一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物及其制备方法，旨在提供一种增强人体免疫力和抗氧化能力，减少人体自由基的形成，改善心血管疾病的鳄鱼血红蛋白肽的组合物；其技术要点是：该组合包括下述质量百分比的原料：鳄鱼血红蛋白肽1-90%，鳄鱼肉蛋白1-50%，辅酶Q10 1-50%，各组分之和为100%；制备方法是：1）称取鳄鱼血红蛋白肽，鳄鱼肉蛋白，辅酶Q10，麦芽糊精和粘合剂；2）将步骤1）称取的鳄鱼血红蛋白肽和鳄鱼肉蛋白多肽通过传统的喷雾方法制成细小颗粒，然后和辅酶Q10颗粒混合在一起，充分的搅拌，再添加的麦芽糊精和粘合剂；属于生物医药技术领域。

说明书

技术领域

本发明涉及一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物，本发明还涉及该组合物的制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

鳄鱼与恐龙同时代，是地球上最古老的动物之一，有“活化石”之称。鳄鱼同时还是地球上寿命最长的动物之一，寿命高达两百多岁，比龟和鳖还长。此外，鳄鱼长期生活在沼泽地带，并且经常撕咬，可是他们的伤口从来都不会感染细菌，拥有超强的免疫力。

事实上，早在两千年前，我们的老祖宗就对鳄鱼有了很深的了解。秦汉时代的《神农本草经》称鳄鱼为鮀鱼，主治心腹症瘕，伏坚积聚，寒热，女子崩中下血五色，小腹阴中相引痛，疥疮死肌。唐朝“药王”孙思邈的《千金要方》里记载鳄甲汤主治“风癫”。明朝李时珍的《本草纲目》里记载：鳄鱼 “主治少呼吸，足不立地，湿气邪气，诸它腹内，症痞恶疮。”可见鳄鱼在治疗哮喘、风湿类风湿、皮肤病、五脏疾病、肿瘤乃至癫痫、老年痴呆症等多种疾病方面具有极高的药用价值，是“中医瑰宝级”的珍稀动物。

鳄鱼长寿的秘密的是什么？鳄鱼超强的免疫力源自哪里？鳄鱼为什么可以治疗这么多种疑难病症？研究鳄鱼的生命密码，让鳄鱼长期服务于人类健康，成为生物医学领域的一个重大课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种增强人体免疫力和抗氧化能力，减少人体自由基的形成，改善心血管疾病的鳄鱼血红蛋白肽的组合物及其制备该组合物的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的前一技术方案是这样的：该鳄鱼血红蛋白肽的组合物，包括下述质量百分比的原料：鳄鱼血红蛋白肽1−90%，鳄鱼肉蛋白1−50%，辅酶Q101−50%，各组分之和为100%。

优选的，所述的鳄鱼血红蛋白肽的组合物，该组合物包括下述质量百分比的原料：鳄鱼血红蛋白肽10−80%，鳄鱼肉蛋白5−40%，辅酶Q105−40%，各组分之和为100%。

更优的，所述的鳄鱼血红蛋白肽的组合物，该组合物包括下述质量百分比的原料：鳄鱼血红蛋白肽25−65%，鳄鱼肉蛋白10−30%，辅酶Q10 10−30，各组分之和为100%。

进一步的，所述的鳄鱼血红蛋白肽的组合物，该组合物还包括下述质量百分比的原料：5-10%麦芽糊精；5-10%粘合剂。

本发明提供的后一技术方案是这样的：该鳄鱼血红蛋白肽的组合物的制备方法，依次包括下述步骤： 称取鳄鱼血红蛋白肽，鳄鱼肉蛋白，辅酶Q10，麦芽糊精和食品粘合剂；

2）将步骤1）称取的鳄鱼血红蛋白肽和鳄鱼肉蛋白多肽通过传统的喷雾方法制成细小颗粒，然后和辅酶Q10颗粒混合在一起，充分的搅拌，再添加的麦芽糊精和粘合剂搅拌均匀。

上述的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物的制备方法所述的鳄鱼血红蛋白肽的制备方法依次包括下述步骤：

