番鸭专用的三联活疫苗

摘要

本发明公开了番鸭专用的三联疫苗，该番鸭专用的三联疫苗以番鸭肝白点病弱毒MWCA株、番鸭细小病毒弱毒P1株和番鸭源鹅细小病毒弱毒D株为种毒，分别应用SPF鸡胚成纤维细胞或番鸭胚成纤维细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混合后加冻干保护剂冷冻干燥，制成番鸭专用的番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病的三联活疫苗，在流行番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病的番鸭养殖地区应用，能达到一次免疫接种可同时预防和控制上述三种病的目的。

说明书

技术领域

本发明涉及番鸭专用的番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和小鹅瘟病的 三联疫苗。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒病(俗称“肝白点病”、“花肝病”、“白点病”、“肝脾白点病” 和“番鸭坏死性肝炎”等)是1997年以来，在福建省莆田、福清、福川、长乐和 浙江金华、广东佛山等地番鸭饲养区发生一种临床上以软脚为主要症状，以肝、 脾表面有多量白点、肾脏肿大、出血、表面有黄色条斑为主要病理变化的传染病。 该病只发生于番鸭，发病日龄为7～45日龄，以10～30日龄的雏番鸭为最甚。 发病率为30～90％，病死率为60～80％，发病未死鸭耐过后成为僵鸭，给番鸭 业造成很大经济损失。

番鸭细小病毒病(俗称“三周病”)是1987年在我省首先发现的1-3周龄番 鸭以喘泻为临床症状的一种新疫病。该病主要侵害7-21日龄的雏番鸭，发病率 27-62％和病死率22-43％，病愈鸭大部分成为僵鸭，给番鸭业造成很大经济损失。

番鸭小鹅瘟病是1997年以来在福建省莆田、福清等地的番鸭饲养区暴发流 行，目前全国各养鸭地区均有发生。临床上雏番鸭发生以腹泻、肠粘膜脱落形成 栓塞为特征，发病率50-70％、病死率40-65％。使用各种抗菌素、番鸭细小病毒 疫苗及高免卵黄抗体等均不能控制病情，给养鸭业造成较大经济损失。

鉴于番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病均是严重危害番鸭 养殖业的重要传染病，我们首次研制出番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和番 鸭小鹅瘟病的三联活疫苗。

发明内容

本发明的任务是提供番鸭专用的番鸭细小病毒病、番鸭呼肠孤病毒病和番 鸭小鹅瘟病的三联活疫苗，本发明是通过如下技术方案来实现的：

番鸭专用的番鸭细小病毒病、番鸭呼肠孤病毒病和番鸭小鹅瘟病三联活疫 苗(简称：番鸭专用的三联活疫苗)是采用：

a、来源于人工致弱的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株， 该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，(简称CGMCC)， 地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，保藏日2001 年12月18日，保藏编号：CGMCC0667。(见已授权中国专利号01144485.1，授 权公告号CN1179751C)；

b、来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株)，保藏在中国 典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)， 保藏单位CCTCC地址在中国武汉市武汉大学，保藏日2010年6月2日，保藏编 号：CCTCC NO：V201013；

c、来源于人工致弱的番鸭源鹅细小病毒弱毒D株(GPV-D株)，保藏在中国 典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture Collection，简称CCTCC)， 保藏单位CCTCC地址在中国武汉市武汉大学，保藏日2010年6月2日，保藏编号： CCTCC NO：V201014；

