一种长柄扁桃外植体不定芽诱导方法

摘要

本发明公开了一种利用钾离子提高长柄扁桃外植体不定芽诱导数量的方法，在常规长柄扁桃组织培养的基础上，通过添加钾离子，从而显著的提高长柄扁桃每个外植体上不定芽的诱导数量。本发明方法简单易行，效率高，可用于长柄扁桃的人工快速繁殖。

说明书

技术领域

本发明涉及一种长柄扁桃外植体不定芽诱导方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

长柄扁桃（Amygdalus pedunculata Pall.）是蔷薇科（Rosaceae）桃属（Amygdalus）扁桃亚属（Amygdalus）的落叶灌木，又名野樱桃、柄扁桃、毛樱桃，是我国特有的扁桃属野生种。长柄扁桃具有适应范围广、抗旱、耐瘠薄、抗风蚀、固沙能力强等优良特性，在干旱沙漠地区栽培既有生态效益又有一定的经济效益。长柄扁桃果仁含粗脂肪531g/kg, 粗蛋白255.9g/kg, 铁39.88mg/kg, 锌42.16mg/kg, 钙0.224mg/kg, 营养价值高。果实中含致泻成分郁李仁甙（Amygdaluside, 3-rhamnoglucosylkaempferol），可广泛用于医疗、保健方面，对气管炎、高血压、神经衰弱、肺炎、糖尿病都有一定疗效，也可用来辅助治疗癌症；长柄扁桃仁还可制成镇静剂和止痛剂；适于加工保健品，其含油量高达45.19%～52.00%，可作工业原料，是一种极具开发潜力的生物能源植物。但是由于自然和人为地破坏，长柄扁桃的分布面积日趋减少，已被列为二级濒危植物。生产上亟需发展长柄扁桃组织快繁技术，而目前此项技术还处于探索阶段。

目前长柄扁桃的繁殖方式还是以播种、扦插为主。实生繁殖周期长，技术难度不大，但由于长柄扁桃为异花授粉，实生苗个体间差异大，难以保持优良的经济形状。而长期的扦插繁殖容易造成真菌和病毒的累积，导致品种退化，完善的组织培养技术可以成为长柄扁桃新品种培育及生理生化机制研究的重要手段。长柄扁桃组织培养不仅可以快速繁殖长柄扁桃优良种苗，用于大面积人工栽培生产，满足市场需求，还为下一步筛选优良无性系建立良好的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用钾离子提高长柄扁桃外植体上不定芽诱导数量的方法。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术解决方案：

一种长柄扁桃外植体不定芽诱导方法，包括长柄扁桃种子苗的培养和长柄扁桃不定芽的诱导，在长柄扁桃不定芽诱导培养基中添加可溶性钾盐诱导不定芽的形成。

上述不定芽诱导培养基为MS基本培养基中添加可溶性钾盐、6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，其中钾离子浓度为1000～1600mg/L，6-苄氨基腺嘌呤浓度为2.5～15μM，萘乙酸浓度为0～5μM。优选的条件是：钾离子浓度为1000～1400mg/L，6-苄氨基腺嘌呤浓度为5～10μM，萘乙酸浓度为0.5～2.5μM。所述可溶性钾盐选自硝酸钾、氯化钾、磷酸二氢钾。

本发明选取长柄扁桃[Amygdalus pedunculata Pall.] 种子为最初材料，在无菌条件下进行萌发生成种子苗，以种子苗的节（腋芽）为不定芽诱导的外植体，通过提高培养基的钾离子用量，可显著提高长柄扁桃不定芽的诱导数量，而且不会增加不定芽的褐化程度。其操作简单，很容易提高长柄扁桃离体不定芽的诱导效率，为人工大规模进行长柄扁桃的快速繁殖提供重要的技术基础。

附图说明

图1为在MS基本培养基中添加5.0μM 的6-BA，5.0μM的NAA；

图2为在MS基本培养基中添加2200mg/L K⁺（以6.04g/L KNO₃的形式加入）、5μM 的6-BA，2.0μM的NAA；

图3为在MS基本培养基中添加10μM 的6-BA，2.5μM的NAA；

图4 为在MS基本培养基中添加1200mg/L K⁺（以3.29g/L KNO₃的形式加入）、10μM 的6-BA，2.5μM的NAA；

图5 为在MS基本培养基中添加1200mg/L K⁺（以0.29g/L KCl的形式加入）、10μM 的6-BA，2.5μM的NAA；

图6为在MS基本培养基中添加2200mg/L K⁺（以7.68g/L KH₂PO₄的形式加入）、10μM 的6-BA，2.5μM的NAA。

具体实施方式

具体地说，本发明利用钾离子提高长柄扁桃外植体上不定芽诱导数量的方法包括下列步骤： 

（1）长柄扁桃种子苗的培养采用常规无菌苗培养

长柄扁桃[Amygdalus pedunculata Pall.] 种子经自来水冲洗干净，在超净工作台中将种子浸入质量分数为70%的乙醇溶液中60s，接着置于浓度0.1%的升汞（HgCl₂）溶液中浸泡8min，用无菌水冲洗3次。用经过灭菌的滤纸将种子表面的水分吸干，然后种植到MS固体培养基中培养，培养期间的光照强度为4000Lx，光周期为16h，温度为25±0.5℃。

