一种利用双向电泳技术鉴定大麦品种的方法

摘要

本发明提供一种鉴定大麦品种的方法，将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸提，再通过一系列步骤提纯，得到大麦的水溶蛋白，将不同品种大麦蛋白用双向电泳技术进行电泳，得到清晰直观的蛋白图谱，通过对比分析寻找到的不同品种的差异性蛋白，可以有效鉴定大麦的品种。

说明书

技术领域

本发明具体涉及一种鉴定大麦品种的方法。

背景技术

大麦是酿造啤酒的重要原料，大麦品种不同会对麦芽制造及啤酒品质产生 重要影响。造成大麦品种差异的根本原因在于遗传基因，所以，不同品种的大 麦在蛋白质水平也存在普遍差异。对不同品种的大麦，制麦工艺及成品啤酒品 质存在很大差异。所以，用于啤酒生产的大麦品种纯度对制麦和啤酒酿造影响 很大，因此麦芽和啤酒制造企业非常迫切找到一种准确、快捷的方法，对大麦 品种进行检测和鉴定。

以往鉴定大麦品种除了依靠外观经验之外，主要方法是A-PAGE电泳法和 基于DNA技术的SSR标记。A-PAGE电泳法是利用大麦醇溶蛋白的电泳条带作 为品种鉴定依据，具有操作简便、经济、快捷的特点。但由于条带比较密集， 在差异性小的情况下，容易造成一定鉴定的困难。SSR标记利用DNA技术进行 鉴定，虽然结果准确，但对样品DNA提取操作技术和设备要求比较严格，鉴定 成本较高，所以在企业应用存在一定困难。

随着蛋白质组学和蛋白分析技术的发展，运用水溶蛋白的双向电泳技术进 行的种质鉴定成为可能。本研究利用蛋白质双向电泳技术结合应用软件或放大 工具对纯种大麦水溶蛋白的电泳图谱进行分析，水溶蛋白的种类可以检测到成 百上千种。通过品种间的双向电泳蛋白图谱比较，可以找到不同品种大麦的差 异性蛋白，对大麦品种进行准确鉴定。本方法具有准确、快捷、经济的优点， 并且操作相对简单，容易被麦芽制造和啤酒企业接受。

发明内容

本发明提供一种鉴定大麦品种的方法，将纯种大麦去皮粉碎后加缓冲液浸 提，再通过一系列步骤提纯，得到大麦的水溶蛋白，将不同品种大麦蛋白用双 向电泳技术进行电泳，得到清晰直观的蛋白图谱，通过对比分析寻找到的不同 品种的差异性蛋白，可以有效鉴定大麦的品种。

具体步骤如下：

第一步、蛋白提取：大麦经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL 提取液室温提取2h，并漩涡震荡3~5次，10000g离心10min，取上清液加入等 体积pH8.8Tris平衡酚，室温提取30min，10000g离心10min，酚相加入4倍体 积清洗液A，-80℃提取3h，10000g离心10min；离心得到的蛋白分别用清洗液 A和清洗液B各洗涤、离心3次后，冷冻干燥；将得到全蛋白样品干粉加入100μL 裂解液，室温漩涡振荡裂解1h，4℃裂解过夜，13000ppm4℃离心10min，取 5μL上清液以考马斯亮蓝法（由附图1的牛血清标准曲线）测蛋白含量，按上样 量分装，准备电泳。室温漩涡振荡裂解过程中，超声4次，每次10-20s，超声 功率22W

第二步、双向电泳：取蛋白上清加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条， 上样量为110μg；自制胶条混匀过程不能产生气泡，等点聚焦过程中电压线性增 加每10min200V。

电泳条件：倒入电泳缓冲液，接通电源，室温下200V恒压电泳30min， 500V恒压电泳30min，1350V恒压电泳4h，进行等电聚焦。

等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min， 转移至12%的分离胶上，20mA恒流垂直电泳。垂直电泳不使用浓缩胶。

第三步、染色及分析：电泳结束后将凝胶置于固定液中固定1~2h，考马斯 亮蓝法进行染色，利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件完成图像的 分析。

