一种基于急性过敏反应的代谢组学分析方法

摘要

本发明公开了一种基于急性过敏反应的代谢组学分析方法。其主要是从系统生物学角度出发，应用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用（UPLC-QTof/MS）技术平台，建立急性过敏反应豚鼠血清代谢组学评价模型，为进一步研究药物急性过敏反应提供了依据。分析时用超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用技术检测正常豚鼠和经诱导产生急性过敏反应实验豚鼠的血清样本，经优化后的采集方法得到代谢组谱图，并建立适合于评价动物急性过敏反应的模式识别方法分析代谢组数据，为后续进一步筛选特征性生物标记物，开发新的动物急性过敏反应检测方法奠定了基础。

说明书

技术领域

本发明属于分析化学和生物化学技术领域，具体涉及一种基于超高效液相色谱-四级 杆飞行时间串联质谱联用的豚鼠血清代谢组学数据采集方法的优化及对所采集的代谢组 学数据进行适合于评价动物急性过敏反应的模式识别分析方法。

背景技术

过敏反应属于常见的不良反应，早在1902年药物过敏反应即引起专家们的重视，尤 其是药物引起的急性过敏反应问题严重威胁人类的生命安全。英国一项研究表明，50% 死于过敏性休克的患者因药物诱发，平均死亡时间为用药后5分钟。美国医院每年有55 万例严重药物过敏反应。我国ADR监测报告指出，中药注射剂诱发的急性过敏反应问题 明显增高，现已成为制约其临床应用的瓶颈。

尽管药品出产前均需按照新药注册管理办法和相关的临床前安全性评价指南进行致敏 性检测，然而，由于药物过敏反应的复杂性和影响因素的多样性，许多产品出厂检验中 过敏试验呈阴性，而在临床使用过程中却发生较多的过敏反应，甚至发生过敏性休克或 死亡现象。另一方面，对部分已在临床上引起过敏反应的药品按现行过敏反应检测方法 检验，却又经常得不出阳性结果。提示目前现行产品质量标准控制过程中所使用的过敏 试验检测方法存在着一定的缺陷。目前各国采用的现行药品过敏反应检查方法，主要包 括主动全身过敏试验和被动皮肤过敏试验。以主动全身过敏试验为例，该方法仅仅以观 察豚鼠的反应症状来判断产品是否具有致敏性，其观察指标单一、观察方法简单，灵敏 度不高和结果不准确。大量的药物安全性评价结果及临床药物所致过敏的报道证明，目 前这些过敏反应模型对于药物的致敏性检测并不敏感，对潜在的致敏原不能有效预测和 监控。因此建立高效、灵敏的致敏性评价方法，提高准确率，保证临床合理用药，是摆 在药物毒理学面前重大而急迫的课题。

作为后基因时代出现的又一新型组学技术，代谢组学在毒理学评价中有其独特的优 势。它利用高通量检测技术在代谢物的整体水平上检测机体在药物暴露后的各种生理生 化指标，这些指标几乎涵盖毒理作用发生的所有的环节，再结合传统的病理学终点，可 以对药物的毒性作用机制进行深入的了解。鉴于此，若结合代谢组学方法研究药物过 敏，以其高通量、全景式的定性、定量分析平台能建立一种灵敏、准确、与临床相关性 好的动物模型用于药物急性过敏反应的评价，将具有广泛的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服传统的急性过敏反应检测方法主观性强、灵敏度低等缺点，提 出一种基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用的急性过敏反应豚鼠血清代谢 组分析方法，具有客观、灵敏、可靠等特点。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述基于急性过敏反应的代谢组学分析方法，包括如下步骤：

（1）进行动物致敏实验并采集血清样本；

（2）将血清样本加入超高效液相色谱仪-四级杆飞行时间串联质谱仪进行检测，得到 代谢指纹图谱；

（3）采用MarkerLynx软件对代谢指纹图谱的原始色谱峰进行峰检测和峰匹配，提取 由代谢物碎片的保留时间、质量数和相应的峰强度/峰面积组成的数据矩阵；

（4）对数据矩阵按不同的血清采集时间（此处是指不同时间点采集的血清样本<致敏 前，第三次致敏后，第一次攻击前后，第二次攻击前后>）分别依次进行主成分分析(PCA)、 偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，绘制出血清样 本采集时间-代谢模式变化轨迹图。

