一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法

摘要

本发明公开了一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法，主要包括以下步骤：从田间青花菜胞质雄性不育系植株上取回外植体，将外植体切成3～5cm的小块，采用浓度为75%的无水乙醇在其表面灭菌30～60秒，再用体积分数为8%的次氯酸钠溶液消毒18～20分钟，用无菌水冲洗5～6次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25±2℃培养室中培养；培养20～25天时，增殖形成新的幼芽，分离新幼芽无菌转接到培养基中继续培养，重复转接培养5～10次后把组培苗转接到生根培养基中生根，经过驯化移栽到大田。该方法具有操作简便、繁殖效率高等优点。

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法。

背景技术

青花菜( Brassia oleracea L. var. varitalica Planch) 又名西兰花、绿菜花、嫩茎青花菜，为十字花科芸薹属甘蓝类蔬菜，富含多种维生素、矿物质和天然防癌抗癌物质，是营养价值很高的蔬菜。青花菜起源于地中海沿岸，国内种质资源匮乏，种子价格昂贵，国外优良种质又难以获得，这些因素制约着国内青花菜多类型优良品种选育工作的开展。优质、抗逆、抗病品种的培育一直是育种家关注的热点问题之一。而培育优良品种的首要关键是选育具备目标特性的青花菜种质资源。

利用雄性不育取代自交不亲和生产青花菜杂交种的趋势日渐明显。利用胞质雄性不育系配制杂交种，既能克服自交不亲和系人工蕾期授粉繁殖成本高、长期连续自交生活力衰退、杂交率受环境制约难以达到100%等缺陷，又比显性细胞核雄性不育系繁育亲本简单易行。同时这种不育系具有转育简单、不育性彻底，用其配制的杂交种，大田杂种纯度能保证达到100%。近年来，我单位在田间选育获得了一些胞质雄性不育系材料，但由于对其遗传背景不甚明了，尚未找到较好的保持系，而通过青花菜离体快速繁殖, 可实现对其保存和扩繁, 以满足育种和生产上的需要。

关于青花菜的组织培养、快繁的研究最早见于国外的Anderson（1977）和Johnson（1978）。而在国内，李曙轩等（1983）利用叶片、中肋等外植体的组培，在基本培养基MS内附加一定量的激素配比的条件下已取得了不错的效果；张丽丽等（2008）以青花菜带柄子叶为外植体，研究其高频离体再生体系，获得了较高的再生频率均高于80%。但采用青花菜花球作为外植体进行组培快繁的研究未见报道。

发明内容

解决的技术问题：本发明提供了一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法，实现对胞质雄性不育系材料的保存和扩繁，以满足育种和生产上的需要。

技术方案：本发明提供了一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法，主要包括以下步骤：从田间青花菜胞质雄性不育系植株上取回外植体，将外植体切成3～5cm的小块，采用浓度为75%的无水乙醇在其表面灭菌30～60秒，再用体积分数为8%的次氯酸钠溶液消毒18～20分钟，用无菌水冲洗5～6次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25±2℃培养室中培养；培养20～25天时，增殖形成新的幼芽，分离新幼芽无菌转接到培养基中继续培养，重复转接培养5～10次后把组培苗转接到生根培养基中生根，经过驯化、移栽到大田，从而实现了青花菜胞质雄性不育系材料的快繁及生产应用。

所述外植体为新长出的带柄幼嫩花球，切块后每块外植体包含至少一个芽点和完整花球。

所述增殖培养基为MS+2～3mg/L 6-BA+0.05～0.1mg/L NAA+20～30g/L蔗糖+1.0～1.3g/L琼脂，pH值为5.8～6.0，其中NAA为萘乙酸，6-BA为6-苄基腺嘌呤。

所述生根培养基为1/2 MS+0.1～0.15 mg/L IBA+0.1～0.15 mg/L NAA+20～30g/L蔗糖+1.0～1.3g/L琼脂，pH值为5.8～6.0，其中NAA为萘乙酸，IBA为吲哚丁酸。