以上所述配方中，提取液所用试剂均为优级纯，其余试剂均为分析纯，所 用水为双蒸水或超纯水，其中：

提取液：0.1M/L Tris-HCl pH8.8，50mM/L二巯基苏糖醇，20mM/L乙二胺 四乙酸，1mM/L苯甲基磺酰氟，1μM/L胃蛋白酶抑制剂，和10mM/L亮肽素， 余量为水；

清洗液A：100mM/L醋酸铵、10mM/L二巯基苏糖醇的甲醇溶液；

清洗液B：10mM/L二巯基苏糖醇的90%乙醇溶液；

裂解液：7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺 酸内盐，1%(w/v)二巯基苏糖醇，0.5%(v/v)载体两性电解质pH310，2%(v/v) 载体两性电解质pH4~6，10mM/L苯甲基磺酰氟，余量为水；

样品缓冲液：7M/L尿素，2M/L硫脲，4%(w/v)3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基] 丙磺酸内盐，1%(w/v)二巯基苏糖醇，0.5%(v/v)载体两性电解质pH3~10，2%(v/v) 载体两性电解质pH4~6，10mM/L苯甲基磺酰氟，10mg/L溴酚蓝，余量为水；

自制胶条配方：0.6g尿素、540μL双蒸水、30%丙烯酰胺溶液200μL、pH4~6 载体两性电解质24μL、pH310载体两性电解质溶液4.8μL，轻缓混匀后加入5μL 10%过硫酸胺和4μL四甲基乙二胺，轻轻混匀。快速吸取上述混合液，从直径1 mm、长11cm玻璃管的一端缓慢均匀灌入约7cm，室温聚合1h；

电泳缓冲液中，阴极电泳缓冲液：20mM/L氢氧化钠溶液150mL，阳极电 泳缓冲液：10mM/L磷酸溶液200mL；

平衡缓冲液：0.05M/L Tris-HCl(pH8.8)、30%(W/V)甘油、2.3%(W/V)SDS、 6mM/L尿素，余量为水；

分离胶：3.3mL双蒸水、4.0mL30%丙烯酰胺、2.5mL1.5M/L Tris-HCl、0.1 mL10%SDS、0.1mL10%过硫酸铵、0.004mL四甲基乙二胺，余量为水；

固定液：10%乙酸，40%乙醇，余量为水；

染色液：0.12%考马斯亮蓝G-250，10%硫酸铵，10%磷酸，20%甲醇，余量 为水。

本发明应用双向电泳技术结合分析软件通过比对不同品种的双向电泳图 谱，找到不同品种大麦的差异性蛋白点，从而快速准确鉴定大麦品种。同时本 发明可以为啤酒酿造过程、评价大麦质量提供参考。相比其他文献鉴别方法具 有明显的准确性和稳定性。

附图说明

图1、牛血清白蛋白（BSA）标准曲线。

图2、不同品种大麦双向电泳图谱，其中，a为甘啤4号、b为甘啤7号、c 为垦麦7号、d为西引1号，e为单2号。

图3、不同品种大麦的特异蛋白分布，其中，a为甘啤4号、b为甘啤7号、 c为垦麦7号、d为西引1号，e为单2号。

图4、甘啤6号大麦双向电泳图，其中放大区域为差异蛋白点区域。

图5、甘啤4号大麦双向电泳图，其中方框中为差异蛋白所在区域。

具体实施方式

实施例一、几种大麦品种的鉴定

第一步、蛋白提取：

取五种纯种大麦（甘啤4号、甘啤7号、垦麦7号、西引1号，单2号） 经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL提取液室温提取2h，10000g 离心10min。取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚，室温提取30min，10000g 离心10min。酚相加入4倍体积清洗液A，-80℃提取3h，10000g离心10min。 离心得到的蛋白分别用清洗液A和清洗液B洗涤，离心3次后，冷冻干燥。将 得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液，室温漩涡振荡裂解1h，4℃裂解过夜。 13000ppm4℃离心10min，取5μL上清液以考马斯亮蓝法测蛋白含量，按上样 量分装，准备电泳。

