一种调节糖酵解和糖异生的方法和用途

摘要

本发明属生物技术领域，具体涉及一种调节糖酵解和糖异生的方法和用途。该方法通过调节Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化调控糖代谢关键酶，有效促进肝脏糖酵解、抑制肝脏糖异生，从而降低血糖，能够用于糖代谢治疗药物的筛选及制备糖代谢治疗药物。

说明书

技术领域

本发明属生物技术领域，具体涉及一种调节糖酵解和糖异生的方法和用途。

背景技术

葡萄糖是体内必需的营养物，为细胞提供主要的能量来源，因此，血糖水平的稳定十分重要，糖代谢失衡会导致包括糖尿病在内的代谢性疾病。体内血糖平衡是由多种因素共同调节的，其中包括饮食中的糖类的消耗及小肠的吸收速率，外周组织如肌肉、脂肪对糖的吸收，糖在肾小管的损失以及肝脏中清除和释放糖的速率。在这一系列的过程中，肝脏在血糖稳态中起着关键性的作用，通过糖原合成储存糖，糖酵解消耗糖以及糖原降解和糖异生作用释放糖的一系列活动来平衡血糖水平[Nordlie RC等人，1999，Annu Rev Nutr 19:379-406]。在肝脏中发生的糖酵解及糖异生过程是受多种酶的调节的。其中，磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）及葡萄糖-6-磷酸酶（G6pase）在糖异生过程中发挥着关键的作用，而葡萄糖激酶（Gck）则是糖酵解过程中的重要激酶。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）是糖异生过程中的第一个限速酶，催化草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸。在肝脏中过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck），小鼠表现出高血糖，此外还呈现出肝糖原及肌肉葡萄糖转运蛋白4（Glut4）mRNA水平降低等与胰岛素耐受相关的症状，表明在肝脏中过表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）会导致2型糖尿病 [Valera A等人，1994，Proc Natl Acad Sci U S A 91: 9151-9154]。葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）的作用是催化葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖，这是糖异生和糖原降解过程中的最后一步，经过葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）催化形成的葡萄糖再在葡萄糖转运蛋白2（Glut2）的作用下离开肝脏 [van Schaftingen E等人，2002，Biochem J 362: 513-532]。葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）在维持正常血糖的过程中起着关键的作用。在糖尿病患者中，由于胰岛素耐受或低胰岛素血症，使得葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）基因的表达量上调 [van de Werve G等人，2000，Eur J Biochem 267: 1533-1549]。葡萄糖通过葡萄糖转运蛋白2（Glut2）被转运进入肝脏后进行的第一个代谢活动就是在葡萄糖激酶（Gck）的催化下被磷酸化成葡萄糖-6-磷酸，葡萄糖-6-磷酸再通过一系列活动进入糖酵解或参与糖原合成 [Agius L等人，2008，Biochem J 414:1-18；Wang R等人，2013，Gene 516: 248-254]。葡萄糖激酶（Gck）主要在肝脏中表达，在其他与血糖调节有关的组织中也有表达，可以作为葡萄糖的感应器来控制胰岛素的分泌 [Matschinsky FM等人，2006，Diabetes 55:1-12]。葡萄糖激酶（Gck）在血糖的调节中发挥着关键的作用，人葡萄糖激酶（Gck）基因的突变与年轻的成年发病型糖尿病2型（MODY2）相关。胰岛细胞和肝细胞中的葡萄糖激酶（Gck）基因的缺失都会引起高血糖，导致MODY2 [Postic C等人，1999，J Biol Chem 274:305-315, Zhang YL等人，2004，Acta Pharmacol Sin 25:1659-1665]。

肝糖代谢异常是糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝等代谢综合症的主要病理因素。高血糖作为糖尿病的主要临床症状，其产生与肝脏及外周组织对葡萄糖的利用减少、肝糖生成增多有关。因此，针对糖代谢过程中的关键酶，有效促进肝脏中糖酵解过程，提高葡萄糖的消耗，抑制肝脏中过度的糖异生，减少内源性葡萄糖的生成，将是治疗糖尿病的重要靶向之一和治疗关键及难点。