（2）长柄扁桃不定芽的诱导

取生长至5cm的长柄扁桃种子苗，用经过灭菌的手术刀切取长柄扁桃的腋芽，然后将长柄扁桃的腋芽接种到不定芽诱导培养基中培养，培养期间的光照强度为4000Lx，光周期为16h，温度为25±0.5℃，培养时间为35天。

所述不定芽诱导培养基的组成为：MS基本培养基中添加可溶性钾盐、6-苄氨基腺嘌呤和萘乙酸，其中钾离子浓度为1000～1600mg/L，6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）浓度为2.5～15μM，萘乙酸(NAA) 浓度为0～5μM。优选的方式是钾离子浓度为1000～1400mg/L，6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）浓度为5～10μM，萘乙酸(NAA) 浓度为0.5～2.5μM。

发明人研究表明，在长柄扁桃组织培养过程中，不定芽的诱导是一个限制性因素。申请人在筛选长柄扁桃组织培养中，在不定芽的诱导过程中对培养基中的钾离子的添加剂量进行深入的研究，发现适当的提高培养基的钾离子用量可以显著的提高长柄扁桃不定芽的诱导数量，而且不会增加不定芽的玻璃化和褐化的程度。

MS基本培养基组成：1.65g/L的NH₄NO₃ 、1.9g/L的KNO₃、0.17g/L的KH₂PO₄、0.37g/L的MgSO₄·7H₂O、0.44g/L的CaCl₂·2H₂O、0.83mg/L的KI、6.2mg/L的H₃BO₃、22.3mg/L的MnSO₄·4H₂O、8.6mg/L的ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L的Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L的CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L的CoCl₂·6H₂O、37.3mg/L的Na₂·EDTA、27.8mg/L的FeSO₄·7H₂O、肌醇100mg/L、甘氨酸2mg/L、盐酸硫胺素0.1mg/L、盐酸吡哆醇0.5mg/L、烟酸0.5mg/L、蔗糖30g/L。

以下是发明人给出的具体实施例。

实施例1

（1）长柄扁桃种子苗的培养

长柄扁桃种子经自来水冲洗干净，在超净工作台中将种子浸入质量分数为70%的乙醇溶液中60s，接着置于浓度0.1%的升汞（HgCl₂）溶液中浸泡8min，再用无菌水冲洗3次。用灭过菌的滤纸将种子表面的水分吸干，然后种植到MS固体培养基中培养。培养期间的光照强度为4000Lx，光周期为16h，温度为25±0.5℃。

（2）长柄扁桃不定芽的诱导

取生长至5 cm的长柄扁桃种子苗，用经过灭菌的手术刀切取长柄扁桃的节（腋芽），然后将节（腋芽）接种到含有5.0μM 的6-BA和5.0μM的NAA的MS培养基中（即为不定芽诱导培养基）培养。光照强度为4000 Lx，光周期为16 h，温度为25±0.5℃，培养时间35天，培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为1.6个（图1）。

实施例2

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中添加15μM 的6-BA和2.0μM的NAA。培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为2.2个。

实施例3

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中添加2.5μM 的6-BA；培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为0.8个。

实施例4

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中添加10μM 的6-BA；培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为1.2个。

实施例5

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中添加10μM 的6-BA和2.5μM的NAA；培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为2.3个（图3）。

实施例6

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中KNO₃的含量降低到1.37g/L(相当于500 mg/L K⁺的剂量)、10μM 的6-BA和2.5μM的NAA。培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为1.5个。

实施例7

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中添加了1200mg/L K⁺（以3.29g/L KNO₃的形式加入）、10μM 的6-BA；培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为1.8个。

实施例8

与实施例1类似，不同的是不定芽诱导培养基是MS基本培养基中添加了不同浓度的K⁺，K⁺是以KNO₃的形式加入（见表1）、10μM 的6-BA和2.5μM的NAA。培养完成后，腋芽上不定芽的平均数量见表1。

从表1可见，K⁺浓度在800～1600mg/L范围内，能诱导不定芽数量的增加，K⁺浓度最好在1000～1400mg/L（图4），大于2200mg/L，出现褐化。

实施例9

与实施例1类似，不同的是K⁺是以KCl的形式加入。培养完成后，腋芽上不定芽的平均数量见表2。

从表2可见，K⁺浓度在800～1600mg/L范围内，能诱导不定芽数量的增加，K⁺浓度最好在1000～1600mg/L（图5），大于2200mg/L，出现褐化。

实施例10

与实施例1类似，不同的是K⁺是以KH₂PO₄的形式加入。培养完成后，腋芽上不定芽的平均数量见表3。

从表3可见，K⁺浓度在800～1600mg/L范围内，能诱导不定芽数量的增加，K⁺浓度最好在1000～1600mg/L，大于2200mg/L，出现褐化（图6）。

实施例11

与实施例1类似，不同的是在MS基本培养基中添加2200mg/L K⁺（以6.04g/L KNO₃的形式加入）、5μM 的6-BA，2.0μM的NAA。培养完成后，腋芽上不定芽的数量平均为1.2个，不定芽褐化严重（图2）。