其中，牛血清白蛋白（BSA）标准曲线中，蛋白浓度与吸光度关系如下：

吸光度（595nm） 蛋白浓度（μg/μL） 0.034 0.4 0.042 1 0.105 2 0.196 4 0.307 6

得出牛血清白蛋白（BSA）标准曲线为y=15.597x-0.0501，R²=0.9942

第二步、双向电泳：

取蛋白上清加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条；

电泳条件：倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液：20mM/L氢氧化钠150mL， 阳极电泳缓冲液：10mM/L磷酸200mL)。接通电源，室温下200V恒压电泳 30min，500V恒压电泳30min，1350V恒压电泳4h，进行等电聚焦。

等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min， 转移至12%的分离胶上，20mA恒流电泳。

第三步、染色及分析：

电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h，Blue silver考马斯亮蓝法进行染 色，利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件（也可以使用其他放大工 具）完成图像的分析。

由图2得到的各纯种大麦的双向电泳图谱，可以确定每个品种的差异性蛋 白点（方框显示），图3为差异性蛋白点的放大图，对比差异蛋白点可以准确直 观地将每种大麦品种区分开来。

实施例二、甘啤6号鉴定

第一步、蛋白提取：

取纯种大麦甘啤6号经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL提取 液室温提取2h，10000g离心10min。取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚， 室温提取30min，10000g离心10min。酚相加入4倍体积清洗液A，-80℃提取 3h，10000g离心10min。离心得到的蛋白本别用清洗液A和清洗液B洗涤，离 心3次后，冷冻干燥。将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液，室温漩涡振 荡裂解1h，4℃裂解过夜。13000ppm4℃离心10min，取5μL上清液Bradford 法测蛋白含量，按上样量分装，准备电泳。

第二步、双向电泳：

取蛋白上清加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条；

电泳条件：倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液：20mM/L氢氧化钠150mL， 阳极电泳缓冲液：10mM/L磷酸200mL)。接通电源，室温下200V恒压电泳 30min，500V恒压电泳30min，1350V恒压电泳4h，进行等电聚焦。

等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min， 转移至12%的分离胶上，20mA恒流电泳。

第三步、染色及分析：

电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h，Blue silver考马斯亮蓝法进行染 色，利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件（也可以使用其他放大工 具）完成图像的分析。

将得到的双向电泳图4与图2相同区域的差异性蛋白进行比较，结果显示 均不相同，且图4区域显示为本品种的差异蛋白区域。可以将该品种大麦区别 出来。

实施例三、甘啤4号大麦检验

第一步、蛋白提取：

取纯种大麦甘啤4号经手工去皮后液氮研磨，取0.3g样品加入0.9mL提取 液室温提取2h，10000g离心10min。取上清液加入等体积pH8.8Tris平衡酚， 室温提取30min，10000g离心10min。酚相加入4倍体积清洗液A，-80℃提取 3h，10000g离心10min。离心得到的蛋白本别用清洗液A和清洗液B洗涤，离 心3次后，冷冻干燥。将得到全蛋白样品干粉加入100μL裂解液，室温漩涡振 荡裂解1h，4℃裂解过夜。13000ppm4℃离心10min，取5μL上清液Bradford 法测蛋白含量，按上样量分装，准备电泳。

第二步、双向电泳：

取蛋白上清加入适量样品缓冲液，上样于自制胶条；

电泳条件：倒入电泳缓冲液(阴极电泳缓冲液：20mM/L氢氧化钠150mL， 阳极电泳缓冲液：10mM/L磷酸200mL)。接通电源，室温下200V恒压电泳 30min，500V恒压电泳30min，1350V恒压电泳4h，进行等电聚焦。

等点聚焦完成后将胶条从玻璃管中均匀挤出，在平衡缓冲液中平衡30min， 转移至12%的分离胶上，20mA恒流电泳。

第三步、染色及分析：

电泳结束后将凝胶放入固定液中固定1h，Blue silver考马斯亮蓝法进行染 色，利用凝胶成像系统获取图像并通过PDQuest软件（也可以使用其他放大工 具）完成图像的分析。

将得到的双向电泳图（图5）与图2相比较，与其中甘啤4号差异性蛋白区 域相同，证明该方法重复性很好，可以满足实践需要。

综上所述，本发明在鉴定大麦品种方面具有准确、快捷、经济的优点，随 着大麦各品种的蛋白质双向电泳图谱的获得，可以建立各大麦品种的双向电泳 数据库，为国内外不同大麦品种的蛋白质比较和种质资源分析提供有力参考。