FADD（Fas-associated death domain protein，Fas相关死亡结构域蛋白）是Chinnaiyan、Boldin等研究小组利用酵母双杂交系统于1995年同时筛选得到的一个能够与死亡受体Fas胞浆区特异性作用的蛋白，由于其包含一个与Fas蛋白质的死亡结构域高度同源的结构域，因而被命名为Fas 相关死亡结构域蛋白（Fas-associated death domain protein，FADD）[Boldin, M.P.等人，1995，J. Biol. Chem. 270:7795-7798; Chinnaiyan,A.M.等人，1995，Cell 81:505- 512]。人FADD基因编码208个氨基酸，分子量为23kDa，大概可分为三个功能区域，包括与凋亡相关的N端约76个氨基酸的DED（death effect domain，死亡效应结构域）和C端70个氨基酸的DD（death domain，死亡结构域），以及在非凋亡中发挥作用的大约20个氨基酸的C末端片段。FADD的C末端片段的磷酸化含有一个磷酸化位点（人194位丝氨酸、鼠191位丝氨酸）引起的[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:513-521]。作为细胞内的接头蛋白，FADD能够介导多种死亡受体诱导的细胞凋亡信号通路，在多种细胞系中能诱导凋亡的发生，是一个经典的凋亡信号分子。在死亡受体诱导的细胞凋亡信号通路中，死亡信号（如Fas L）与死亡受体（如Fas）结合、导致死亡受体（如Fas）胞内的死亡结构域形成三聚体，从而通过结合FADD的死亡结构域（DD）招募FADD蛋白质，并引起FADD构象改变, 使其DED多聚化，进而招募胱氨酸蛋白酶8（caspase 8）前体集聚，形成死亡诱导信号复合体（death-inducing signaling complex，DISC），通过产生有活性的caspase 8，从而激发一系列下游caspase 级联反应，诱发细胞凋亡。

FADD作为凋亡信号途径的连接蛋白，在肿瘤的发生发展过程中起着举足轻重的作用[赵丹，2006，国际免疫学杂志 29:152-156；Tourneur,L.等人，2003，Oncogene 22:2795-2804]。FADD表达的缺失与肝癌的发生密切相关[Shin, E.C.等人，1998，Cancer Lett. 134:155-162； Sun, B.等人, 2000，Zhong Hua Gan Zang Bing Za Zhi 8:37-39]。FADD蛋白表达强度与HCC细胞凋亡密切相关，FADD蛋白表达量越高，其细胞凋亡程度也相对较高[陆东东等人，2002，临床肝胆病杂志，18:375-376]。在许多肾癌患者体内发现癌细胞中的FADD表达量明显降低[Xu, H.等人，2009，Cancer Invest，网络版：2009 Jun 25:1]。FADD表达异常在非小细胞肺癌中也能起到重要作用[Shin, M.S.等人，2002，Oncogene 21:4129-4136]。

针对FADD在细胞凋亡中的衔接和桥梁作用以及其与多种疾病的关系，已有学者开始尝试利用FADD能够诱导介导细胞凋亡的生物特性来进行疾病的治疗。研究发现，FADD过表达可促进恶性脑胶质细胞瘤细胞的凋亡。通过瞬时转染FADD基因进入肿瘤细胞，85%的胶质瘤细胞发生细胞凋亡 [Kondo, S.等人，1998，Human Gene Therapy 9:1599-1608]。利用含FADD基因的逆转录病毒载体稳定转染肿瘤细胞，在体内和体外都能有效地抑制肿瘤细胞的存活。另有研究表明FADD基因的表达可以有效地诱导粘液表皮样癌细胞的凋亡 [刘大庆等人，2002，口腔颌面外科杂志，12:317-320]。除外还发现，FADD的过表达能增强肿瘤细胞对药物引起的细胞死亡和细胞毒作用的敏感性，达到更好的治疗 [Mishima, K.等人，2003，Int. J. Cancer 105:593-600；Micheau,O. 等人，1999，J. Biol. Chem. 274:7987 -7992；Yin,A.等人，Med. Oncol. 网络版：2009 May 5]。

