蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类胡萝卜素含量中的应用

摘要

本发明公开了一种蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类胡萝卜素含量中的应用。本发明所提供的蛋白IbGGPS，来源于甘薯（Ipomoea batatas），是如下（a）或（b）的蛋白质：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物组织中类胡萝卜素含量相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，IbGGPS基因过表达可以提高烟草中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的含量。

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类 胡萝卜素含量中的应用。

背景技术

自然界中，类胡萝卜素广泛存在于植物、真菌、藻类、细菌体内，呈现由黄到红 的颜色变化，动物无法自身合成，需要直接或间接地从植物、真菌、细菌等中摄取。 类胡萝卜素是动物和人类必需的微量营养物质，可合成视黄素、清除自由基，预防癌 症、心血管及老年性疾病等。类胡萝卜素的缺乏，会严重影响人类的健康，夜盲症即 缺乏V_A所致。夜盲症初期通过摄入适量的β-胡萝卜素即可痊愈。面对全球特别是非洲 部分国家V_A缺乏的现状，有人提出通过服用V_A解决，但从长远看，服用V_A操作难度较 大、加之V_A摄入过多会引起中毒，因此从日常饮食中摄取V_A的前体β-胡萝卜素是一条 经济安全的途径。但在人类主食中，通常缺乏这些微量营养物质，因此深入研究其合 成机制，并从基因水平上操纵其生物合成，将有效地提高作物、果蔬等的类胡萝卜素 等微量营养物质的含量。

类胡萝卜素的生物合成是由一系列核基因编码的酶催化反应完成的。高等植物类 胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的萜类化合物，其生物合成的前体是含有C₅的异戊 二烯焦磷酸(IPP)。IPP在IPP异构酶(IPPI)作用下生成二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)。 然后在牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)催化下，DMAPP与3个IPP缩合依次形成牻 牛儿基焦磷酸(GPP)、法尼西焦磷酸(FPP)、牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(GGPP)。两分子 GGPP由八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase，PSY)催化形成第一个C₄₀的类胡萝卜 素一八氢番茄红素(Phytoene)。八氢番茄红素(Phytoene)由八氢番茄红素脱氢酶 (PDS)、ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和类胡萝卜素异构酶(CRTISO)3个酶共同催化形成番 茄红素(Lycopene)。自番茄红素以下反应分成两条支路，一条是经连续两次环化反应 生成β-胡萝卜素，由番茄红素β-环化酶（Lycopeneβ-cyclase，LCY-B）催化完成； 另一条是生成α-胡萝卜素，由LCY-B和番茄红素ε-环化酶（Lycopeneε-cyclase， LCY-E）催化完成。类胡萝卜素尤以β-胡萝卜素是维生素A的前体，具有免疫和抗氧化 功能，其药用潜力引起人们的极大关注。

发明内容

本发明的一个目的是提供蛋白IbGGPS及编码基因。

本发明所提供的蛋白IbGGPS，来源于甘薯（Ipomoea batatas），是如下（a）或（b） 的蛋白质：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且与植物组织中类胡萝卜素含量相关的由序列2衍生的蛋白质。

上述序列2有363个氨基酸残基组成。

上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于 十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述类胡萝卜素为如下1）或2）：

1）由β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝 卜素；

2）α-胡萝卜素或β-胡萝卜素；

上述组织为叶片，上述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述双子叶植物为烟草 （Nicotiana tabacum）或甘薯（Ipomoea batatas）。

编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。

上述DNA分子是如下(1）-(3）中任一种的DNA分子：

(1）编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码与植物组织中类胡萝卜素含 量相关蛋白的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少 具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98% 或至少具有99%同源性且编码与植物组织中类胡萝卜素含量相关蛋白的DNA分子。

上述序列1由1092个碱基组成，其开放阅读框（ORF）为自5′末端第1位—第1092 位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白。