其中，步骤（1）所述动物为豚鼠；

步骤（1）中动物致敏实验及血清样本采集的具体步骤为（动物致敏方案是在2010版 药典附录中“过敏反应检查法”的基础上对致敏剂量进行筛选后确定的方案；采血手段是 经预实验后确定的眼眶采血）：

将豚鼠随机分为空白对照组、急性过敏反应组；急性过敏反应组空腹注射牛血清白蛋 白致敏，连续致敏三次，每次间隔一日，所述牛血清白蛋白浓度为8—12mg/mL，优选为 10mg/mL，每只豚鼠每次注射0.8—1.2mL，优选为1.0mL；于首次致敏后第14天和第21 天趾静脉注射牛血清白蛋白进行激发，所述牛血清白蛋白浓度为8—12mg/mL，优选为 10mg/mL，每只豚鼠每次注射2.0mL；空白对照组注射与急性过敏反应组中牛血清白蛋白 同等体积的生理盐水；分别于致敏前、第三次致敏后、第一、二次攻击前后对豚鼠进行眼 眶采血，离心，取上层血清样本保存备用，所述第一次攻击指首次致敏后第14天趾静脉 注射牛血清蛋白进行激发，第二次攻击指首次致敏后第21天趾静脉注射牛血清白蛋白进 行激发；在进行步骤（2）的检测前，将血清样本与甲醇混合，甲醇与血清样本的体积比 为3—4.5:1，优选为4:1，静置、离心，转移上清液置样品瓶内，待测。

步骤（2）中超高效液相色谱条件为：色谱柱：Waters Acquity BEH（C182.1mm× 50mm，1.7μm）；柱温：40℃；进样量：3μL；流速：0.3ml/min；流动相：0.1%甲酸 水溶液-乙腈；梯度洗脱程序为：0～4min：B5%→30%；4～6min：B30%→40%；6～ 8min：B40%→40%；8～12min：B40%→60%；12～18min：B60%→95%；18～ 20min：B95%→95%；20～21min：B95%→5%；21～23min：B5%→5%，其中A表示甲 酸水溶液，B表示乙腈；

四级杆飞行时间串联质谱质谱条件为：电喷雾离子源采用正离子模式检测；毛细管电 压3.5kV，锥孔电压45V，离子源温度110℃，脱溶剂气温度330℃，锥孔气流量50L/h， 脱溶剂气流量600L/h、萃取锥孔4.0V；每0.2s采集1次谱图；数据采集范围：100-1000 m/z；以亮氨酸-脑啡肽溶液作为锁定质量，亮氨酸-脑啡肽溶液中[M+H]+=556.2771Da。

步骤（3）中MarkerLynx软件的参数设置如下：函数:1；起始时间:0.60；结束时 间:23.00；最小质量数:100.00；最大质量数:1000.00；质量数范围:0.05Da；不用相对保留 时间；5%峰高处峰宽:15.00seconds；峰与峰的基线噪音:50.00；不进行平滑处理；峰强度 阈值:10counts；质量窗口:0.05；保留时间窗口:0.20；噪音消除水平:6.00；采用同位素峰 数据。

步骤（4）中所述的应用MarkerLynx软件进行分析，包括PCA：是一种非监督的数据 分析方法，它采用线性投影将原来的多个变量空间转换成一组新的正交变量，用几个主要 的成分（PC）来描述数据的特征，这些成分是原始变量的线性组合，而且这些主成分之间 垂直相交保证了从高维向低维空间投影时，尽可能多的保留有用信息。PLS-DA：是一种有 监督的多维数据压缩的方法，将多维数据在压缩前先按照需要寻找的差异因素分组，这样 可以找到与用于分组的因素最相关的变量，而减少一些其他因素的影响。偏最小二乘法也 是一种线性空间变换的方法，但区别于主成分分析，PCA的主成分投影方向是偏差最大的 方向，而PLS是同时对样本数据矩阵X和相应变量Y同时进行分解，并力图建立它们之间 的回归关系。若将模式识别中的己知类别响应设为0或1，偏最小二乘也可用于模式识别， 称为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)；OPLS-DA可以滤除与研究对象无关的噪音，是对PLS-DA 进行修正的分析方法。OPLS-DA根据数据表Y（分组）的差异将数据表X（变量）的差异分 为两个部分，第一部分代表与Y相关的差异，第二部分代表与Y不相关（正交垂直）的差 异，OPLS-DA可以将这两部分差异进行区分。同时通过OPLS-DA得分图，可以直接从预测 主成分（t1）区分组间差异，提高模型的解析能力和有效性。