将上述的番鸭肝白点病弱毒MWCA株、番鸭细小病毒弱毒P1株和番鸭源 鹅细小病毒弱毒D株应用于制备番鸭细小病毒病、番鸭呼肠孤病毒病和番鸭小 鹅瘟病三联活疫苗。

与现有技术相比，本发明以番鸭肝白点病弱毒MWCA株(即：番鸭呼肠孤 病毒弱毒CA株)、番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株)和番鸭源鹅细小病毒 弱毒D株(GPV-D株)为种毒，分别应用SPF鸡胚成纤维细胞或番鸭胚成纤维 细胞转瓶培养技术增殖病毒，收获细胞毒液，按适当比例混合后加冻干保护剂冷 冻干燥，首次研制成遗传性稳定、安全性好、免疫原性强且成本低的番鸭三联活 疫苗，在流行番鸭三周病、番鸭肝白点病(花肝病)和番鸭小鹅瘟病的番鸭养殖 地区应用，能达到一次免疫接种即可同时预防和控制三种疫病的目的；1-2日龄雏 番鸭免疫一次即可有效预防番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病， 减少了人力物力，减少了因多次免疫注射对鸭群造成的不良应激反应；本发明适于 GMP条件下的大规模生产。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明进一步说明。(但不是对本发明的限制)。

a.来源于人工致弱的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株， 是利用番鸭胚成纤维细胞和鸡胚成纤维细胞传代诱变选育致弱而成，已失去对一 日龄雏番鸭的致病性，并具有如下特性(1)病毒效价：MWCA株对鸡胚成纤维 单层细胞TCID₅₀≥10^-50/0.1ml；(2)安全性：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每 羽腿部肌肉注射毒种原液0.2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性： 一日龄健康敏感雏番鸭，腿部肌肉注射0.2毫升，其最小免疫量为 600TCID₅₀/0.2ml。该毒株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，(现名：中国普通微生物菌种保藏管理中心，China General Microbiological  Culture Collection Center，简称：CGMCC)，地址在北京市朝阳区北辰西路 1号院中国科学院微生物研究所，保藏日2001年12月18日，保藏编号： CGMCC0667。(见已授权中国专利号01144485.1，授权公告号CN1179751C，番 鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株在该专利文献中也称： CGMCC0667毒株)；

b.来源于人工致弱的番鸭细小病毒弱毒P1株(MPV-P1株)，是利用番鸭胚 和番鸭胚成纤维细胞交替传代等生物技术人工选育致弱而成，已失去对一日龄雏 番鸭的致病性，并具有如下特性(1)病毒效价：MPV-P1株对番鸭胚成纤维单 层细胞TCID₅₀≥10^-45/0.1ml；(2)安全性：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽 腿部肌肉注射毒种原液0.2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性：一 日龄健康敏感雏番鸭，腿部肌肉注射0.2毫升，其最小免疫量为100TCID₅₀/0.2ml。 MPV-P1株保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Culture  Collection，简称：CCTCC)，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCV201013；

c.来源于人工致弱的番鸭源鹅细小病毒弱毒D株(GPV-D株)，是利用番鸭 胚成纤维细胞变量交互传代选育致弱而成，已失去对一日龄雏番鸭的致病性，并 具有如下特性(1)病毒效价：GPV-D株对番鸭胚成纤维单层细胞 TCID50≥10^-45/0.1ml；(2)安全性：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌 肉注射毒种原液0.2毫升，观察20天，应全部存活；(3)免疫原性：一日龄健 康敏感雏番鸭，腿部肌肉注射0.2毫升，其最小免疫量为300TCID₅₀/0.2ml。GPV-D 株保藏在CCTCC，保藏日2010年6月2日，保藏编号CCTCCV201014；

将上述的番鸭肝白点病(番鸭呼肠孤病毒病)弱毒MWCA株、番鸭细小 病毒弱毒P1株和番鸭源鹅细小病毒弱毒D株用于制备番鸭细小病毒病、番鸭呼 肠孤病毒病和番鸭小鹅瘟病的三联活疫苗。

上述的番鸭专用的番鸭呼肠孤病毒病、番鸭细小病毒病和番鸭小鹅瘟病三 联疫苗的制备方法如下：

(1)MPV-P1株增殖，将MPV-P1株种毒按培养液量的1％同步接种番鸭胚 成纤维细胞(MDEF)，37℃旋转培养至细胞病变达75％以上，收获MPV-P1细 胞毒。