1）血红蛋白的制备

向新鲜鳄鱼血加入食用级抗凝剂，充分搅拌并离心分离，将下层血细胞用生理盐水洗涤，收集沉淀的血细胞加入蒸馏水，用超声波粉碎仪处理，离心去除细胞膜及杂质，得血红蛋白溶液；

2）血红蛋白的酶解方法

取血红蛋白溶液，用NaOH溶液调至反pH值6.5-7.5，加入蛋白酶反应过程中用NaOH溶液调至pH值7.5；反应结束后灭酶，终止反应，得到水解液；

3）水解液的预处理

将灭酶的水解液离心分离，上清液进行脱色、脱苦处理，多次离心得到血红蛋白水解液；

4）血红蛋白肽的提纯

将血红蛋白水解液透析处理，得到分子量小于8000的外透液，将外透液真空冷冻干燥，将血红蛋白肽样品配制成5ug/ml浓度的溶液，取适量样品依次通过离子交换色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱进行纯化，最后得到较纯的血红蛋白肽样品。

进一步的，上述的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物的制备方法，所述的蛋白酶为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明提供的组合可以增强人体免疫力和抗氧化能力，有效减少人体自由基的形成，抗击衰老，同时有效改善心血管疾病、和癌症。

具体实施方案

以下将结合具体实施方式，对本发明的的权利要求作作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求范围内做所的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。

实施例1

本发明的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物，包括下述原料：鳄鱼血红蛋白肽1g，鳄鱼肉蛋白49g，辅酶Q10 50g。

实施例2

本发明的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物，包括下述原料：鳄鱼血红蛋白肽90g，鳄鱼肉蛋白5g，辅酶Q10 5g。

实施例3

本发明的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物，包括下述原料：鳄鱼血红蛋白肽50g，鳄鱼肉蛋白20g，辅酶Q1020g，麦芽糊精5g；粘合剂5g。

实施例4

本发明的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物，包括下述原料：鳄鱼血红蛋白肽5g，鳄鱼肉蛋白45g，辅酶Q10 30g，麦芽糊精10g；粘合剂10g。

实施例5

本发明的一种鳄鱼血红蛋白肽的组合物，包括下述原料：鳄鱼血红蛋白肽20，鳄鱼肉蛋白20g，辅酶Q1045g，麦芽糊精5g；粘合剂10g。

上述的鳄鱼血红蛋白肽的组合物的制备方法，依次包括下述步骤：

1）按实施例1至5中任一种称取鳄鱼血红蛋白肽，鳄鱼肉蛋白，辅酶Q10，麦芽糊精和粘合剂；

2）将步骤1）称取的鳄鱼血红蛋白肽和鳄鱼肉蛋白多肽通过传统的喷雾方法制成细小颗粒，然后和辅酶Q10颗粒混合在一起，充分的搅拌，再添加的麦芽糊精和粘合剂搅拌均匀

鳄鱼血红蛋白肽的制备方法：

鳄鱼生活在沼泽地带，它们十分凶残，并且经常撕咬到伤痕累累，可是它们的伤口从不感染细菌。鳄鱼的血液中一定有某种物质可以抗击细菌，甚至病毒。在抗生素滥用，细菌对抗生素迅速产生耐药性的今天，研究鳄鱼血具有广泛的现实意义。

近年来，研究发现，蛋白质经消化道酶促水解后主要以小肽的形式吸收，比完全游离氨基酸更易、更快被机体吸收利用：这是肽研究理论和实践的重大突破。酶水解血液可以制备游离氨基酸和功能肽，功能肽在促进免疫细胞增生、抗肿瘤、抗氧化、增强机体免疫力等方面有一定的功效。

本发明采用双酶水解鳄鱼血红蛋白，通过正交实验，确定酶水解最优条件，并对水解液进行预处理，通过粗提、纯化等步骤得到血红蛋白肽样品。

l 材料与方法

1.1原料与试剂

鳄鱼血：由广西钦州华宏特种水产养殖开发有限公司吴川分公司提供的新鲜、检疫合格的鳄鱼血；酶制剂：均为食品级，广西南宁庞博生物工程有限公司；Sephadex G-50：上海君创生物科技有限公司；DEAE-32：上海君创生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2仪器设备

