一类以荧光素类似物为母体的荧光染料的合成和应用

摘要

本发明提供一类以荧光素为母体的荧光染料、其制备方法及应用，所述的以荧光素为母体的荧光染料，具有通式I的结构。该荧光染料可用于生物染色，同时将其中一个染料应用于半胱氨酸的体外和体内检测，同时还应用到活体检测等领域，这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有比较新颖的光谱特性，并将这类良好性质的荧光素衍生物的染料应用于荧光成像方面。

说明书

技术领域

本发明涉及一类以荧光素为母体的新型荧光染料，其制备方法及应用，以及利用该类荧光探针化合物在体外和体内检测生物巯基化合物，并将染料应用到细胞成像和活体实验中。 

背景技术

荧光染料作为功能性色素在科学技术的各个领域得到广泛应用，尤其在生命科学、临床医疗诊断、免疫分析检测等方面的研究在全世界备受瞩目。在众多的荧光染料中荧光素是一类被广泛应用的染料，这类染料具有大的摩尔消光系数、好的光稳定性、高的荧光量子产率等优点。 

荧光成像监测生物大分子在生命系统中最强大的技术之一，与在可见光区的吸收和发射的荧光传感器相比，近红外（NIR）范围内的染料在生命系统中的应用中是有利的生物成像试剂，由于近红外染料具有最小的光损伤，深部组织的渗透，和最小的背景的自发荧光。因此，发射红光和近红外区域的生色团近几年得到密切的关注。 

近日，被广泛使用的NIR荧光团探针的菁染料，主要是Cy5和Cy7。然而，据我们所知，菁染料有致命的缺点—特别差的耐光性能。因此，很多组竭尽他们所能，以开发新的近红外的荧光基团，他们主要基于Rhodamine B，BODIPY染料，目前已经有很多这两类荧光团的光谱可以延伸到近红外区域了，更重要的，这两类荧光团有特别好的光稳定性。例如，林伟英的研究课题组构建了长沙市近红外功能染料。Nagano的研究小组开发了系列2-Me TeR是可逆的近红外ROS荧光探针。他们设计并合成了一种新型的近红外的Si杂罗丹明荧光探针MMSiR检测次氯酸。同时，他们还开发出了一系列新的近红外波长激发的荧光染料，SiR-NIRs，这类探针是基于修饰后的Si杂罗丹明母体。与此同时，其他各组也发现了更多的新的近红外的BODIPY染料，但是，到现在为止，很少有近红外荧光素衍生物已构建的文献报道。 

荧光素染料具有良好的光化学特性，如高摩尔消光系数，较大的荧光量子产率，较好的光稳定性能。最近，荧光素衍生物与氯取代的2'，7'的位置已被广泛开发。值得注意的是，荧光素的羟基位置始终处于一种激活状态，可以很容易地进行修饰。羟基保护的荧光探针已广泛的作为有效平台建设的荧光转式传感器。许多多样化的目标检测物，包括过氧化氢，超氧阴离子自由基，半胱氨酸的基础上独特的羟基保护的过程中荧光素探针的报道。但是，这些已经报道过的探针的吸收和发射波长仍然分别约在480nm和520nm左右。据了解，短波长激发容易带来了巨大的生物样品损害，因此，在近红外范围内的吸收光谱和发射的荧光素类似物研发是一项非常可取的发展。在此，我们引入了新的战略设计一个近红外功能性荧光染料，这种染料是基于2'，7'-二氯荧光素（DCF）母体的，同时，基于D-π-A的机制。我们 预期的设计可以延长各种各样的近红外功能性染料为进一步有用的应用在生物学研究的发展战略。 

发明内容

本发明基于上述背景技术，开发一种新的荧光染料，该荧光染料具有以下优点：光稳定性好，发射波长在近“红色”区域的基于荧光素类似物为母体的一类新型荧光染料，同时本发明所述染料在生物应用方面具有一定的细胞膜通透性，长波长的特点使得光谱范围与生物样品的光谱范围有较大差异。 