另外，所述超高效液相色谱仪为Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪；所述四级杆 飞行时间串联质谱质谱仪为Xevo G2 QTof四级杆飞行时间串联质谱仪。所用仪器为液质 联用，它以液相色谱作为分离系统，质谱为检测系统。样品在质谱部分和流动相分离，被 离子化后，经质谱的质量分析器将离子碎片按质量数分开，经检测器得到质谱图。

急性过敏反应评价标准如下：在致敏期间，每日观察动物的症状，激发后即刻至 30min，观察每只动物全身过敏反应情况。并根据全身致敏性评价标准分级。“-”：过敏反 应阴性（正常）；“+”：过敏反应弱阳性（躁动、竖毛、颤抖、搔鼻）；“++”：过敏反应阳 性（喷嚏、咳嗽、呼吸急促、排尿、排粪、流泪）；“+++”：过敏反应强阳性（呼吸困难、 哮鸣音、紫癜、步态不稳、跳跃、喘息、痉挛、旋转、潮式呼吸）；“++++”：过敏反应极 强阳性（死亡）。

同时也可通过检测血清/血浆的IgE和组胺水平来辅助评价，因为目前已公认急性过 敏反应不仅包括经典的速发型过敏反应/Ⅰ型过敏反应（即过敏原刺激机体淋巴细胞产生 lgE抗体，经循环系统与肥大细胞或嗜碱性粒细胞表面的IgE Fc受体（FcεRⅠ）高亲和 力结合，当相同过敏原再次进入致敏机体，与IgE结合后导致FcεRⅠ偶联而引发肥大细 胞或嗜碱性粒细胞脱颗粒释放过敏介质，引发局部或全身反应）同时还包括一类在临床症 状上与经典的Ⅰ型过敏反应相似，但由致敏原直接刺激肥大细胞/嗜碱性粒细胞或激活补 体系统致使过敏介质释放的非免疫介导的类过敏反应（anaphylactoid reaction）/伪变态反应 （pesudoallergic reaction）。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

（1）克服了传统的主动全身过敏试验和被动皮肤过敏试验主观性强、灵敏度低等缺 点，应用代谢组学技术，所得结果更为灵敏、可靠。

（2）与目前应用较为广泛的免疫化学试验和体外细胞试验相比，本发明的操作更为 简便，适应于大批量样本的研究。同时代谢组学非靶向的研究特点也为开发新的急性过敏 反应检测指标提供了有力的依据。

（3）国内首次将代谢组学技术应用于过敏反应研究，同时也为我国独创新剂型—中 药注射剂所引发的过敏反应问题提供新的研究方法和研究思路。这也是将新兴技术应用于 药品监管的一次创新性尝试。

本发明建立的基于超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱联用的急性过敏反应豚 鼠血清代谢组学评价模型，为后续进一步确证生物标记物，开发新型高效、灵敏的致敏检 测方法提供了理论和实验依据。这也是将代谢组学技术应用于研究药物致敏性问题的一次 创新性尝试。

附图说明

图1为典型的总离子流图（TIC）；

图2为基峰离子色谱图（BPI）；

图3为豚鼠血清在6个采样点的时间-代谢模式变化轨迹图；图中Day0表示采样点1， 致敏前；Day5表示采样点2，第三次致敏后；Day13.9表示采样点3，第一次攻击前；Day14.1 表示采样点4，第一次攻击前；Day20.9表示采样点5，第二次攻击前；Day21.1表示采样 点6，第二次攻击后。

