一种小蓬竹快速繁殖方法

摘要

本发明公开了一种小蓬竹快速繁殖方法，包括：小蓬竹外植体选择、小蓬竹外植体的消毒、小蓬竹丛生芽诱导、小蓬竹丛生芽增殖、小蓬竹丛生芽生根和小蓬竹组培苗移栽。本发明的小蓬竹快速繁殖方法，具有投资少、小蓬竹育苗速度快，成活率高、竹苗长势一致等优点，克服了传统的母竹移栽所产生的各类缺点，如繁殖效率低、生境破坏大、繁殖周期长、运输成本高等，而且作为一种小蓬竹快速繁殖方法，采用此方法繁殖小蓬竹竹苗不受季节限制、运输成本低廉，适合工厂化育苗生产，为快速恢复小蓬竹自然状态下的数量、发挥小蓬竹在喀斯特地区生态效益与经济效益提供了一种快速有效的途径。

说明书

技术领域

本发明属于竹类植物组培快繁技术领域，具体地说是涉及一种采用组织培养技术建立小蓬竹快繁体系的方法。 

背景技术

小蓬竹(Ampelocalamus luodianensis)系禾本科竹亚科悬竹属(Ampelocalamus)竹种，为喀斯特地区的濒危植物，目前主要分布于贵州省罗甸县、长顺县、紫云苗族布依族自治县、望谟县。整个分布区位于北纬：24°58′-26°03′；东经：105°25′-107°03′，垂直分布高度在650-1250m之间。其外形美观，有栽培观赏价值，同时，小蓬竹能在环境恶劣的喀斯特地区生长良好，能耐干旱和贫瘠，对增强土壤的固土、保水、保肥能力效果十分显著，其林冠层对降雨的截留量明显优于灌木群落，林下土壤中水稳性团聚体的数量也高于灌木群落和草地，在喀斯特生态系统中对水源涵养、水土保持、养分平衡等生态功能发挥着重要作用，具有很高的生态效益。近些年来，小蓬竹被当地造纸企业广泛用作造纸原料，特别是对新生幼竹掠夺式砍伐现象严重，致使小蓬竹无性系种群严重退化，种群数量急剧减少，在《中国物种红色名录(第一卷:红色名录)》中小蓬竹被列为极危物种。 

竹类植物开花周期长，很难采取有性繁殖的方式获得竹苗，目前竹类植物的繁殖方式主要采用移竹、埋鞭、扦插等繁殖方式获取竹苗，而诸类繁殖方式存在许多问题，如：移竹造林过程需要大量的母竹，且运输成本高、成活率低、繁殖速度慢；埋鞭育苗过程中竹苗繁殖系数低、生长速度慢且竹苗后期长势弱、成林周期长；扦插育苗虽繁殖系数较前两种方式高，但枝条扦插过程中受季节限制明显、且成活率低、育苗周期长。目前小蓬竹的育苗造林方式主要采用移竹造林，效率极低，无法有效缓解小蓬竹目前种群数量急剧减少的问题。采用组织培养的方法效率高，条件可控，而且竹苗生长快、周期短、繁殖系数高且不受季节限制、运输方便，适合小蓬竹竹苗的工厂化生产，可从根本上缓解小蓬竹种群数量下降的问题。 

迄今为止，国内外竹子组织培养工作已经取得了很大的进展，通过组织培养技术，已实现对平安竹(Pseudosasa japonica 'Tsutsumiana')、紫竹(Phyllostachys nigra)、金镶玉竹(Phyllostachys aureosulcata 'Spectabilis')、翠竹(Sasa pygmaea)、菲白竹(Pleioblastus fortunei)、铺地竹(Pleiblastus argenteastriatus)等观赏竹的组培快繁。针对小蓬竹的组培研究较少，目前仅见小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法（201010268792.2）及小蓬竹组织培养的培养基组合物及其应用（201010268793.7），该两项内容仅为小蓬竹快繁过程中前期工作，虽对小蓬竹育苗技术具有重要的参考价值，但无法从根本上解决喀斯特地区小蓬竹数量急剧下降的问题，同时在小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法中（201010268792.2）所用方法为：先用洗洁精浸泡，之后用流水冲洗，在超净工作台上用70-75%酒精消毒1min，无菌水浸泡后用0.1%升汞灭菌6-12分钟，此方法经过验证，对小蓬竹外植体的消毒处理的确有效，但因考虑到外植体对杀菌剂的忍耐力和消毒过程对外植体成活率的影响，虽然消毒时间越长，灭菌效果越好，但长时间的消毒也可能导致外植体死亡，用此方法后小蓬竹外植体成活率<30%，因而不能单纯的根据污染率来判断最佳消毒方法，应同时考虑污染率与成活率两个方面。在小蓬竹组织培养的培养基组合物及其应用（201010268793.7）中涉及到了小蓬竹芽的诱导配方，但芽的诱导仅为采用组培法快繁小蓬竹竹苗中的开始，后期丛芽的增殖、生根、移栽等更为重要。 