在本发明的第一方面，本发明针对现有存在的荧光素染料的不足，在其基础上改进，提供了一类结构简单、长波长、且具有良好的细胞膜通透性的新化合物，其具有下列结构通式I： 

I 

通式I中： 

m为0、1、2或3； 

M选自H，K⁺，Na⁺，-R₅，-OR₁₀和-(CH₂)_n-O-R₁₀；R₁₀为C_1-18烷基，n为1-18的整数； 

R₀选自H、F、Cl、Br和I； 

R’选自H、乙酰基、丙烯酰基； 

R选自H、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉； 

X为C(CH₃)₂、O、S或Se； 

Y^-为负离子。 

具有上述结构通式I的荧光染料可用于生物染色，实施例中列举了，将其中一个染料应用于半胱氨酸的体外和体内检测，同时还应用到活体检测等领域的实验，显示出此类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定良好的细胞膜通透性。本发明的这类化合物同时还具有比较新颖的光谱特性，可应用于荧光成像等方面。 

本发明的另一方面目的在于提高所述的荧光染料的缀合物。 

再一方面的目的在于提高用于生物样品染色的组合物，包含上述荧光染料或其缀合物。 

另一方面：提供一种制备本发明所述的化合物的方法，所述方法包括以下步骤： 

（1）将荧光素母体化合物II’溶解在50%的氢氧化钠的水溶液中，在反应温度为10～165℃条件下反应10～24h，得到粘稠状物，然后将反应混合物加入到冰水中，用浓盐酸中和至中性，静置然后抽滤得到固体II； 

         II’                            II 

其中，M选自H，K⁺，Na⁺，-R₁₀，-OR₁₀和-(CH₂)_n-O-R₁₀；R₁₀为C_1-18烷基，n为1-18的整数； 

R₀选自H、F、Cl、Br和I； 

2）新蒸的化合物环酮III’滴加到0℃的浓硫酸中，然后将步骤（1）的固体II：环酮III’按摩尔比1:1～30分批加入到反应体系中，反应混合物体系在反应温度10～180℃的条件下加热10h～24h后，冷却至常温，倒入冰水中产生沉淀后过滤，得到固体III； 

III’                             III 

其中，m为0、1、2或3； 

（3）反应溶剂N,N’-二甲基甲酰胺和三氯氧磷化合物按照投料摩尔比1:1～30，在反应温度为0℃条件下反应20min～2h后，然后将式Ⅱ的化合物溶于反应溶剂N,N’-二甲基甲酰胺溶剂中，按照化合物III和三氯氧磷投料比1:1～30加入，在10-180℃条件下反应5-60小时，制备化合物IV； 

IV 

（4）化合物IV与式Rx的化合物按投料摩尔比1:1～50在10-180℃条件下在反应溶剂中反应10-50h，制备式I的化合物； 

所述Rx的化合物选自i、ii、iii、iv、v、vi、vii和viii； 

步骤（4）所述反应溶剂为为二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯、浓硫酸或其混合物。 

对于以上技术方案中，在一个优选的实施方式中，式I化合物与丙烯酰氯按投料摩尔比1:1-30，同时与Et₃N也按照1:1-1:30投料摩尔比在反应溶剂中溶解，在10～150℃条件下混合搅拌5～50小时，然后在室温条件下混合体系搅拌一夜，制备式I’的化合物；其中，反应溶剂为二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯、浓硫酸或其混合物。 

I’ 

本发明改进现有的荧光素光谱上的不足，设计并合成出长波长的荧光染料。该类长波长荧光染料具有光稳定性好的特点，这类化合物具有一定水平的水溶性，同时具有一定的细胞 膜通透性。 

附图说明

本发明附图8幅： 

图1是本发明的以荧光素为母体的荧光探针的结构通式I。 

图2a为化合物A₂对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图2b是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集红色波段640-680nm，图2c是图2a和图2b的叠加图，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus FV1000-IX81。激发光通道：635nm。 

图3a为化合物A₃对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图3b是化合物A₃对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集红色波段540-640nm，图3c是图3a和图3b的叠加图，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus FV1000-IX81。激发光通道：488nm。 

图4a为化合物A₃对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图4b是化合物MitoTracker Green FM对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集红色波段500-540nm；图4c是化合物A₃对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集红色波段540-640nm，图4d为图4a，4b和4c的叠加图，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus FV1000-IX81。激发光通道：488nm。 

图5a为化合物A₃对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图5b是化合物A₃对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图5c为图5a和5b的叠加图，图片收集红色波段540-640nm，图5g为图5b中g的放大图，图5h为图5b中h的放大图，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus FV1000-IX81。激发光通道：488nm。 