上述严格条件为：50℃，在7％SDS、0.5M NaPO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂 交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液 中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的 保护范围。

上述重组载体为将编码上述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白 的重组载体。

在本发明的实施例中，表达载体为pCBGUS，上述重组载体为将序列表中序列1所 示的DNA分子插入pCBGUS中，替换掉表达载体pCBGUS中的gusA报告基因；得到表达 上述蛋白的重组载体；上述重组载体具体可为将序列表中序列1所示的DNA分子取代 pCBGUS的BamH I和Sac I酶切位点间的小片段（gusA报告基因）得到的重组载体。

所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：

（1）将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收11786bp载体大片段；

（2）将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片 段；

（3）将步骤（1）中回收的11786bp载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基 因的3032bp的片段连接，得到重组载体pCBGUS。

所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。

扩增上述DNA分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对为如下1）或2）所示：

1）由序列表中序列3所示的DNA片段和序列表中序列4所示的DNA片段组成的引物 对；

2）由序列表中序列5所示的DNA片段和序列表中序列6所示的DNA片段组成的引物 对。

上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调 控植物组织中类胡萝卜素含量中的应用也是本发明保护的范围。

上述应用中，所述类胡萝卜素为如下1）或2）：

1）由β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝 卜素；

2）α-胡萝卜素、叶黄素或β-胡萝卜素；

所述组织为叶片，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述双子叶植物为烟草 （Nicotiana tabacum）或甘薯（Ipomoea batatas）。

上述调控植物组织中类胡萝卜素含量为提高植物组织中类胡萝卜素含量，提高植 物组织中类胡萝卜素含量具体体现在如下1）或2）：

1）提高由β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素组成的类 胡萝卜素总体含量；

2）提高α-胡萝卜素含量、提高叶黄素含量或提高β-胡萝卜素含量。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的 植物，获得转基因植物，所述转基因植物组织中类胡萝卜素含量高于所述目的植物。

编码上述蛋白的DNA分子是通过所述重组载体导入目的植物中。

在上述方法中，所述组织为叶片，所述类胡萝卜素为如下1）或2）：

1）由β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝 卜素；

2）α-胡萝卜素、叶黄素或β-胡萝卜素；

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述双子叶植物为烟草（Nicotiana  tabacum）或甘薯（Ipomoea batatas）。

上述提高植物组织中类胡萝卜素含量，提高植物组织中类胡萝卜素含量具体体现 在如下1）或2）：

1）提高由β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜素组成的类 胡萝卜素总体含量；

2）提高α-胡萝卜素含量、提高叶黄素含量或提高β-胡萝卜素含量。

本发明的实验证明，本发明提供了一种IbGGPS蛋白及其编码基因，将该基因导入 野生型烟草中，得到转IbGGPS烟草，检测转IbGGPS烟草叶片中类胡萝卜素含量，发 现转IbGGPS烟草叶片中由β-胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β-隐黄质和α-胡萝卜 素组成的类胡萝卜素含量提高，其中α-胡萝卜素含量或β-胡萝卜素含量均提高。说 明IbGGPS基因过表达可以提高烟草中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的 含量。

附图说明

图1为转IbGGPS烟草植株的PCR检测结果图

图2为混合标样中β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素 (lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(α-carotene)的标准曲线 图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与甘薯牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶相关的蛋白及其编码基因的获 得

一、与与甘薯牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶相关的蛋白及其编码基因的获得

（一）甘薯（Ipomoea batatas）IbGGPS蛋白cDNA的克隆

实验材料：

将农大辐14（高系14号的高类胡萝卜素含量突变体）(公众可从中国农业大学获 得，记载过农大辐14（Nongdafu14）的非专利文献是：Wang YP,Wang F,Zhai H,Liu  QC.Production of a useful mutant by chronic irradiation in sweetpotato. Scientia Horticulturae111,2007:173–178；)在大田种植约90天，块根膨大前 期收获直径3～4cm的块根，液氮速冻，-80°C保存。