FADD除了在肿瘤治疗中有重要的应用前景外，研究表明Fas介导的细胞凋亡是类风湿关节炎患者关节滑膜细胞退行性变的主要原因之一，其中FADD-caspase-8的信号传导途径在类风湿关节炎病人的滑膜细胞凋亡过程中发挥重要作用 [Kobayashi,T.等人, 1999，Curr. Opin. Rheumatol. 11:188 -193]。利用腺病毒转染将FADD基因转入类风湿关节炎的滑膜细胞后，可引起因过度增殖导致病变的滑膜细胞的凋亡。另外，在免疫缺陷的类风湿关节炎模型小鼠中局部注射腺病毒-FADD（Ad-FADD）后可清除病变的滑膜细胞，并且此效果局限于滑膜组织，而不引起邻近的软骨细胞凋亡。因而FADD过表达可有效地治疗类风湿关节炎 [Kobayashi,T等人，2000，Gene Therapy 7:527-533]。

发明内容

本发明的目的是提供一种调节糖酵解和糖异生的方法，其特征在于：表达模拟Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的基因，或者以Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化程度为指证筛选提高Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的物质，上述方法的共同目的是提高Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化。

进一步的，一种调节糖酵解和糖异生的方法，其特征在于：调节降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性，提高葡萄糖激酶活性。

进一步的，一种调节糖酵解和糖异生的方法在制备治疗糖代谢疾病药物中的应用。

进一步的，上述调节糖酵解和糖异生的方法在制备治疗糖代谢疾病药物中的应用，与现有糖代谢疾病治疗药物和技术的联合应用。

进一步的，一种药物组合物，其特征在于：围绕一种调节糖酵解和糖异生的方法、利用药学上常规的载体或赋形剂或稀释剂进行的组合配方。

进一步的，一种调节糖酵解和糖异生的方法在制备治疗糖尿病药物中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种调节糖酵解和糖异生的方法，其特征在于通过调节Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化，从而实现对糖酵解和糖异生的调节。

所述调节糖酵解和糖异生的方法，不仅能够降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶活性，而且能够提高葡萄糖激酶活性。

在本发明的第二方面，提供了一种通过筛选能够提高Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化的物质的方法，其特征是以Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化程度的变化为指证筛选能够提高Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的物质，从而实现对糖酵解和糖异生的调节。

所述的能够提高Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的物质，包括了能够提高Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化水平的大分子物质，例如，蛋白质、核酸、多糖、脂肪酸、维生素及其纳米分子等；也包括了能够提高Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化水平的小分子物质，例如，天然产物、化学合成或者化学改造的产物、有机小分子、无机分子等。

在本发明的第三方面，提供了一种通过引入模拟Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的基因进行表达，从而调节糖酵解和糖异生的方法。

所述的模拟Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的基因，其特征是指人Fas相关死亡结构域蛋白的第194位丝氨酸突变为天冬氨酸或者谷氨酸的人Fas相关死亡结构域蛋白突变基因。上述模拟Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的基因可用于基因治疗。

在本发明的第四方面，提供了如上述的调节糖酵解和糖异生的方法在制备糖代谢治疗药物中的应用。所述应用包括了通过筛选获得的能够提高Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化的物质或者模拟Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的基因单独用于制备糖代谢治疗药物，或与现有的糖代谢治疗药物组成组合物，或与现有化学药物治疗、中药治疗、生物治疗、物理治疗等方法在糖代谢治疗中联合运用。

在本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或赋形剂或稀释剂，以及有效量的权利要求1所述的调节糖酵解和糖异生的方法。