图6是实施例2中表征本发明的荧光探针化合物A₄，以浓度为1mM的A₁-DMSO溶液3μL加入到的3mLpH值为7.40的HEPES缓冲液中，然后在25℃下逐渐加入半胱氨酸（Cys）加入测试体系中测试其吸收和荧光光谱变化。图6a为加入探针A₄后再加入Cys的吸收光谱变化图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度，其中插图表示用肉眼直接观察到溶液的颜色变化，有红色变成紫色。图6b为加入探针A₄后再加入Cys的荧光光谱变化图，横坐标为波长(nm)，纵坐标为相对荧光强度，其中插图表示在荧光灯下直接用肉眼观察到的荧光变化图，溶液由无荧光直接变成红色荧光。仪器为紫外可见分光光度计，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP-6500。 

图7a为化合物A₄对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图7b是化合物A₄对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图片收集红色波段640-680nm，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus FV1000-IX81。激发光通道：635nm。 

图8为化合物A₄对活体染色的照片，其中图中A代表在这个区域皮下注射0微摩尔的化合物A₄，B代表在这个区域皮下注射10微摩尔的化合物A₄，C代表在这个区域皮下注射 20微摩尔的化合物A₄，D代表在这个区域皮下注射50微摩尔的化合物A₄，所用仪器为小动物活体成像仪，型号：NightOWL II LB983。激发光：630nm。 

具体实施方式

除另有说明外，本文中使用的术语具有以下含义。 

本文中使用的术语“烷基”包括直链烷基和支链烷基，例如，“C_1-6烷基”包括C_1-4烷基、C_1-3烷基、甲基、乙基、正丙基、异丙基和叔丁基。类似的规则也适用于本说明书中使用的其它基团。 

本文中使用的术语“卤素”包括氟、氯、溴和碘。 

本文中使用Y^-表示负离子，其可为任何合适的负离子，包括但不限于无机负离子或有机负离子，例如优选Y^-为卤素离子、ClO₄^-、PF₆^-、BF₄^-、CH₃COO^-或OTs^-；再更优选Y^-选自卤素离子、ClO₄^-、PF₆^-、BF₄^-、CH₃COO^-；再更优选Y^-选自卤素离子、ClO₄^-；最优选Y^-选自卤素溴离子。 

本文中所述的m为0、1、2或3；m优选1。 

R选自H、R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉，R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈和R₉分别为醛基、C₇H₆NO基、C₉H₆NS基、C₁₁H₇N₂O基、C₁₀H₉NXY基、C₉H₈O基、C₄HN₂基、C₆H₆NO₂基、C₄H₂NO₂基，其中X为C(CH₃)₂、O、S或Se；Y^-为负离子。 

在本发明的通式I化合物中，优选X为C(CH₃)₂、O或S；更优选X为C(CH₃)₂或S；最优选X为S。 

在本发明的通式I化合物中，R₀选自H或卤素；优选R₀选自H或F、Cl、Br；更优选R₀选自H或F、Cl；再优选R₀选自H或Cl；最优选R₀选自Cl。 

M选自H，K⁺，Na⁺，-R₁₀，-OR₁₀和-(CH₂)_n-O-R₁₀；优选M选自H、-R₁₀，-OR₁₀和-(CH₂)_n-O-R₁₀；再更优选M选自H或C_1-18烷基；最优选M为H。其中所述的R₁₀为C_1-18烷基；优选R₁₀为C_1-6烷基；所述的n为整数，优选n为1-18的整数。 

本发明另一方面提供所述以荧光素为母体的新型长波长的荧光染料的制备方法，即：先分别制备中间体单醛，然后将中间体中与i、ii、iii、iv、v、vi、vii和viii在有机碱（例如哌啶）的作用下反应得到所述化合物，具体合成方案如下所述。 

（1）将荧光素母体化合物II’溶解在50%的氢氧化钠的水溶液中，在反应温度为10～165℃条件下反应10～24h，得到粘稠状物，然后将反应混合物加入到冰水中，用浓盐酸中和至中性，静置然后抽滤得到固体II； 

          II’                            II 

反应温度为50-160℃，反应时间为4-20小时； 

在一个优选的实施方式中，反应温度为70-140℃，反应时间为3～15小时； 

在一个更优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～10小时； 

在最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～5小时。 

（2）新蒸的化合物环酮III’滴加到0℃的浓硫酸中，然后将步骤（1）的固体II：环酮III’按摩尔比1:1～30分批加入到反应体系中，反应混合物体系在反应温度10～180℃的条件下加热10h～24h后，冷却至常温，倒入冰水中产生沉淀后过滤，得到固体III； 