1、块根总RNA提取和纯化

取农大辐14膨大块根约2g，在液氮中研磨成粉状，加入10mL离心管，用Applygen 植物RNA提取试剂盒（Applygen Technologies Inc，Beijing）提取甘薯块根总RNA， 试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚； Extraction Reagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去 除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit（QIAGEN， GmbH，Germany）从总RNA中纯化mRNA。最后，取1μL于1.2%琼脂糖凝胶电泳检 测其完整性，另取2μL稀释至500μL，用紫外分光光度计检测其质量（OD₂₆₀）和纯 度(OD₂₆₀/OD₂₈₀)，提取的农大辐14的块根总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测， 28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2︰1，表明总RNA没有降解，纯化所得 mRNA符合实验要求，可用于甘薯IbGGPS蛋白cDNA全长的克隆。

2、IbGGPS蛋白cDNA的全长克隆

以本实验室获得的IbGGPS EST片段设计引物进行IbGGPS蛋白cDNA的全长克隆。

（1）3′-RACE

以农大辐14块根cDNA为模板，用IbGGPS EST正向引物1及Takara RNA PCR  Kit(AMV).3.0(购自北京六合通经贸有限公司，产品编号DRR019A)中的M13Primer M4 引物1引物2作为反向引物进行PCR反应。引物序列如下：

引物1：5′-CTATTCCAGGTGGTGGAT-3’

引物2：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

PCR得到的3′RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7 通用引物进行测序。

（2）5′-RACE

以农大辐14块根cDNA为模板，用IbGGPS EST正向引物3和正向引物4及反向引 物5、反向引物6(反向引物5、反向引物6序列参照Invitrogen5’RACE System for  Rapid Amplification of cDNA Ends,Version2.0，购自北京拓英坊科技有限公司，产 品编号18374-058)进行PCR反应。其中正向引物3在引物4的下游。引物序列如下：

引物3：5′-TCGCCAGAATTTCAAGAACC-3’

引物4：5′-CACCGGATTACCCACAAATC-3’

引物5：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG3’

引物6：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’

PCR得到的5′RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7 通用引物进行测序。

（3）PCR扩增IbGGPS蛋白cDNA的编码区

利用DNAMAN6.0软件拼接候选的甘薯IbGGPS蛋白cDNA序列。进一步设计正向引物5 和反向引物6进行PCR扩增IbGGPS蛋白cDNA的编码区。引物序列如下：

引物5：5′-ATGAGGTCGATGAATCTT-3′（序列3）

引物6：5′-TTAATTCTGTCTATAAGC-3′（序列4）

以农大辐14块根总RNA经Oligo(dT)反转录cDNA为模板，用高保真的KOD酶，进行PCR 扩增，PCR条件为94℃5min，随后60℃30min和72℃2min30s进行34个循环，最后72℃ 延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1092bp长度的扩增片段。

综合上述4个步骤的结果，获得了1092bp目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中 序列1所示。序列表中序列1由1092个碱基组成，自5′端第1位-第1092位碱基为其开放 阅读框，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由 363个氨基酸残基组成。将该基因命名为IbGGPS，将其编码的蛋白命名为IbGGPS。

实施例2、甘薯IbGGPS蛋白在提高植物组织中类胡萝卜素含量中的应用

一、转IbGGPS烟草的获得

1、植物表达载体的构建

根据甘薯IbGGPS蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列， 正反向引物分别引入BamH I和Sac I酶切位点，引物序列如下：

引物7：5′-GGGATCC ATGAGGTCGATGAATCTT-3′（序列表中序列5）（下划线部 分为BamH I酶切位点），

引物8：5′-TCGAGCTC TTAATTCTGTCTATAAGC-3′(序列表中序列6）（下划线部 分为Sac I酶切位点）。

以人工合成的序列表中序列2所示的DNA分子为模板（或以农大辐14块根cDNA 为模板），PCR扩增后，得到1107bp的PCR产物，将产物连接到pGEM-TEasy载体（购 自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360）上，命名为pGIbGGPS载体，进 行T7/sp6的测序，保证甘薯IbGGPS蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。