(2)GPV-D株增殖，将GPV-D株种毒按培养液量的1％同步接种番鸭胚成 纤维细胞(MDEF)，37℃旋转培养至细胞病变达75％以上，收获GPV-D细胞毒。

(3)MDRV-CA株增殖，将MDRV-CA株种毒按培养液量的1％同步接种SPF 鸡胚成纤维细胞(CEF)，37℃旋转培养至细胞病变达75％以上，收获MDRV-CA 细胞毒。

(4)病毒含量TCID₅₀测定，MDRV-CA、MPV-P1和GPV-D的TCID50分别 ≥10^-50/0.1ml、≥10^-45/0.1ml和≥10^-40/0.1ml以上时，可用于配制疫苗。

(5)疫苗配制，将MDRV-CA、MPV-P1和GPV-D按适当比例混合后加冻干 保护剂冷冻干燥而成。使每羽份疫苗中各种成份的病毒含量分别达MDRV CA 10³⁵TCID₅₀、MPV-P110³⁰TCID₅₀和GPV-D 10²⁵TCID₅₀。

本发明的疫苗应用于防治番鸭细小病毒病、番鸭呼肠孤病毒病和番鸭小鹅瘟 病，其免疫学指标测定如下：

1.无菌检验：按现行《中华人民共和国兽药典》附录进行，无菌生长。

2.安全性测定：用1日龄健康易感雏番鸭10羽，每羽腿部肌肉注射10倍 剂量三联疫苗，观察20天，接种鸭均未见饮食欲和精神异常，且生长发育良好， 全部存活。

3.免疫力测定：随机取一日龄易感雏番鸭20羽，腿肌接种1羽份三联活疫 苗，其中10羽免疫鸭于接种0天、7天、14天、21天、28天、60天、90天连 同不免疫对照鸭采血分离血清，供抗GPV-LPAI和抗MPV-LPAI抗体效价测定； 另10羽免疫鸭于接种后7天连同不免疫对照组同时攻击MDRV强毒，观察20 天，记录发病死亡情况。结果：①一日龄雏番鸭免疫三联苗后7天血清中全部测 定出能有效抵抗GPV和MPV强毒攻击的抗体水平，即抗GPV-LPAI和抗 MPV-LPAI抗体均为2^2.0以上，至免疫后28天达到高峰的抗体水平分别为2⁵⁶(抗 GPV-LPAI抗体)和2⁶²(抗MPV-LPAI抗体)，随后抗体水平仍维持在较高水平， 并一直持续至免疫后90天即97日龄，此时已达到或超过番鸭出栏日龄。②一日 龄雏番鸭免疫三联苗后7天连同不免疫对照组同时攻击MDRV强毒0.2ml/羽， 对照攻毒鸭的发病率80％(8/10)、死亡率30％(3/10)；而免疫攻毒鸭的发病 率10％(1/10)、死亡率0％；表明一日龄雏番鸭免疫三联疫苗后7天能有效抵抗 MDRV强毒的攻击。③三联疫苗的免疫力测定结果表明，疫苗免疫力良好，免 疫产生期7天，免疫持续期为90天以上。一次免疫即可保护雏番鸭安全渡过易 感期，达到1次免疫注射可同时预防番鸭呼肠孤病毒病(番鸭肝白点病)、番鸭 细小病毒病(番鸭三周病)和小鹅瘟病，不仅减少人力物力财力，也减少因多次 免疫注射导致的应激反应。

本发明的应用效果评价：在试验鸭场共免疫注射7000多羽份一日龄雏番鸭， 跟踪观察20d，未见免疫鸭出现不良反应；且免疫组番鸭未发生番鸭呼肠孤病毒 病、番鸭细小病毒病和小鹅瘟病，成活率达98％以上；而700羽的对照组番鸭均 不同程度发生番鸭肝白点病、三周病和小鹅瘟病，成活率仅62％。进一步证明本 发明的三联活疫苗安全、有效，可用于临床上预防番鸭呼肠孤病毒病(番鸭肝白 点病)、番鸭细小病毒病(番鸭三周病)和番鸭小鹅瘟病。