III’                              III 

其中，m为0、1、2或3； 

反应温度为50-160℃，反应时间为4-20小时，式II化合物与化合物环酮III’的投料摩尔比为1:1～20； 

在一个优选的实施方式中，反应温度为70-140℃，反应时间为3～15小时，II化合物与化合物环酮III’的投料摩尔比为1:3～15； 

在一个更优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～10小时，II化合物与化合物环酮III’的投料摩尔比为1:3～10； 

在最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～5小时，II化合物与化合物环酮III’的投料摩尔比为1:3～5。 

（3）反应溶剂N,N’-二甲基甲酰胺和三氯氧磷化合物按照投料摩尔比1:1～30，在反应温度为0℃条件下反应20min～2h后，然后将式Ⅱ的化合物溶于反应溶剂N,N’-二甲基甲酰胺溶剂中，按照化合物III和三氯氧磷投料比1:1～30加入，在10-180℃条件下反应5-60小时，制备化合物IV； 

IV 

反应温度为50-160℃，反应时间为4-48小时，式III化合物与POCl₃化合物的投料摩尔比为1:1～20，式III化合物与DMF化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

在一个优选的实施方式中，反应温度为70-140℃，反应时间为3～30小时式III与POCl₃的反应摩尔比为1:1～15,式III化合物与DMF化合物的投料摩尔比为1:3～15； 

在一个更优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，式III与POCl₃的反应摩尔比为1:2～10,式III化合物与DMF化合物的投料摩尔比为1:3～10； 

在最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～10小时，式III与POCl₃的反应摩尔比为1:3～10,式III化合物与DMF化合物的投料摩尔比为1:3～5； 

3)将步骤2)中得到的单醛IV与式i,ii,iii,iv、v、vi、vii和viii的化合物缩合反应得到通式I： 

化合物IV与式Rx的化合物按投料摩尔比1:1～50在10-180℃条件下在反应溶剂中反应10-50h，制备式I的化合物； 

4)将步骤2)中得到的单醛IV与式i的化合物反应得到式V： 

V 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，式IV化合物与邻氨基苯酚化合物的投料摩尔比为1:1～30； 

优选的实施方式中，反应温度为60～160℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，IV与i的反应摩尔比为1:1～20； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自乙醇、甲醇、乙腈、乙酸乙酯或其混合物，IV与i的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为80～90℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自甲醇，IV与i的反应摩尔比为1:3～5； 

5）将步骤2)中得到的单醛IV与式ii的化合物缩合反应得到式VI： 

VI 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，式IV化合物与ii化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为2～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，IV与ii的反应摩尔比为1:1～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为3～24小时，反应溶剂选 自二氯甲烷、乙醇或其混合物，IV与ii的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为2～12小时，反应溶剂选自乙醇，IV与ii的反应摩尔比为1:3～5； 

6)将步骤2)中得到的单醛IV与化合物III缩合反应得到式VII： 

VII 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，式IV化合物与iii化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，IV与iii的反应摩尔比为1:2～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇或其混合物，IV与iii的反应摩尔比为1:3～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自乙醇，IV与iii的反应摩尔比为1:4～5； 

7)将步骤2)中得到的单醛中间体IV与化合物IV缩合反应得到式VIII： 

VIII 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，式IV化合物与iv化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯或其混合物，IV与iv的反应摩尔比为1:1～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇或其混合物，IV与iv的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自乙醇，IV与iv的反应摩尔比为1:3～5； 

8)将步骤2)中得到的单醛IV与式v的化合物缩合反应得到式IX： 

IX 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯、氢氧化钠水溶液或其混合物，式IV化合物与式v化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙酸乙酯、氢氧化钠水溶液或其混合物，IV与v的反应摩尔比为1:1～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、氢氧化钠水溶液或其混合物，IV与v的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自氢氧化钠水溶液，IV与v的反应摩尔比为1:3～5； 

9)将步骤2)中得到的单醛中间体IV与式vi的化合物缩合反应得到式X： 

X 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙 醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻～二氯苯或其混合物，式IV化合物与式vi化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙腈、乙酸乙酯或其混合物，IV与vi的反应摩尔比为1:1～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自乙醇、乙腈或其混合物，IV与vi的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自乙腈溶液，IV与vi的反应摩尔比为1:3～5； 