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种小蓬竹快速繁殖方法，以克服小蓬竹繁殖困难，缓解自然状态下小蓬竹种群数量急剧减少的问题，填补小蓬竹快繁中的空白。 

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下： 

一种小蓬竹快速繁殖方法，包括如下步骤：

1）取的小蓬竹外植体，放在洗洁精水中浸泡2min，并不断摇动，然后放在流水下冲洗2-3h，用滤纸吸干表面水分，然后，用70%乙醇浸泡30~40s，用无菌水冲洗数次，浸入0.1% HgCl₂溶液中处理3~8min，用无菌水冲洗数次，无菌滤纸吸干表面水分；

2）小蓬竹丛生芽诱导：将消毒后的小蓬竹外植体转接于培养基混合物中，25±1℃，光照3000 lx，14 h/d，诱导小蓬竹丛生芽，诱导时间持续20-25d；其中，培养基混合物：MS基本培养基，6-BA浓度为3~5mg/L，附加蔗糖30 g/L作为碳源，添加6.5 g/L琼脂作为凝固剂；用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节pH值为5.8了；

3）小蓬竹丛生芽增殖：将诱导出的丛生芽在超净工作台上切割成带有3-5个芽的小块，经过分离后转接到增殖培养基混合物上，25±1℃，光照3000 lx，14h/d，进行增殖培养，增殖培养时间持续15-30d；其中，增殖培养基混合物：MS基本培养基、生长调节剂6-BA浓度3~5mg/L、KT浓度为0.5~1mg/L、蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L混合而成；

4）小蓬竹丛生芽生根培养：将增殖后的小蓬竹丛生芽，经过分离后转接到生根培养基混合物上，25±1℃，光照3000 lx，14h/d，进行生根培养，生根培养时间持续50d-60d；其中，生根培养基混合物：MS基本培养基、蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L、6-BA浓度为1mg/L、NAA浓度为1~2mg/L、IBA浓度为0.5~1mg/L。

5）小蓬竹组培苗移栽：将生根培养50-60d后小蓬竹组培苗进行炼苗7d，用自来水将根系残留的培养基冲洗干净，栽于盛有基质的营养钵内。 

步骤1）中，选择生长健壮而无病虫害的植株，取其中带有未萌动秆芽或刚萌动秆芽的半木质化、秆芽包裹在叶鞘内的枝条作为小蓬竹外植体。 

步骤1）中，用70%乙醇浸泡30s，用无菌水冲洗3次，浸入0.1% HgCl₂溶液中处理5min，用无菌水冲洗5次。 

步骤2）中，培养基混合物中，6-BA浓度为5mg/L。 

步骤3）中，增殖培养基混合物中，6-BA浓度为5mg/L、KT浓度为0.5mg/L。 

步骤4）中，生根培养基混合物中，NAA浓度为2mg/L、IBA浓度为1mg/L。 

步骤4）中，生根培养基混合物中，NAA浓度为1mg/L、IBA浓度为0.5mg/L。 

步骤5）中，所述基质为蛭石，颗粒大小为2-4mm。 

步骤5）中，所述基质为体积比为1:1的草炭与蛭石的混合物。 

有益效果：与现有技术相比，本发明的小蓬竹快速繁殖方法，具有投资少、小蓬竹育苗速度快，成活率高、竹苗长势一致等优点，克服了传统的母竹移栽所产生的各类缺点，如繁殖效率低、生境破坏大、繁殖周期长、运输成本高等，而且作为一种小蓬竹快速繁殖方法，采用此方法繁殖小蓬竹竹苗不受季节限制、运输成本低廉，适合工厂化育苗生产，为快速恢复小蓬竹自然状态下的数量、发挥小蓬竹在喀斯特地区生态效益与经济效益提供了一种快速有效的途径。 