用Sac I和BamH I酶切载体pCBGUS，回收12926bp载体大片段；同时，用Sac I 和BamH I酶切载体pGIbGGPS，回收约1.1kb中间片段；将回收12926bp载体大片段 与约1.1kb中间片段连接，得到重组载体pCBIbGGPS，即为植物表达载体。

将重组载体pCBIbGGPS转化大肠杆菌DH5a（购自北京全式金生物技术有限公司， 产品目录号为CD201-01），37℃培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进 行测序验证。测序结果表明，重组载体pCBIbGGPS为将序列表中序列1自5′端第1 位-第1092位所示核苷酸插入载体pCBGUS的BamH I和Sac I酶切位点（替换掉gusA 报告基因）间得到的载体。

上述pCBGUS载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

（1）将pCAMBIA1301载体（购自CAMBIA公司）经过Hind III和EcoR I双酶切，回 收11786bp的载体大片段；

（2）将pBI121载体（购自Clontech公司；含35S启动子，gusA报告基因，nos终止 子片段）也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；

（3）将步骤（1）中回收的11786bp载体大片段与步骤（2）中回收的包含gusA基 因的3032bp的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体pCBGUS。

2、植物表达载体转化农杆菌

(1)从-80°C低温冰箱中取出200μL EHA105感受态细胞（购自北京拜尔迪生 物技术有限公司），置冰上融化，加入1μg上述步骤1得到的植物表达载体pCBIbGGPS， 混匀。

(2)液氮冷冻1min，37°C温育5min。

(3)加入800μL LB液体培养基，28°C培养2-6h。

(4)取100μL菌液至LB固体培养基上（含100μg/mL利福平(Rif)、25μg/mL 卡那霉素(Kan)），涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28°C培养2d。

(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落（引物为引物7和引物8，得到1107bp的为阳性）， 接种到含有100μg/mL Rif、25μg/mL Kan的LB液体培养基中，28°C培养30h至对数 生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到导入pCBIbGGPS载体的农 杆菌菌液。

3、转IbGGPS烟草的获得

1）转化

用农杆菌介导的方法将IbGGPS cDNA的编码序列导入到烟草品种cv.Wisconsin38 （以下也称为野生型烟草；Wang LJ,He SZ,Zhai H,Liu DG,Wang YN,Liu QC(2012): Molecular cloning and functional characterization of a salt  tolerance-associated gene IbNFU1from sweetpotato.Journal of Integrative  Agriculture,2012，12（1）：101-108；公众可从中国农业大学获得）中，具体方法 如下：

(1)取经过继代培养6周的野生型烟草无菌苗叶片，在超净台中，切下5×5mm 的烟草叶盘（去掉主叶脉），悬浮于上述步骤2制备好的EHA105/pCBIbGGPS农杆菌菌 液中，10min后将菌液吸出，将侵染过的烟草叶盘接种培养在固体培养基（1.0mg/l 6-BA、0.1mg/l NAA的MS）上。28℃、黑暗，共培养3d。

(2)将共培养3d后的烟草叶盘用含有500mg/l Carb、1.0mg/l6-BA、0.1mg/l  NAA的MS液体培养基洗涤2次后，将烟草叶盘转至含有1.0mg/l6-BA、0.1mg/l NAA、 6mg/l PPT的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1℃、每日13h、3000 lx的光照。培养4周后，将不定芽转移至含有1.0mg/l6-BA、0.1mg/l NAA、6mg/l PPT 的1/2MS固体培养基上进行不定根诱导，培养条件为27±1℃、每日13h、3000lx 的光照。8周后，形成完整的再生植株，得到T₀代转IbGGPS烟草。