10)将步骤2)中得到的单醛IV与式vii的化合物缩合反应得到式XI： 

XI 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯、氢氧化钠水溶液或其混合物，式IV化合物与式vii化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙腈、乙酸乙酯或其混合物，IV与vii的反应摩尔比为1:1～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙腈或其混合物，IV与vii的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自乙腈溶液，IV与vii的反应摩尔比为1:3～5； 

11)将步骤2)中得到的单醛IV与式viii的化合物缩合反应得到式XII： 

XI 

反应温度为50～180℃，反应时间为4～48小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙 醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，式IV化合物与式viii化合物的投料摩尔比为1:1～20； 

优选的实施方式中，反应温度为70～140℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙腈、乙酸乙酯或其混合物，IV与viii的反应摩尔比为1:1～15； 

进一步优选的实施方式中，反应温度为80～120℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自二氯甲烷、乙醇、乙腈或其混合物，IV与viii的反应摩尔比为1:2～10； 

最优选的实施方式中，反应温度为90～100℃，反应时间为1～12小时，反应溶剂选自乙腈溶液，IV与viii的反应摩尔比为1:3～5； 

12）将步骤4)-11）中得到的I化合物与丙烯酰氯按投料摩尔比1:1-30，同时与Et₃N也按照1:1-1:30投料摩尔比在反应溶剂中溶解，在10～150℃条件下混合搅拌5～50小时，然后在室温条件下混合体系搅拌一夜，制备式I’的化合物； 

I’ 

反应温度为5-100℃，反应时间为4-48小时，反应溶剂为选自：DMF、二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、甲苯、二甲苯、邻-二氯苯或其混合物，I化合物与丙烯酰氯的投料摩尔比为1:1-1:20，式I与Et₃N按照投料摩尔比为1:1～20； 

在一个优选的实施方式中，反应温度为4-80℃，反应时间为3～36小时，反应溶剂为选自：二氯甲烷、氯仿、乙醇、乙腈、乙酸乙酯或其混合物，I化合物与丙烯酰氯的投料摩尔比为1:1～15,式I与Et₃N按照投料摩尔比为1:3～15； 

在一个更优选的实施方式中，反应温度为3～60℃，反应时间为2～24小时，反应溶剂选自：二氯甲烷、氯仿或其混合物，I化合物与丙烯酰氯的投料摩尔比为1:2～10,式I与Et₃N按照投料摩尔比为1:3～10； 

在最优选的实施方式中，反应温度为2～40℃，反应时间为1～10小时，反应溶剂选自二氯甲烷，I化合物与丙烯酰氯的投料摩尔比为1:3～10,式I与Et₃N按照投料摩尔比为1:3～5； 

上述对本发明的以各种取代基的荧光素为母体的荧光探针制备方法的描述中，各个取代基（R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇、R₈、R₉和R₁₀）的定义及优选，均与本发明中对化合物的描述中的定义及优选相同。 

对本发明采用上述方法合成的新型类荧光素荧光探针化合物，采用核磁共振谱图或质谱来确认其结构，并且辅以碳谱、高分辨质谱测试来辅助确认其结构。 

本发明所述的以荧光素为母体的荧光探针具备以下特点： 

所述化合物部分分子的荧光发射波长是大于600nm处有发射峰，可用于荧光探针和细胞成像和活体成像，避免生物自身的荧光背景干扰； 

所述化合物具有优异的光稳定性，应用于生物样品成像时具有低的生物光漂白性； 

所述新化合物产品毒副性小，原料易得，结构简单，易于制备，易产业化，通过2步反应即可。 

本发明的这些特征和优点以及其他特征和优点在参考以下附图和本发明的具体实施方式之后将变得显而易见。 

鉴于此，本发明所述的类荧光素衍生物的荧光探针化合物可用于作为生物巯基化合物检测的母体。所述组合物中应当包含有效量的本发明所提供的类荧光素衍生物荧光探针化合物之一。另外，还可以包含生物样品染色所需要的其它组分，例如溶剂、pH调节剂等。这些组分都是本行业内已知的。 