精密pH计、分析天平、高速离心机、超声波粉碎仪、高效液相色谱仪等。

1.3实验方法

1.3.1 总氮测定方法：微量凯氏定氛法(TN)。

1.3.2 酶活测定：Folin-酚法。

1.3.3 水解度(DH)测定：甲醛滴定法测定氨基氮含量(AN)，

按此式计算：DH=AN/TN×100%

1.3.4血红蛋白的制备：

新鲜鳄鱼血加入适量食用级抗凝剂，抗凝剂加入体积约为鳄鱼血体积的1/10，充分搅拌并离心分离，将下层血细胞用生理盐水洗涤，收集沉淀的血细胞加入适量蒸馏水，使血细胞的浓度为4-7mu/ml,在用超声波粉碎仪处理，离心去除细胞膜及杂质，得血红蛋白溶液。

1.3.5血红蛋白的酶解方法

量取一定体积的血红蛋白溶液，用NaOH溶液调至反应所需的pH值，依照所用酶的活力单位加入蛋白酶，反应过程中用NaOH溶液调至最适pH值。反应结束后灭酶，终止反应。

1.3.6水解液的预处理

将灭酶的水解液离心分离，上清液进行脱色、脱苦处理，多次离心得到血红蛋白水解液。

1.3.7血红蛋白肽的提纯

将水解蛋白液透析处理，得到分子量小于8000的外透液，将外透液真空冷冻干燥。将血红蛋白肽样品配制成一定浓度的溶液，取适量样品依次通过离子交换色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱进行纯化，最后得到较纯的血红蛋白肽样品。

2 结果与讨论

2.1两种蛋白酶的最佳作用条件

经反复试验，从6种常用的商品蛋白酶进行筛选，初步筛选出了中性蛋白酶和木瓜蛋白酶。中性蛋白酶作用的肽键具有广泛的专一性；木瓜蛋白酶为内肽酶，它专门作用于肽链内部的肽键，能将舒展开的蛋白质肽链切成较长的肽段，使水溶性固形物增多且水解颜色较好。由于同种蛋白酶对不同的底物具有不同的最适作用条件，以水解度(DH)为指标，通过正交实验确定了两种蛋白酶的最佳作用条件，结果见表1。

表1中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳作用条件

2.2水解液脱色脱苦的处理

血红蛋白的酶水解液一般都带有苦味，且颜色较深，因此需进行脱色脱苦处理，活性炭为一种常用的去苦味的吸附剂，活性炭用量越多，残留的苦味越少，颜色越浅，但过量的活性炭使蛋质损耗过大，并增加使用成本。

本文对活性炭的用量进行了优化(结果见表2)，在活性炭用量为3%-5%，温度50℃，时间30 min的条件下对水解液进行吸附，达到平衡后，离心去除杂质，得到味道佳、颜色浅的血红蛋白肽溶液。

表2活性炭最佳用量

2.3色谱提纯条件的选择

对于血红蛋白肽的混合液，为了分离出较纯的小分子肽，本文采用了DEAE-32、Sephadex G-50、HPLC法对混合液进行提纯并分析。结果表明，顺次洗脱可以得到较纯的血红蛋白肽，经过一系列对比实验发现，洗脱液流速对洗脱效果有很大影响，流速过大，物质在两相之间还未建立平衡即被洗脱出来，分离效果较差；流速过小，同一物质流出时间延长，且不能同时流出，影响分离。

综上，本文选用洗脱液的流速为1mL/min。在分离过程中，洗脱液的pH对洗脱液也有影响，当pH逐渐增大时，酸性逐渐减小，碱性增大，使蛋白质分子电荷减少，从而减弱了蛋白质分子与载体之间的亲和力，使其易于洗脱。