采用同样的方法将空载体pCBGUS转入野生型烟草中，得到转空载体烟草。

2）分子鉴定

用CTAB法提取T₀代转IbGGPS烟草、转空载体烟草和野生型烟草的基因组DNA作 为模板，用常规方法进行PCR检测，所使用的IbGGPS基因引物为：primer1：5′- AGGTGGCTCCTACAAATGC-3′和primer2：5′-TTAATTCTGTCTATAAGCTA-3′。在0.2ml  Eppendorf离心管中加入10×PCR buffer2μl、4dNTP(10mol/L)1μl、引物(10 μmol/l)均为1μl、模板DNA（50ng/ul）2μl、Taq DNA聚合酶0.25ul，加H₂O 至总体积20μl。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30S，55℃复性30S，72℃ 延伸2min，共35个循环。

电泳检测扩增结果见图1（泳道M为Maker，泳道W野生型烟草植株；泳道P为阳 性对照（重组质粒pCBIbGGPS）；泳道C为转空载体烟草；泳道1-泳道5为T₀代转IbGGPS 烟草），可以看出，泳道1-泳道5所示的T₀代烟草均扩增出1386bp的目标片段，为 T₀代转IbGGPS烟草，表明IbGGPS基因已经整合到烟草的基因组中，并证明这些再生 植株为阳性转基因植株；转空载体烟草和野生型烟草均没有目的片段。

将经鉴定为阳性的编号为1和编号4的T₀代转IbGGPS烟草扩繁进行类胡萝卜素 含量的测定。

二、转IbGGPS烟草类胡萝卜素含量的鉴定

1、高效液相色谱法测定转基因烟草的类胡萝卜素含量

（1）标样的准备

①β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)和叶黄素(lutein)标样 购自sigma公司，商品号分别为C4582-10MG、14681-1、95507）；β-隐黄质 (β-cryptoxanthin)标样购自北京华美互利生化公司，商品号为0317S。

②α-胡萝卜素(α-carotene)标样：由于α-carotene标样极易降解，没有进 行商业化标样，必须自行提取，具体方法如下：

1)将胡萝卜丁放入食物料理机中打碎。

2)将打碎的胡萝卜浆状物导入盛有5g硅藻土的大研钵中，混匀。

3)加入适量的预冷丙酮用力研磨，将胡萝卜中的胡萝卜素萃取到丙酮中。

4)将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，黄色液体会被抽到三角瓶中，磨砂漏斗 中的干燥物质用勺取出，再放入到大研钵中，加适量预冷丙酮再次用力研磨。重复5-6 次，直到研磨液的颜色变为无色。

5)将三角瓶中的金黄色液体（胡萝卜素萃取液）分若干次倒入分液漏斗中，每倒 入一次胡萝卜素萃取液后，均倒入300ml的dd H₂O，静置稍许，将下层透明液层排出 到废液瓶中。

6)胡萝卜素萃取液经过若干次dd H₂O洗涤后，最后一次用饱和食盐水洗涤，以彻 底除去所形成的乳状物层，同样排出下层的透明废液。

7)用吸水纸擦干分液漏斗的出水孔。将金黄色的石油醚层（高纯度胡萝卜素萃取 液）排出倒入一个干燥的锥形瓶中；加入适量无水硫酸钠（Na₂SO₄）干燥（至无水NaSO₄结晶呈分散状态），摇晃，吸取萃取液中的残留水分。

8)将处理后的金黄色液体倒入一干燥的球形瓶中，再加入100ml10%KOH的甲 醇溶液皂化和0.1%二丁基羟基甲苯。

9)将球形瓶接入旋转蒸发仪，旋转蒸发仪的另一接口接真空泵，真空蒸干液相石 油醚，将有机相浓缩至大约5ml，之后用胶头滴管吸取石油醚（<5ml）以洗净球形瓶 壁上的橙色固态物质，胶头滴管反复吹打橙色液相，使固态物质充分溶解，以获得更 高纯度的胡萝卜素萃取液，工作时间约50分钟。