本发明化合物可以用于生物样品的染色，所述化合物为荧光缀合物。本文中使用的“缀合物”是指本发明荧光素类似物为母体的染料通过双键与其它分子连接而形成的化合物。可与本发明荧光染料缀合的分子可为与细胞或细胞成分特异性结合的分子，包括但不限于抗体、抗原、受体、配体、酶、底物、辅酶等。通常，测试样品与荧光缀合物恒温孵育一段时间，使得该荧光缀合物与测试样品中的某些细胞或细胞成分特异性结合，该荧光缀合物与细胞或细胞成分的结合也可被称为染色。该染色步骤可依次进行多次，或用多种缀合物同时进行多种染色。染色完成后，样品在荧光激活细胞分选仪中进行分析，其中激发光源激发缀合物中的本发明荧光染料，而测定装置测定由激发的荧光染料产生的发射光。 

本发明还提供使用上述本发明的类荧光素衍生物的荧光探针化合物标记细胞样品的方法，该方法包括使所述化合物与生物样品接触的步骤。本文中使用的术语“接触”可包括在溶液中接触。 

本发明上文所述的组合物可以以水溶液形式存在，或者可以以临用前用水配制为溶液的其它合适形式存在。 

实施例1 

制备荧光染料化合物A₁

（1）中间体化合物1的合成 

将DCF(6.30g，15.75mmol)溶解在含有60mL，50%氢氧化钠水溶液的圆底烧瓶中。搅 拌这种混合物，加热到165℃，继续搅拌1h，混合物变成粘稠状。然后混合物加入到400mL冰水中，用100mL浓盐酸中和至酸性体系，呈现出浑浊状态，静置2小时后，然后用布氏漏斗过滤，用水洗涤沉淀3次。抽干后在红外线灯下烘干，得到红色的中间体化合物1固体(8.10g)。 

（2）中间体化合物2的合成 

新蒸的环己酮(6.6mL,63.7mmol)滴加到浓硫酸(7.0mL)，然后冷却到0℃。然后，中间体化合物1(32mmol)分批加入到体系中，反应混合物体系在90℃的条件下加热1.5h，冷却下来，倒到冰水中(300g)，产生沉淀过滤掉，用冷水洗(100mL)获得中间体化合物2。中间体化合物2不做进一步纯化从而作为下一步原料。 

（3）染料化合物A₁的合成 

将POC1₃(10.0mL，0.107mol)通过分液漏斗滴加入搅拌的DMF(25mL)，0℃条件下超过35分钟。将化合物2(4.735g，0.0134mol)溶解在DMF(1mL)中，然后将溶解好的物质缓慢的滴加到反应的混合物中，然后在90℃条件下反应3h。然后将混合物倒到冰水中，产生的沉淀物被过滤掉，用冷水洗(100mL)。然后得到橙色固体A₁(1.95g)，橙色固体不用进行纯化直接进行下一步的反应。 

实施例2 

制备荧光染料化合物A₂： 

（1）染料化合物A₁的合成 

按照实施例1的方法制备染料化合物A₁。得到橙色固体A₁(1.95g)，不做进一步纯化从而作为下一步原料。 

（2）染料化合物A₂的合成 

在氮气氛围下，将A₁(100mg，0.41mmol)和丙二腈（即vi）(40mg，0.61mmol)溶于乙腈(45mL中，这种混合物在氮气85℃条件下回流4h。反应混合体系降温到室温。然后是在真空条件下蒸掉溶剂，通过柱色谱法纯化后在硅胶(洗脱剂用二氯甲烷:乙酸乙酯=40/3，v/v)得到一个深紫色固体产品A₂(0.0793g，0.185mmol，产量45%)，R_f=0.40，(5%的CH₃OH/二氯甲烷)。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.03(d,J=6.9Hz,1H),8.00(d,J=11.4Hz,1H),7.67–7.42(m,2H),7.10(dd,J=7.3,1.4Hz,1H),6.80(s,1H),6.67(s,1H),2.79(t,J=6.1Hz,2H),2.44–2.15(m,2H),1.80–1.58(m,2H).¹³C NMR(101MHz,DMSO)δ164.31,156.80,152.71,151.73,142.39,138.45,134.02,132.91,132.61,130.90,125.27,123.45,122.69,121.10,119.29,113.42,107.26,61.01,33.84,30.75,28.74,25.54,24.40,21.63.MS(ESI+Tof)m/z Found429.0M～1,calculated430.072for C₂₄H₁₅ClN₂O₄^～。 