附图说明

图1是作为外植体的秆芽图； 

图2是秆芽萌动图；

图3是丛生芽诱导图；

图4是丛生芽增殖图；

图5是用于生根的丛生芽图；

图6是生根的再生植株图；

图7是移栽14d后新根生长情况图；

图8是移栽24d后新根生长情况图；

图9是移栽44d后不同配方新根对比图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明。 

实施例1  小蓬竹外置消毒 

半木质化的枝条（即外植体：生长健壮而无病虫害的植株，取其中带有未萌动秆芽或刚萌动秆芽的半木质化、秆芽包裹在叶鞘内的枝条）由室外采回室内后，切成小段，每段带有一个秆芽，节上节下各留0.5-1cm，取白猫牌洗洁精2-3ml，溶于2-3L自来水中，将外植体放置于放在洗洁精水（浓度约为1‰）中浸泡2min，并不断摇动，然后放在流水下冲洗2-3h，用滤纸吸干表面水分。预处理后，将茎段放置于超净工作台上，用70%乙醇和0.1%HgCl₂溶液对外植体进行灭菌消毒处理试验，每次乙醇消毒处理后用无菌水冲洗3次，升汞处理后用无菌水冲洗5次。

本实验共设6个处理，每个处理重复5次。消毒方式70%乙醇消毒处理30s、40s，0.1% HgCl₂消毒处理3min、5min、8min。消毒后的茎段放在已灭菌的培养皿中，接种到起始培养基上（起始培养基为MS+6-BA3.0 mg/L），每个处理接种24个外植体，重复3次，15d后统计污染率，25 d后统计成活率。 

实验结果如表1所示，从污染率来看，处理6的结果虽然最低，污染率为1.4%，但是其成活率也最低，只有41.7%，这就说明用乙醇40 s和升汞8 min对小蓬竹进行处理，虽然灭菌效果极好，但同时也对外植体造成了伤害，明显降低了外植体的成活率，由此可见，文献小蓬竹组织培养过程中外植体的消毒方法（201010268792.2）中采用的处理方法，虽污染率低，但外植体的成活率也受到极大影响，因而处理6并非最佳消毒方法。 

 表1  不同消毒剂处理不同时间对外植体培养的影响 

使用70%乙醇消毒40s比消毒30s处理后污染率虽有所降低，但是成活率也显著降低，均低于50%，这是由于小蓬竹外植体细小、幼嫩，而乙醇具有较强的穿透力和杀菌力，处理40s对小蓬竹外植体存在一定的伤害，因而在乙醇消毒时间上选择30s。当升汞消毒时间为3min时，处理1和处理4的污染率均超过20%，显著高于其他处理，灭菌时间过短导致部分病菌没有被杀死，因而污染率较高，其中处理1的成活率虽能达到61.1%，但因其高污染率而不作为最佳处理。在处理2和处理3的选择上，虽然处理3污染率略低于处理2，但是其成活率却显著低于处理2，其原因是灭菌时，HgCl₂游离出少部分Hg⁺，秆芽受到Hg⁺的毒害而死亡，影响了成活率。可见在降低污染率措施时，并不是消毒时间越长越好，不宜采用延长消毒时间的办法。

因此，根据上述试验结果，小蓬竹外植体的最佳消毒方法为：流水冲洗2-3h→70%乙醇处理30s→无菌水冲洗3次→0.1% HgCl₂处理5min→无菌水冲洗5次→无菌滤纸吸干表面水分。通过以上消毒方法处理后的小蓬竹外植体接种后，无菌率最高，芽诱导成活率高。 