3 结论

鳄鱼是两栖爬行动物，其血液成分复杂特殊，在香港肿瘤医院已经开始直接用新鲜的鳄鱼血来治疗癌症，美国已经有人开始用鳄鱼血来研究抗生素。由于现代科技的迅速发展和肽的特殊生物功能活性，人们对肽的研究愈来愈加以关注。但目前对鳄鱼血血红蛋白肽的研究几乎没有，因此研究鳄鱼血红蛋白肽有重要的现实意义。

该法提纯效果较好，操作简便，具有广泛的应用前景，为下一步大量制备和进一步研究提供了依据。

鳄鱼肉蛋白肽的制备方法：

研究表明，酶解可以有效改善食源性蛋白的抗氧化活性，提高其附加值。至今已有许多学者通过生物酶解技术以鳕鱼、沙丁鱼、鲢鱼、油菜籽等为原料制备了具有抗氧化活性的多肽 。科学家们对鹰嘴豆蛋白酶解产物的研究发现，酶解可有效提高鹰嘴豆蛋白的还原力和自由基清除能力。酶解产物的抗氧化性受分子量、氨基酸组成和水解度等因素的影响。研究人员对鲢鱼抗氧化肽的研究表明超滤所得分子量<1KDa组分的自基清除能力和抑制亚油酸氧化的能力最强。

鳄鱼肉含有19种氨基酸和21种矿物质及微量元素，还有多种维生素，营养价值十分丰富。《本草纲目》里面称鳄鱼肉“至补益”。以往鳄鱼肉大多是作为烹饪的食物供人们享用，通过生物酶解的方法来提取鳄鱼肉中的有益成份，可以将提取到鳄鱼蛋白肽做成一种功能性更强的健康食品。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

1.1.1 材料与试剂

鳄鱼，由广西钦州华宏特种水产养殖开发有限公司吴川分公司提供，将鳄鱼肉、骨、皮分割并分装，鳄鱼肉冻藏备用。1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼(DPPH)，美国Sigma公司；木瓜蛋白酶，广西庞博生物科技有限公司；风味蛋白酶，广西庞博生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器UNICO-2700分光光度计，美国Unic公司；FE20pH计，梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司；TGL-16C高速台式离心机，上海安亭科技仪器厂；FD-1 PF冷冻干燥机，北京德天佑科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鳄鱼肉蛋白酶解产物的制备工艺流程：鳄鱼肉洗净-与水混合-匀浆-灭原酶-调温度、pH值-加蛋白酶酶解-灭-离心-取上清液-冷冻干燥-鳄鱼肉蛋白酶解产物。

操作要点：与水混合比例：1：4(w/w)；酶解条件：木瓜蛋白酶为pH6.5；50℃ ， 风味蛋白酶为pH7.5；50% ，木瓜蛋白酶与碱性蛋白酶复合酶解为pH7.0；50℃ ；蛋白酶添加量：单酶酶解时酶与底物比为1：50，复合酶解时各蛋白酶与底物之比为l：100；离心条件：3000g、10min；冷冻干燥条件：-53℃、25MPa。

2 结果与讨论

2.1 DPPH自由基清除能力

鳄鱼肉蛋白木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物均具有一定程度的DPPH自由基清除能力，其中酶解0.5h的木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物的DPPH自由基清除能力最强达68.28% 。相同酶解时间制备的酶解产物中，木瓜蛋白酶单酶酶解产物的DPPH自由基清除能力显著低于(P<0.05)风味蛋白酶单酶酶解产物和木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物的DPPH 自由基清除能力。Tang等对荞麦蛋白酶解产物抗氧化性的研究结果表明，酶解产物中疏水性氨基酸的含量越高，酶解产物清除DPPH 自由基的能力越强。Pownall等对豌豆种子蛋白酶解产物抗氧化性的研究报道中指出多肽中的色氨酸及半胱氨酸对多肽清除DPPH自由基的能力起主要作用。推测不同蛋白酶酶解产物间DPPH自由清除能力的差异，可能是由于酶解产物中疏水性氨基酸含量不同所致。随酶解时间的延长，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解鳄鱼肉蛋白酶解产物的DPPH自由基清除能力逐渐降低，但木瓜蛋白酶和风味蛋白酶单酶酶解产物清除DPPH自由基的能力随酶解时间的延长而显现出不一样的趋势，这可能是由于鳄鱼肉所处的酶解体系不同所致。