在本发明的第六方面，提供了如上述的调节糖酵解和糖异生的方法在制备糖尿病治疗药物中的具体应用。

同现有糖代谢疾病方法相比，本发明具有如下的有益效果：

（1）实现了通过对肝脏糖酵解和糖异生的同时调节来调控糖代谢： 目前常用的调节糖代谢的方法一般都是调节或者直接增加胰岛素的水平，或者调节对胰岛素的敏感性，来发挥调节血糖的作用。而本专利则是通过同时调节肝脏糖酵解和糖异生来有效降低血糖水平。

（2）首次实现了通过对Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的调节来调控糖代谢： 本发明首次通过实现对一个经典的细胞凋亡蛋白的磷酸化调节来实现对糖代谢的调节，从而有效降低血糖水平。

（3）首次实现了对肝脏糖酵解和糖异生的同时调控： 糖酵解和糖异生是两个不同的过程。本发明通过对Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的调节实现了显著下调肝脏中与糖异生密切相关的葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）的表达量，从而降低葡萄糖的生成；同时本发明又通过对Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的调节实现了显著上调参与糖酵解的关键酶--葡萄糖激酶（Gck）的表达量，提高了糖的利用，最终降低了血糖水平。

（4）首次实现了对肝脏糖酵解和糖异生的多个关键酶的协同调控： 本发明通过对Fas相关死亡结构域蛋白磷酸化的调节实现了蛋白激酶B（Akt）磷酸化及其下游蛋白转录因子Foxo1磷酸化的调控，继而调节了转录因子Foxo1下游的葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）的表达。本发明通过最终调节肝脏中与糖异生密切相关的葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck），糖酵解关键酶--葡萄糖激酶（Gck）的协同调控，从而显著有效地降低了血糖水平。

（5）提供了一种新的筛选调节糖酵解和糖异生药物或者治疗方法的方法： 本发明提供了一种通过调控Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化来实现调节糖酵解和糖异生的方法，利用Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化做指标，本领域技术人员可以利用目前常规的检测方法筛选能够调节Fas相关死亡结构域蛋白的磷酸化的物质，包括蛋白质、核酸、多糖、脂肪酸、维生素及其纳米分子等大分子物质，也包括天然产物、化学合成或者化学改造的产物、有机小分子、无极分子等小分子物质。

附图说明

为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中

图 1. FADD磷酸化对血糖水平及血清中相关激素水平的影响。

图1A. 禁食和正常状态下小鼠的血糖含量：1. 禁食状态下的正常对照小鼠；2. 禁食状态下的FADD磷酸化小鼠；3. 正常状态下的对照小鼠；4. 正常状态下的FADD磷酸化小鼠。

图1B. 禁食状态下小鼠血清中的胰岛素水平： 1. 正常对照小鼠；2. FADD磷酸化小鼠；

图1C. 禁食状态下小鼠血清中糖依赖性胰岛素释放肽（GIP）水平：1. 正常对照小鼠；2. FADD磷酸化小鼠；

图1D. 禁食状态下小鼠血清中胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平：1. 正常对照小鼠；2. FADD磷酸化小鼠。据表示成平均值±SEM（每组6-13只小鼠）。收集9-11周小鼠的血液进行生化分析。通过t-test进行显著性分析，* P < 0.05。

图2. FADD磷酸化对小鼠糖耐受能力及胰岛素敏感性的影响。

图2A. 葡萄糖耐受实验。小鼠按1.0 g/kg的剂量腹腔注射葡萄糖，隔特定的时间间隔检测葡萄糖水平（每组3只小鼠），白色菱形表示对照小鼠，黑色方形表示FADD磷酸化小鼠；

图2B. 葡萄糖耐受实验中，血糖曲线下面积：1.正常对照小鼠；2. FADD磷酸化小鼠；

图2C. 胰岛素敏感性实验。小鼠按 0.5 U/kg 的剂量腹腔注射胰岛素，隔特定的时间间隔检测葡萄糖水平（每组3只小鼠），白色菱形表示对照小鼠，黑色方形表示FADD磷酸化小鼠；

图2D. 胰岛素敏感性实验中，胰岛素注射后葡萄糖降低的总量：1.正常对照小鼠；2. FADD磷酸化小鼠；数据都表示成平均值±SEM。 通过t-test进行显著性分析，* P < 0.05，**P<0.01，***P<0.001。

