg NS,Oishi S,Fujii N,et al.Synthesis and Evaluation of a Bimodal CXCR4Antagonistic Peptide.Bioconjugate Chem.2011;22:859-64）。 

通过共注射抑制剂，可以显著降低两种化合物（1和2）的肝摄取，表明在一定程度上肝脏是特异性摄取，这与之前有关小鼠肝脏高表达CXCR4信使RNA一致（Moepps B,Frodl R,Rodewald H-R,Baggiolini M,Gierschik P.Two murine homologues of the human chemokine receptor CXCR4mediating stromal cell-derived factor1αactivation of Gi2are differentially expressed in vivo.Eur J Immunol.1997;27:2102-12）。同时发现，随着共注射抑制剂的增加，肾摄取也增加，这一点在生物分布和PET显像结果是一致的。其它如血液、肌肉和其它主要器官的摄取是非常低的，而且摄取量不受抑制剂的影响。好几种用于SPECT和PET显像的基于T140多肽的CXCR4受体显像剂已经被报道。每一种衍生物各有优缺点，比如通过[111In]DTPA标记的Ac-TZ14011多肽，在胰腺癌AsPC-1瘤中的摄取仅为0.51%ID/g（Hanaoka H,Mukai T,Tamamura H,Mori T,Ishino S,Ogawa K,et al.Development of a111In-labeled peptide derivative targeting a chemokine receptor,CXCR4,for imaging tumors.Nucl Med Biol.2006;33:489-94）。N-FB-TN14003多肽与受体的亲和力很高，但是其与体内血红细胞的结合也很高，严重影响显像效果（Jacobson O,Weiss ID,Kiesewetter DO,Farber JM,Chen X.PET of Tumor CXCR4Expression with4-18F-T140.J Nucl Med.2010;51:1796-804；Jacobson O WI,Szajek LP,Niu G,Ma Y,Kiesewetter DO,Farber JM,Chen X.PET imaging of CXCR4using copper-64labeled peptide antagonist.Theranostics.2011;1:251-62）。 

化合物1和2是本发明人研制出的新的放射性标记T140化合物，与现有常用肿瘤显像剂相比，其与肿瘤CXCR4受体亲和力高，特异性强，具有很高的肿瘤摄取和较低的血液滞留，可以得到更好地肿瘤与本底比值，同时我们也注意到很高的肾代谢可能会影响腹部肿瘤的显像。 

同时本发明化合物还具备放射化学产率较高和放射化学纯度高的优点。在这两种化合物中，我们认为化合物1显示出更高的肿瘤摄取、更低的非特异性摄取，以及更优的肿瘤与本底比值，可见更小的标记标记辅助基团体积、更低的脂溶性有利于提高肿瘤显像的效果。本发明化合物1可以进行活体无创肿瘤显像，定量评估CXCR4受体的表达。