10)柱填料硅藻土和氧化镁（1:1）于110℃活化4个小时，在干燥器里冷却、干 燥。准备一个铁架台，将玻璃层析柱放置在铁架台上并固定。在玻璃层析柱下方接好 一个带口三角瓶，三角瓶通过皮管连接真空泵。

11)填柱：将高温激活的硅藻土氧化镁混合物小心倒入玻璃层析柱内，不时用柱塞 棒小心压实，填柱约20cm左右，确保柱面水平；再在柱面上方加入细化无水硫酸钠层 1cm，之后塞入一层1.5cm左右的脱脂棉层，保证硫酸钠层和脱脂棉层的相平。再次压 实后，打开真空泵，抽真空1小时。

12)石油醚过柱：抽真空1小时后，不要关闭真空泵，沿柱壁加入石油醚润柱，调 整真空泵，使流速为每秒2-3滴，并用柱塞棒保持固态面的水平，最终使石油醚润洗 整个层析柱。

13)用滴管将浓缩后的提取物小心转入层析柱中，至样品层进入到接近无水Na₂SO₄层时，再把冲洗圆底烧瓶的石油醚相转入层析柱中，过柱过程中要保证石油醚相始终 高于无水Na₂SO₄层。

14)层析工作过程中，一定要保证固相上方的石油醚液相的存在，石油醚一旦不足 必须立即补充（层析柱需要避光，可以使用锡箔纸包裹）。

15)α-胡萝卜素是第一个流出层析柱的物质，所以当分层的α-胡萝卜素层即将 流出层析柱时，暂时关闭真空泵，更换新的带口三角瓶，以盛接α-胡萝卜素，连接 好后，打开真空泵，金黄色的α-胡萝卜素会流出进入到三角瓶内（三角瓶同样需要 避光）。16)将获得的金黄色液体倒入玻璃螺口离心管中保存，详细注明标样提取时间， parafilm严格密封，锡箔纸避光，-80℃冰箱直立保存。

17)取出少量用N₂气吹干（剩余的大量提取物密封、避光保存于-70℃，备用）， 用1ml V乙腈︰V甲醇︰V二氯甲烷=45:20:35的溶剂溶解。

18)用1ml一次性注射器使溶质完全溶解后，通过0.22μl的过滤器转移至2ml 棕色进样小瓶中，50μl进样检测提取样品的纯度。

(2)混合标准样品的制备及标准曲线的绘制

将提取并检测的α-胡萝卜素(α-carotene)直接用于混合标样的制备；叶黄素 (Lutein)标样用无水乙醇和乙醚溶解；玉米黄素(Zeaxanthin)用丙酮溶解；β-隐黄质 (β-cryptoxanthin)标样用乙醚和石油醚溶解；β-胡萝卜素(β-catotene)标样则用 石油醚进行溶解。将标准样品溶解后各取100μl至小容量瓶（5ml）定容，用紫外 -可见光分光光度计在各成分特定波长下测定其吸光值。根据公式(1)计算浓度，公式 (2)校对公式(1)计算所得浓度，用公式(3)配置成50ml混合标样。混合标样需经氮 气浓缩后，用石油醚定容。分别取1ml、2ml、3ml和5ml混合标样并分别重复3次共 45ml建立标准曲线，标样测定值满足表1所列各成分所在的浓度范围内即可进行标准 曲线的绘制。混合标样中β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄 素(lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(α-carotene)的标准曲 线如图2所示，图2中A为β-胡萝卜素的标准曲线，其标准曲线方程为 y=294.92x-35.199；图2中B为玉米黄素的标准曲线，其标准曲线方程为 y=339.83x-126.76；图2中C为叶黄素的标准曲线，其标准曲线方程为 y=479.56x-72.214；图2中D为β-隐黄质的标准曲线，其标准曲线方程为 y=425.88x-40.863；图2中E为α-胡萝卜素的标准曲线，其标准曲线方程为 y=350.51x-4.7455。