实施例3 

制备荧光染料化合物A₃： 

（1）染料化合物A₁的合成 

按照实施例1的方法制备染料化合物A₁。得到橙色固体A₁(1.95g)，不做进一步纯化从而作为下一步原料。 

（2）染料化合物A₃的合成 

在氮气氛围下，将A₁(766mg，2.0mmol)和2-氰基乙酸（即vii）(813mg，7.2mmol)溶于乙醇(45mL)，然后再加入0.2mL哌啶(3.2mmol)和0.4mL醋酸溶液此反应体系中，这种混合物在氮气85℃条件下回流10h。反应混合体系降温到室温。然后是在真空条件下蒸掉溶剂， 通过柱色谱法纯化后在硅胶(洗脱剂用二氯甲烷/甲醇=200/3,v/v)得到深红色固体A₃(150mg，0.33mmol，产率为20%)，Rf=0.30，(5%的CH₃OH/二氯甲烷)。¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.68(s,1H),8.68(s,1H),8.19(d,J=7.8Hz,1H),7.74(t,J=7.0Hz,1H),7.64(t,J=7.2Hz,1H),7.24(d,J=7.4Hz,1H),6.86(s,1H),6.50(s,1H),4.31(q,J=7.1Hz,4H),2.94–2.82(m,4H),2.48–2.12(m,4H),1.72(s,6H),1.37(t,J=7.1Hz,6H)。 

实施例4 

制备探针化合物A₄

（1）染料化合物A₂的合成 

按照实施例2的方法制备染料化合物A₂。得到深紫色固体产品A₂(0.0793g，0.185mmol，产量45%)，R_f=0.40，(5%的CH₃OH/二氯甲烷)。 

（3）染料化合物A₄的合成 

染料化合物A₂(18.6mg，0.043mmol)溶解在20mL无水CH₂Cl₂中，丙烯酰氯(4eq，14μL)和Et₃N(4eq，24μL)在0℃下滴加入该体系中。在这个温度下搅拌90min，在室温条件下混合体系搅拌一夜。减压蒸馏掉溶剂，产品用柱色谱法(洗脱剂用二氯甲烷:乙酸乙酯=200/5，v/v)作为洗脱液得到最终产品5.0mg(0.01035mmol，产率为24%)。Rf=0.30，(5%的CH₃OH/二氯甲烷),¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.23(d,J=1.0Hz,1H),8.21(s,1H),7.76(td,J=7.5,1.3Hz,1H),7.66(td,J=7.7,1.3Hz,1H),7.42(s,1H),7.28(dd,J=7.6,1.0Hz,1H),6.68(s,1H),6.64(dd,J=17.3,1.2Hz,1H),6.40(dd,J=17.3,10.5Hz,1H),6.16(dd,J=10.5,1.2Hz,1H),2.83(t,J=6.1Hz,2H),2.39–2.12(m,2H),1.74(d,J=3.1Hz,2H).¹³C NMR(101MHz,MeOD)δ168.29,167.14,157.59,150.91,150.80,148.17,141.44,135.09,133.28,131.31,130.64,130.03, 129.53,126.12,125.83,122.49,122.10,116.97,115.49,112.19,111.32,71.33,56.84,26.88,24.45,19.91,19.53,17.63.MS(ESI+Tof)m/z Found483.0M～1,calculated484.04for C₂₇H₁₇C_lN₂O₅^～。 

实施例5 

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₂对活细胞MCF-7的染色：将化合物A₂（40μL，A₂的DMSO母液浓度为1mM）加到2mL的MCF-7细胞的培养液中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图2a为化合物A₂对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，图2b是化合物A₂对活细胞MCF-7染色的红色通道荧光显微照片，图2c是图2a和图2b的叠加图，如图可观察到化合物A₂对MCF-7细胞染色，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。 

实施例6 

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₃对活细胞MCF-7的染色：将化合物A₃（40μL，A₃的DMSO母液浓度为1mM）加到2mL的MCF-7细胞的培养液中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图3a为化合物A₃对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，图3b是化合物A₃对活细胞MCF～7染色的红色通道荧光显微照片，图3c是图3a和图3b的叠加图，如图可观察到化合物A₃对MCF-7细胞染色，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。 