实施例2  小蓬竹丛芽诱导 

本试验选择MS为基本培养基，使用生长调节剂6-BA、NAA和KT组合诱导丛芽的产生，以试验筛选出的最佳消毒方法（实施例1）处理过的外植体为试验材料进行丛芽诱导，选择最适合丛芽诱导的激素配比。每种浓度组合24瓶，每瓶接种3个外植体。25±1℃，光照3000 lx，14h/d，进行诱导培养；每5d观察1次，观察周期为25d，统计丛芽的诱导个数，观察并记录芽的生长情况。

外植体的秆芽，如图1所示；秆芽萌动，如图2所示；丛生芽诱导，如图3所示。实验结果如表2所示，小蓬竹丛芽诱导激素配比组合的最优配方是A₃B₁C₁，即：MS+6-BA5 mg/L，无需添加KT和NAA。对实验数据进行比较可知，6-BA的极差为29.48，KT的极差为23.27，NAA的极差为14.69，各激素类型对小蓬竹丛芽诱导率的影响是：6-BA＞KT＞NAA，这说明细胞分裂素是丛芽萌动所必需的。 

表2  丛芽诱导激素配比的实验结果 

实施例3  小蓬竹丛芽增殖

将诱导出的丛芽切割成带有几个芽（3-5个）的小块，经过分离后转接到增殖培养基上，25±1℃，光照3000 lx，14h/d，进行增殖培养。使用生长调节剂6-BA、KT、NAA组合进行增殖，实验采用三因素三水平正交设计，研究不同浓度组合对继代繁殖的影响。

丛生芽增殖，如图4所示。实验结果如表3所示，丛生芽增殖激素配比组合的最优配方是A₃B₂C₁，即：MS+6-BA 5mg/L+KT 0.5mg/L。对实验数据进行比较可知，6-BA的极差为1.04，KT的极差为0.26，NAA的极差为0.47，各激素类型间对丛生芽增殖倍数的影响是：6-BA＞NAA＞KT。 

表3  不同浓度激素对丛生芽增殖倍数的实验结果 

实施例4  小蓬竹丛芽生根

用于生根的小蓬竹组培苗如图5所示，是由秆芽诱导的、通过以芽繁芽的方式在继代增殖培养基上培养的小蓬竹再生苗（经实施例2、3培养）。挑选健壮的小蓬竹组培苗，接入生根培养基，25±1℃，光照3000 lx，14h/d，诱导不定根。以MS为基本培养基，选择生长素NAA、IBA和细胞分裂素6-BA不同浓度组合，进行小蓬竹组培苗生根培养研究，实验设计及各激素水平见表4。

表4  再生植株生根培养的正交设计方案 

试验过程中，每7d观察一次，各处理中随机挑选5瓶小蓬竹组培苗，将组培苗从培养瓶中取出，用自来水小心将培养基清洗干净，用剪刀将根系剪下，统计根系数量，同时用根系分析仪分析各处理小蓬竹组培苗的各根系特征值。

实验结果如表5所示，9种配方对小蓬竹组培苗进行生根处理，其中配方2、配方3处理在根系长度、根系体积、表面积等根系特征指标上明显优于其他配方，采用主成分分析法对9种配方进行分析，筛选出一个主成分，通过主成分综合得分，发现配方3为小蓬竹组培苗各根系配方中的最优配方，但配方2、3主成分得分值较为接近，因此，小蓬竹根系诱导可选择的配方为：MS+6-BA 1mg/L+NAA 1mg/L+IBA 0.5mg/L；MS+6-BA 1mg/L+NAA 2mg/L+IBA 1mg/L。 

表5  不同生根配方下小蓬竹组培苗根系特征值测定结果（平均值） 

6-BA浓度在1mg/L时最有利于与小蓬竹根系的生长，而在6-BA浓度达到5mg/L时，明显对小蓬竹根系生长起到了抑制作用，使P7、P8、P9配方中的小蓬竹组培苗在试验进行的30d内无根系生长。生根的再生植株如图6所示。