式中OD为吸光值；为吸光系数；

校对浓度(μg/ml)=浓度c×纯度(%)    (公式2)

纯度(%)=标样HPLC峰面积/HPLC峰总面积×100；

a=(50×b)/c    (公式3)

式中50为混合标样总体积50ml；a为加入标样量(μg/ml);

b为浓度范围中值(μg/ml)；c为校对浓度(μg/ml)。

表1为标准溶液吸光系数和浓度范围

(3)转IbGGPS烟草中的类胡萝卜含量测定

①转IbGGPS烟草类胡萝卜素的提取

1）上述步骤一得到的编号为1、4的T₀代转IbGGPS烟草、转空载体烟草和野生 型烟草（CK）的叶片，快速称取5g，倒入研钵中，加入50ml冰丙酮浸泡（丙酮预冷 约2小时）和3g硅藻土混匀后，用力研磨5min。

2）将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，漏斗中的干燥粉末加适量预冷丙酮再 次用力研磨。重复操作4次，直至研磨液的颜色变为无色。

3）分液漏斗加入40ml石油醚，将提取物转移至500ml分液漏斗（分液漏斗活塞 处使用前应用甘油润滑）。

4）沿着漏斗壁缓缓加入约300ml水。如出现乳状物层，可用饱和Nacl水溶液去 除。出现分层后，将下面水相弃掉。

5）用约200ml水洗石油醚相，重复4次，然后收集到20ml棕色样品瓶，封口， -80℃避光保存，得到待测类胡萝卜素溶液，2天内送样检测。

②转基因烟草类胡萝卜含量测定（高效液相色谱仪为美国Agilent公司1200型）

1)将上述得到的待测类胡萝卜素溶液在旋转蒸发器中集中收集，并用N2干燥。

2)立即使类胡萝卜素溶解于1ml乙腈︰甲醇︰二氯甲烷（V︰V︰V）=45:20:35的 的溶剂中。

3)将待测样品通过0.22μl注射器过虑后，直接将10μl样品到加入到色谱柱中。

4)采用YMC C30色谱柱(250mm×4.6mm,5nm),以乙腈︰甲醇︰二氯甲烷（V︰ V︰V）=75︰20︰5为流动相，流速1.8ml/min检测波长450nm处的吸收峰的变化。

5)每个待测样品，重复测定3次。

根据上述建立的β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素 (lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(α-carotene)的标准曲线， 分别测定转基因烟草、和野生型对照烟草叶片中的类胡罗卜素含量。其中总类胡萝卜 素含量是五种类胡萝卜素含量（x/0.6(ug/g)）之和。

结果如表2所示，其中1和2分别为编号为1和编号4的T₀代转IbGGPS烟草； ck代表野生型烟草；μg/g FW表示每克鲜重样品所含的微克数。

表2类胡罗卜素含量

由表2可以看出，T₀代转IbGGPS烟草和野生型对照烟草叶片中叶黄素和玉米黄素 含量无显著差异；转基因植株的β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和总类胡萝 卜素含量与野生型对照植株相比显著差异，其中，转基因植株的叶黄素、α-胡萝卜素、 β-胡萝卜素和总类胡萝卜素含量与野生型烟草植株相比显著提高：α-胡萝卜素含量 分别是野生型对照植株的3.79倍和2.86倍；β-胡萝卜素含量分别是野生型烟草植株 的1.14倍和1.11倍；总类胡萝卜素含量分别是野生型烟草植株的1.11倍和1.096 倍。

转空载体烟草和野生型烟草结果无显著差异。

以上结果说明，与野生型对照烟草相比，T₀代转IbGGPS烟草的叶黄素、α-胡萝 卜素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素均提高，说明IbGGPS基因过表达可以提高烟草中 α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的含量。