图3. FADD磷酸化对糖代谢相关蛋白的表达量的影响。

图3A. 小鼠肝脏中糖代谢关键酶的Western blot结果，包括Pepck、G6pc和Gck，以Tublin作为内标：1. 正常对照小鼠；2. FADD磷酸化小鼠；

图3B. 小鼠肝脏中糖代谢相关基因的mRNA表达水平：1.G6pc；2.Pepck；3.Gck；4.Foxo1；其中，白色为正常对照小鼠，黑色为FADD磷酸化小鼠。每组 4-6 只小鼠，每个样三个重复，以GAPDH为内标；

图3C. 胰岛素处理后，取小鼠的肝脏制样做Western Blot，检测pAkt、Akt和GAPDH的蛋白含量，右图为对Western Blot结果中pAkt的定量分析：1. 胰岛素刺激前的对照小鼠；2. 胰岛素刺激后的对照小鼠；3. 胰岛素刺激前的FADD磷酸化小鼠；4. 胰岛素刺激后的FADD磷酸化小鼠；

图3D. 小鼠肝脏切片Foxo1的免疫荧光，Hoechst染核（每组3只小鼠），标尺= 20 μm；数据都表示成平均值±SEM。 通过t-test进行显著性分析，* P < 0.05，**P<0.01，***P<0.001。

具体实施方式

实施例1

Fas相关死亡结构域蛋白（FADD）磷酸化对血糖水平及血清中相关激素水平的影响

所有的实验小鼠都是在通风无菌，恒温恒湿的SPF级别环境下进行饲养繁殖的。小鼠可以自由获取水和饲料。FADD磷酸化小鼠的繁殖按照之前文献报导的方法进行 [Hua ZC等人，2003，Immunity 18:,513--521]。通过PCR方法进行基因鉴定。

小鼠饥饿过夜。血糖含量通过血糖仪（Roche, Mannheim, Germany）进行检测。血清中胰岛素含量用 Rat/Mouse Insulin ELISA试剂盒（Millipore, Billerica, MA, USA）进行检测。血清中的糖依赖性胰岛素释放肽（GIP）、胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平通过悬液芯片进行检测（Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA）。

由于正常状态下，FADD以非磷酸化为主，磷酸化形式只在特定的生理及病理状态下才存在。为了观察FADD磷酸化对糖代谢的影响，本专利构建了模拟FADD磷酸化的基因改造小鼠（将小鼠FADD基因191位丝氨酸突变为天冬氨酸，以此模拟磷酸化的FADD，该种模型已经为国际公认）[Hua ZC等人，2003，Immunity 18:513-521]。对FADD磷酸化小鼠的血糖（glucose）的检测结果表明，FADD磷酸化小鼠的血糖水平无论是在正常情况下还是在禁食条件下都明显低于其同窝对照小鼠，其血糖水平约为对照小鼠的2/3，如图1 A所示。血糖的平衡在一定程度上是受激素水平的调节，胰腺中分泌的胰岛素（insulin）在血糖的调节中发挥着关键的作用，因此，本专利也检测了血清中胰岛素的含量，图1 B表明FADD磷酸化小鼠血清中胰岛素的含量高于对照小鼠。此外，本专利还检测了血清中其他与糖尿病相关的激素的水平。糖依赖性胰岛素释放肽（GIP）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在FADD磷酸化小鼠中也上调 （图1C和1D），它们可以促进胰岛素的分泌，与我们观察到的血清中的高胰岛素水平一致。因此，FADD磷酸化小鼠中胰岛素水平升高、促进胰岛素升高的胰岛素释放肽（GIP）和胰高血糖素样肽-1（GLP-1）水平也升高，从而导致血糖降低。