所述MS培养基，以1L计，组成为：NH₄HO₃ 1650 mg，KNO₃ 1900 mg，CaCl₂·2H₂O 440 mg，KH₂PO₄ 170 mg，MgSO₄·7H₂O 370 mg，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂EDTA 37.3 mg，H₃BO₃ 6.2 mg，MnSO₄·H₂O 16.9 mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg，CuSO₄·5H₂O 0.025 mg，CoCl₂·6H₂O 0.025 mg，KI 0.83 mg，肌醇100 mg，甘氨酸2 mg，烟酸0.5 mg，维生素B1 0.1 mg，维生素B6 0.5 mg和余量的无菌水。

有益效果：（1）本发明提供的一种青花菜胞质雄性不育系快繁的方法，采用的是幼嫩带柄小花球作为外植体进行组培快繁，由于带柄小花球含有生长点，灭菌后在增殖培养基中培养易于生长形成新芽，经过多次转接后可以快速获得大量的组培苗，满足生产需要，具有操作简便、繁殖效率高等优点。（2）本发明获得的不定芽增殖系数为5～6，生根率85～90%，平均生根数7～9条，组培苗移栽成活率为94～96%。组培苗再生植株与种子实生苗在田间表现相比，没有明显差异。

具体实施方式

实施例1  

增殖培养基为：MS+2mg/L 6-BA +0.05mg/L NAA +20g/L蔗糖+1.0g/L琼脂，pH值为6.0；生根培养基为1/2 MS+0.1mg/L IBA+0.15 mg/L NAA+20g/L蔗糖+1.0g/L琼脂，pH值为6.0。

从田间取回正在生长的青花菜幼嫩带柄花球，在实验室超净工作台上用解剖刀切成3cm的小块，用浓度为75%的无水乙醇在其表面灭菌30秒，再用体积分数为8%的次氯酸钠溶液消毒18分钟，用无菌水冲洗5次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于23℃培养室中培养，培养20天时形成新芽，转接新芽到增殖培养基中继续培养，重复转接培养5次后把组培苗转接到生根培养基中生根，最后形成的健康带根幼苗经过驯化、移栽到田间。

本实施例获得的不定芽增殖系数为5，生根率85%，平均生根数7条，组培苗移栽成活率为94%，组培苗再生植株与种子实生苗在田间表现相比，没有明显差异。

实施例2  

增殖培养基为：MS+3mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA +25g/L蔗糖+1.15g/L琼脂，pH值为5.9；生根培养基为1/2 MS+0.12 mg/L IBA+0.12 mg/L NAA+25g/L蔗糖+1.15g/L琼脂，pH值为5.9。

从田间取回正在生长的青花菜幼嫩带柄花球，在实验室超净工作台上用解剖刀切成4cm的小块，用浓度为75%的无水乙醇在其表面灭菌45秒，再用体积分数为8%的次氯酸钠溶液消毒19分钟，用无菌水冲洗5次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25℃培养室中培养，培养25天时形成新芽，转接新芽到增殖培养基中继续培养，重复转接培养8次后把组培苗转接到生根培养基中生根，最后形成的健康带根幼苗移栽到田间。

本实施例获得的不定芽增殖系数为5.5，生根率87%，平均生根数8条，组培苗移栽成活率为95%，组培苗再生植株与种子实生苗在田间表现相比，没有明显差异。

实施例3  

增殖培养基为：MS+3mg/L 6-BA + 0.08mg/L NAA +30g/L蔗糖+1.3g/L琼脂，pH值为5.8；生根培养基为1/2 MS+0.15 mg/L IBA+0.15 mg/L NAA+30g/L蔗糖+1.3g/L琼脂，pH值为5.8。

从田间取回正在生长的青花菜幼嫩带柄花球，在实验室超净工作台上用解剖刀切成5cm的小块，用浓度为75%的无水乙醇在其表面灭菌60秒，再用体积分数为8%的次氯酸钠溶液消毒20分钟，用无菌水冲洗6次，然后将无菌外植体接种到增殖培养基上，置于25℃培养室中培养，培养25天时形成新芽，转接新芽到增殖培养基中继续培养，重复转接培养10次后把组培苗转接到生根培养基中生根，最后形成的健康带根幼苗移栽到田间。

本实施例获得的不定芽增殖系数为6，生根率90%，平均生根数9条，组培苗移栽成活率为96%，组培苗再生植株与种子实生苗在田间表现相比，没有明显差异。