实施例7 

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₃和Mitotracker Green FM对活细胞MCF-7的复染实验：将化合物A₃（40μL，A₃的DMSO母液浓度为1mM）加到2mL的MCF-7细胞的培养液中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，再加入Mitotracker Green FM，浓度为200nmol，在细胞培养箱中孵育30min，然后用PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图4a为化合物A₃对活细胞MCF-7染色的白场显微照片，图4b是化合物Mitotracker Green FM对活细胞MCF-7染色的绿色通道荧光显微照片，图4c是化合物A₃对活细胞MCF-7染色的红色通道荧光显微照片，图4d为图3a、图3b和图3c的叠加图，如图可观察到化合物A₃对MCF～7细胞染色，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。 

实施例8 

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₃对活细胞MCF-7的染色：将化合物A₃（40μL， A₃的DMSO母液浓度为1mM）加到2mL的MCF-7细胞的培养液中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞不同损伤的形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图5a为化合物A₃对活细胞MCF-7(人乳癌细胞)染色的白场显微照片，图5b是化合物A₃对活细胞MCF-7染色的荧光显微照片,图5c为图5a和5b的叠加图，图片收集红色波段540-640nm；图5g为图5b中g的放大图，图5h为图5b中h的放大图，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus FV1000-IX81。激发光通道：488nm。 

实施例9 

探针化合物A₄对半胱氨酸的特异性检测实验 

化合物A₄与半胱氨酸结合吸收和荧光发射光谱的测定：配置浓度为1mM的化合物A₄的DMSO(二甲基亚砜)溶液，取3μL，再加入pH7.36、20mM的HEPES缓冲液/DMSO稀释至3mL，置于比色皿中，测定其吸收光谱和荧光强度变化。配置一定浓度的半胱氨酸的水溶液，标定其浓度为10mg/mL。另分别取浓度为1mM的化合物A₄的DMSO(二甲基亚砜)溶液3μL于比色皿中，再分别向其中加入浓度为10mg/mL的牛血清蛋白溶液，最后加pH7.36、20mM的HEPES缓冲液/DMSO稀释至3mL，测定其不同浓度下的吸收光谱和荧光强度。相对荧光强度以线性关系比率增加，图6a为加入探针A₄后再加入半胱氨酸的吸收光谱变化图，图6a插图为加入探针A₄后再加入半胱氨酸的肉眼能够观察到的图，图6b为加入探针A₄后再加入半胱氨酸的荧光光谱图，图6b插图为加入探针A₄后再加入半胱氨酸的肉眼能够观察到的荧光图，型号：Hp8453；荧光分光光度计，型号：FP～6500。 

实施例10 

共聚焦激光扫描显微镜下观察化合物A₄对活细胞MCF～7的染色：将化合物A₄（20μL，A₄的DMSO母液浓度为1mM）加到2mL的MCF～7细胞的培养液中，在37℃、5%CO₂的细胞培养箱中孵育120min。然后，PBS震荡漂洗5min×3，再加入细胞培养基，共聚焦激光扫描显微镜(Olympus)观察细胞形态。选取代表性区域，488nm通道激发，用油镜(100×)观察，重复三次。图7a为化合物A₄对活细胞MCF～7染色的白场显微照片，图7b是化合物A₄对活细胞MCF～7染色的红色通道荧光显微照片，如图可观察到化合物A₄对MCF～7细胞染色，能够在活细胞体内检测半胱氨酸，所用仪器为共聚焦激光扫描显微镜，型号：Olympus。激发光通道：488nm。 

实施例11 

小动物活体成像仪器下观察化合物A₄对活体染色：加配有不同浓度的化合物A₄（0μM、10μM、20μM、50μM）加入0.1mL的HEPES缓冲液中，然后将这种不同浓度的缓冲液注入 到裸鼠腹部上皮不同区域孵育10min。然后，用NightOWL II LB983活体成像系统观察小鼠腹部不同区域的荧光。图8为化合物A₄对小鼠活体成像的照片。如图可观察到化合物A₄可以对活体染色，能够在活体内检测半胱氨酸，所用仪器为小动物活体成像仪，型号：NightOWL II LB983。 

以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。作为荧光染料是本发明新化合物的一种用途，不能认定本发明的化合物仅用于荧光染料，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在基于本发明化合物用作荧光染料的相同作用机理的考虑下，还可以做出若干简单推理，得出本发明的化合物的其他应用用途，都应当视为属于本发明的保护范围。