2.2 亚铁离子螯合能力

金属离子螯合能力越大，其抗氧化性越强。在酶解时问0.5-4 h的范围内，鳄鱼肉蛋白木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物均具有较强的亚铁离子螯合能力，在5mg/mL的浓度下除酶解时间为0.5h和1h的风味蛋白酶鳄鱼肉蛋白多肽外，其它鳄鱼肉蛋白多肽的亚铁离子螯合率均大于80% 。其中酶解3h的鳄鱼肉蛋白木瓜蛋白酶酶解产物的亚铁离子螯合能力最强达93.6% 。根据Liu 的报道，酶解产物具有较强的亚铁离子螯合能力可能与在酶解过程中从蛋白质分子内部暴露出的羧基及在氨基酸侧链中的酸性和碱性氨基酸残基有关。与本研究相类似，草鱼鱼肉蛋白木瓜蛋白酶酶解产物 、鲢鱼肉蛋白碱性蛋白酶酶解产物 也具有较强的亚铁离子螯合能力，并且鳄鱼肉蛋白酶解产物的亚铁离子螯合能力显著(P<0.05)高于40mg/mL浓度下猪血红蛋白碱性蛋白酶酶解产物 的亚铁离子螯合能力。

2.3 还原力

鳄鱼肉蛋白木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物均具有一定程度还原力。与DPPH自由清除能力的测定结果相似，随着酶解时间的延长，木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解鳄鱼肉蛋白酶解产物的还原力逐渐降低，木瓜蛋白酶和风味蛋白酶单酶酶解产物的亚铁离子螯合能力并未显现出这一趋势。这可能是由于随着酶解时间的延长木瓜蛋白酶解与风味蛋白酶复合酶解产物中某种特征氨基酸组分的含量发生了规律性的变化。并且不同蛋白酶对于蛋白质的作用位点不同，酶解产物的分子量分布、氨基酸组成、表面疏水性等也会有所差异导致酶解产物的还原力不同。从试验结果可以推断，鳄鱼肉蛋白木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物可以作为自由基的电子供体。

3 结论

经过酶解后鳄鱼肉蛋白木瓜蛋白酶、风味蛋白酶及木瓜蛋白酶与风味蛋白酶复合酶解产物均具有不同程度的供电子或质子和过渡金属螯合能力。其中酶解0.5 h的木瓜蛋白酶和风味蛋白酶复合酶解鳄鱼肉蛋白酶解产物，酶解时间较短并在DPPH自由基清除力、亚铁离子螯合力及还原力方面均显现出较强的体外抗氧化性，具备作为天然抗氧化剂的潜力。

辅酶Q10：

辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂，辅酶Q10是人类生命不可缺少的重要元素之一，能激活人体细胞和细胞能量的营养，具有提高人体免疫力、增强抗氧化、延缓衰老和增强人体活力等功能，医学上广泛用于心血管系统疾病，国内外广泛将其用于营养保健品及食品添加剂。辅酶Q10最早于1957年在美国被发现，同年英国爱丁堡大学彼得·麦克博士因在研究辅酶Q10与细胞能源关系方面的贡献获得诺贝尔奖。微生物发酵法是目前生产辅酶Q10的主要方法。红极毛杆菌、脱氮极毛杆菌，甲烷微环菌等是生产辅酶Q10的主要菌种。国内采用生物提取工艺生产辅酶Q10单位很多，主要有北京制药厂、泰州生物化学制药厂、青岛生物化学制药厂、杭州制药厂、长沙生物化学制药厂、浙江天台县制药厂、贵阳生物化学制药厂、个旧生物化学制药厂、太原市生物化学制药厂、大同市生物化学制药厂等十几家企业。