实施例2

FADD磷酸化对小鼠糖耐受能力及胰岛素敏感性的影响

在葡萄糖耐受实验中，小鼠饥饿过夜后腹腔注射葡萄糖（1.0 g/kg），于注射后0、15、30、60及90分钟后测血糖含量。在胰岛素耐受实验中，小鼠饥饿6小时后，腹腔注射胰岛素 （0.5 U/kg）。注射后0、15、30、60及90分钟后测血糖含量。

为了进一步研究小鼠中FADD磷酸化对于葡萄糖稳态的影响，本发明进行了腹腔注射的葡萄糖耐受实验（IPGTT）和胰岛素耐受实验（IPITT）。在葡萄糖耐受实验（IPGTT）中，FADD磷酸化小鼠的血糖水平明显比对照小鼠降低了很多（图 2A）。葡萄糖刺激后的血糖升高的曲线下面积数据显示，FADD磷酸化小鼠曲线下面积仅为正常对照小鼠的2/3（图2 B）。这表明FADD磷酸化小鼠在葡萄糖刺激下对葡萄糖的清除能力增强。

本发明还进行了腹腔注射的胰岛素耐受实验（IPITT），以检测胰岛素的敏感性在FADD磷酸化小鼠中是否发生变化。胰岛素注射后，虽然FADD磷酸化小鼠的血糖下降到比对照小鼠低很多（图 2C），但是它们相对的血糖下降水平的变化近似（图 2D），表明FADD磷酸化小鼠的胰岛素敏感性变化不显著。

实施例3

FADD磷酸化对糖代谢相关蛋白的表达量的影响

免疫荧光： 从动物体中取出的肝脏固定在10%的磷酸缓冲福尔马林中，石蜡包埋后，切成5μm厚度的薄片，用anti-Foxo1的抗体作为一抗定位肝脏中的Foxo1，用Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit IgG 抗体作为二抗，Hoechst染核。荧光显微镜进行观察。

Western Blot： 小鼠饥饿过夜后腹腔注射 1U/kg胰岛素。15分钟后处死并取肝脏。组织在细胞裂解液(50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 250 mM NaCl, 50 mM NaF, 5 mM EDTA, 5 mM 磷酸甘油, 1 mM Na3VO4, 1% NP40)中匀浆后 12,000 rpm 离心，收集上清，并用Bradford 方法检测蛋白浓度。等量（约50μg）蛋白用12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离后转移到PVDF膜中。然后分别用Akt、phospho-Akt (Ser 473)、G6pc、Pepck、Gck的抗体进行检验。

RNA提取及定量实时PCR： 用TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 处理组织后根据附带的说明书提取RNA，然后用PrimeScript RT reagent Kit (Takara, Otsu, Shiga, Japan) 进行逆转录制备cDNA。定量实时 PCR（qRT-PCR）在ABI机器(Applied Biosystems, Foster City. CA, USA)上进行。引物如下：mG6pc：正向引物：5’-TCGGAGACTGGTTCAACCTC-3’；反向引物：5’-ACAGGTGACAGGGAACTGCT-3’；mGck：正向引物：5’-GAGGTCGGCATGATTGTGGGCA-3’；反向引物：5’-ACACACATGC GCCCCTCATCGCC-3’；mPepck1：正向引物：5’-CTAACTTGGCCATGATGAACC-3’；反向引物：5’-CTTCACTGAGGTGCCAGGAG-3’；mFoxo1：正向引物：5’-TGTCAGGCT AAGAGTTAGTGAGCA-3’； 反向引物：5’-GGGTGAAGGGCATCTTTG-3’；mGAPDH：正向引物：5’-ACTGAGGACCAGGTTGTC-3’； 反向引物：5’-TGCTGTAGCCGTATT CATTG-3’；。所有的结果都是3次实验的平均值，以GAPDH作为内参。

数据分析：  所有的数据结果都表示成平均值± SEM。用Prism software (GraphPad, San Diego, CA)中的two-tailed Student’s t-test进行两种基因型之间的差异性分析。当P值小于0.05时被认为数据具有统计学差异。