具体实施方式

实施例1

基于急性过敏反应的代谢组学分析方法，包括如下步骤：

（1）将清洁级雄性豚鼠（250～350g）随机分为空白对照组、急性过敏反应组。急性 过敏反应组用牛血清白蛋白（BSA）作为阳性致敏剂，给予动物10mg/mL牛血清白蛋白， 1.0mL/只，腹腔注射，隔日一次，连续3次；于首次致敏后第14天（第一次攻击）和第 21天（第二次攻击）趾静脉注射（2.0ml/只）进行激发。空白组给予同等体积的生理盐水；

（2）分别于致敏前、第三次致敏后、第一、二次攻击前后30min对豚鼠进行眼眶采 血，室温静置10min，4℃，3000rpm离心10min，取上层血清样品于-80℃冰箱中保存备 用；

（3）将室温解冻后的血清样本与4倍体积的甲醇混合，涡旋震荡30s，4℃静置5min 后以13000rpm离心15min，转移200μL上清至样品瓶，进入超高效液相色谱仪-四级杆 飞行时间串联质谱仪进行检测，得到代谢指纹图谱（图1和图2）；其中，液相色谱条件为： 采用Waters Acquity UPLC超高效液相色谱仪（美国Waters公司）；色谱柱：Waters Acquity  BEH C18(2.1mm×50mm，1.7μm)；柱温：40℃；进样量：3μL；流速：0.3ml/min；流 动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0～4min：B5%→30%；4～6min： B30%→40%；6～8min：B40%→40%；8～12min：B40%→60%；12～18min：B60%→ 95%；18～20min：B95%→95%；20～21min：B95%→5%；21～23min：B5%→ 5%；）。质谱条件为：采用Xevo G2QTof四级杆飞行时间串联质谱仪（美国Waters公司）； 电喷雾离子源采用正离子模式（ESI+）检测；毛细管电压（Capillary voltage）3.5kV，锥孔 电压（Sampling cone）45V，离子源温度（Source temperature）110℃，脱溶剂气温度 （Desolvation temperature）330℃，锥孔气流量（Cone gas flow）50L/h，脱溶剂气流量 （Desolvation gas flow）600L/h、萃取锥孔（Extraction cone）4.0V；每0.2s采集1次谱图； 数据采集范围：100-1000m/z；为确保质量的准确性和重复性，应用亮氨酸-脑啡肽溶液 （Leucine enkephalin，[M+H]+=556.2771Da）作为锁定质量（Lockmass）。

（4）采用MarkerLynx软件对代谢指纹图谱中的原始数据（原始色谱峰）进行峰检测 和峰匹配，提取出由代谢物碎片的保留时间、质量数和相应的峰强度/峰面积组成的数据矩 阵，以便进行后续的多维统计分析。具体参数设置为：函数（Function）:1；起始时间（Initial  Retention Time）:0.60；结束时间（Final Retention Time）:23.00；最小质量数（Low  Mass）:100.00；最大质量数（High Mass）:1000.00；质量数范围（Mass Tolerance):0.05Da； 是否用相对保留时间（Use relative retention time）:No；5%峰高处峰宽（Peak Width at5% Height):15.00seconds；峰与峰的基线噪音（Peak-to-Peak Baseline Noise）:50.00；是否进行 平滑处理（Apply Smoothing）:No；峰强度阈值（Intensity threshold）:10counts；质量窗口 （Mass window）:0.05；保留时间窗口（Retention time window）:0.20；噪音消除水平（Noise  elimination level）:6.00；是否采用同位素峰数据（Deisotope data）:Yes；

（5）对数据矩阵按不同的血清采集时间分别依次进行主成分分析(PCA)、偏最小二乘 法判别分析(PLS-DA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)，绘制出血清样本采集时间 -代谢模式变化轨迹图（见图3），豚鼠在给药致敏后0-21天内的代谢轨迹变化趋势显示， 豚鼠机体的内源性代谢产物谱在致敏前表现出略微散布分布的特点，而在第三次腹腔注射 牛血清白蛋白后即迅速的表现为聚类，这表明牛血清白蛋白对于豚鼠机体具有强烈的调控 代谢作用。第三次致敏后，第一、二次攻击前后与致敏前均可很好的区分开来，后面三个 时间点的代谢谱变化幅度明显减小，提示，经第一次攻击后（首次致敏后第14天）豚鼠 致敏模型可能趋于稳定。