实施例5  小蓬竹组培苗移栽 

小蓬竹组培苗移栽是小蓬竹快繁体系建立的关键一环，组培苗移栽后成活率的高低及长势好坏直接关系到小蓬竹快繁体系的成败，移栽苗应为根系发达、生长健壮、无病虫害的组培苗，由此可见根系诱导过程中的配方选择是决定小蓬竹组培苗移栽后长势的前提。通过分析小蓬竹组培苗根系诱导实验结果可知，生根配方2号、3号最有利于小蓬竹的根系诱导，而且根系生长最快，是小蓬竹根系诱导过程中最为理想的配方。为进一步筛选小蓬竹快繁体系建立中的最优配方及最优培养基质，本实施例选取由生根配方2号、3号培养的小蓬竹组培苗生根后，进行移栽。

具体方法如下： 

将在配方2、3培养基内生长的小蓬竹组培苗生根处理40d，取下瓶盖，以12瓶为一组放置于塑料袋内，并在塑料袋内放置蒸馏水一瓶，系紧袋口，以保证袋内空气的相对湿度。7天后，从培养瓶中用镊子小心取出小蓬竹组培苗，用自来水冲洗干净根部残留的培养基，栽植于含有草炭、蛭石（2-4mm）、草炭+蛭石（按体积比1:1）培养基质的营养钵内，营养钵的规格为20cm×20cm，每个处理设20盆，置于温室大棚内，并经常喷水保湿。移栽20d后，每处理取5盆，将移栽苗取出，置于清水中将附着于根系上的基质洗净，用剪刀剪取新生根系（新根颜色为乳白色），用根系分析仪测定根相关特征值，分析根系的生长状况。

实验结果如下： 

两种配方均以蛭石培养的小蓬竹组培苗根系长度最长，以草炭+蛭石配方次之，以草炭配方中小蓬竹组培苗根系长度最小。蛭石培养2号配方小蓬竹组培苗根系长度较草炭培养的根系提高65.72%，蛭石培养3号配方小蓬竹组培苗根系长度较草炭培养的根系31.01%。两种配方均以蛭石培养的小蓬竹组培苗根系生长速率最快，为28.65cm/d，以草炭培养小蓬竹组培苗根系生长速率最低，为19.29 cm/d。3种基质配方中以蛭石培养的小蓬竹组培苗根系表面积最大，以草炭配方中小蓬竹组培苗根系表面积最小，蛭石配方较草炭配方提高45.24%。2号配方中，蛭石基质与草炭+蛭石基质中根系表面积均高于3号配方，蛭石配方中2号配方较3号高18.08%，2号配方草炭+蛭石基质较3号提高11.72%，而草炭基质中，3号配方小蓬竹组培苗根系表面积要高于2号配方，提高12.48%。小蓬竹组培苗根系体积以2号草炭+蛭石上升速度最快，其增长速率为0.066 cm³/d，以2号草炭根系体积增长速率最慢，仅为2号草炭+蛭石的44.21%。3种基质配方中，以草炭+蛭石配方中小蓬竹根系体积最大，以草炭配方最小，仅为草炭+蛭石配方的67.64%。2种生根配方中，2号蛭石、草炭+蛭石基质中根系体积均高于3号，而草炭基质中，3号生根配方要高于2号，提高30.87%。各生根、基质配方中，以2号生根配方在蛭石中根系分形维数最大，为1.56，以2号生根配方在草炭中最小，仅为蛭石的92.93%。生根配方中，草炭基质中，3号配方要高于2号，而在蛭石、草炭+蛭石基质，3号生根配方均低于2号，分别为2号配方的97.46%、98.78%。

由此可见，蛭石处理效果要优于草炭、草炭+蛭石，且成活率达100%，因而移栽基质的最佳选择为蛭石。同时导致这类基质容器苗的生长差异的原因和前期组培苗生根过程中采用的激素配方有关，结果表明，经配方2处理的小蓬竹组培苗移栽后根系生长状况要优于3号，综合小蓬竹组培苗生根处理配方结果分析，P2配方为小蓬竹组培苗生根到移栽过程中较为理想的配方，即MS+6-BA 1 mg/L+NAA 1mg/L+IBA 0.5 mg/L。 

移栽14d后新根生长情况，如图7所示；移栽24d后新根生长情况，如图8所示；移栽44d后不同配方新根对比，如图9所示。 

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，本发明中所涉及洗洁精品牌等内容并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围。