肝脏是糖代谢的主要场所，对血糖的平衡起着关键作用。因此，本发明检测了肝脏中参与糖异生和糖酵解过程的关键蛋白，观察这些蛋白的表达是否受FADD磷酸化的影响。结果显示，葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）及葡萄糖激酶（Gck）这三个参与糖代谢的酶的蛋白和mRNA水平在FADD磷酸化小鼠中均发生了显著的变化（图3A、3B）。糖异生过程中的限速蛋白葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）均下调，降低了內源性葡萄糖的生成；而葡萄糖激酶（Gck）表达的增加，则加速了糖酵解的过程，促进了体内葡萄糖的利用。

为了深入探讨FADD磷酸化的降血糖作用，本发明观察了在血糖平衡中发挥关键作用的胰岛素信号通路。在静息状态下，FADD磷酸化小鼠肝脏中的蛋白激酶B（Akt）磷酸化程度上升（图3C）。胰岛素刺激后，蛋白激酶B（Akt）的磷酸化程度在FADD磷酸化小鼠中依然上调。但是通过对Western bolt结果的定量分析，我们发现，虽然胰岛素刺激后，FADD磷酸化小鼠蛋白激酶B（Akt）的磷酸化程度仍高于正常对照小鼠（图 3C），但是相对于基底水平的上调幅度，FADD磷酸化与对照小鼠没有显著差异，相反FADD磷酸化小鼠的上调幅度略低于对照小鼠。这表明FADD磷酸化小鼠对胰岛素的敏感性没有变化，这与之前的胰岛素耐受实验的结果是一致的（图2）。

本发明还检测了蛋白激酶B（Akt）的下游蛋白转录因子Foxo1。非磷酸化形式的转录因子Foxo1一般在细胞核内表达，被蛋白激酶B（Akt）激活后的磷酸化的转录因子Foxo1出核。过表达磷酸化的转录因子Foxo1可以显著降低血糖水平。肝脏组织切片的转录因子Foxo1的免疫荧光染色结果显示：转录因子Foxo1基本上均出核；而在正常对照小鼠中，转录因子Foxo1大部分都在核内分布（图3D）。这表明FADD的磷酸化可以提高蛋白激酶B（Akt）活性，进而导致转录因子Foxo1的磷酸化水平也升高。而Foxo1作为转录因子，可以促进葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）及磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(Pepck)基因的表达。在本发明中，转录因子Foxo1磷酸化后出核，抑制了葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck）的表达，这个结果与本发明图3A和3B中观察到的这两个基因的蛋白和mRNA水平降低完全一致。

FADD的磷酸化可以影响参与糖代谢过程中葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck1）、葡萄糖激酶（Gck）这些关键酶的表达，从而促进糖酵解对糖的利用，抑制糖异生引起的葡萄糖的生成，最终提高机体对葡萄糖的清除能力，降低血糖水平。FADD磷酸化对血糖平衡的影响在一定程度上与蛋白激酶B（Akt）磷酸化水平的上调有关。因此，本发明FADD磷酸化为治疗包括糖尿病在内的糖代谢疾病提供了一个新的药物靶点。利用FADD磷酸化水平作为筛选标志就可以获得可以调控FADD磷酸化的物质，从而发现调节糖代谢的药物。

本发明通过转入一个模拟FADD磷酸化的FADD突变基因，直接实现了对葡萄糖-6-磷酸酶（G6pc）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Pepck1）、葡萄糖激酶（Gck）这些关键酶的表达的调控，从而有效地调节了包括血糖水平在内的糖代谢。因此，模拟FADD磷酸化的FADD突变基因的基因治疗必然成为调节糖代谢疾病的一种有效手段。

因此，通过FADD磷酸化调节糖酵解和糖异生的方法能够直接应用于糖代谢疾病治疗药物的发现、制备，和治疗。该方法并且能够与现有化学药物治疗、中药治疗、生物治疗、物理治疗等糖代谢治疗方法联合运用，产生更好的治疗效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考一样。此外应理解，在阅读了本发明的上诉讲授内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种修改或改动，这些等价形式均应包含在本发明的保护范围之内。