同时鉴别Q型和B型烟粉虱的特异性PCR方法及试剂盒

摘要

本发明同时鉴别Q型和B型烟粉虱的特异性PCR方法及试剂盒，属于分子生物学检测技术，包括对待测烟粉虱的DNA进行PCR扩增和检测PCR扩增产物，其特征在于：所述PCR扩增所采用的引物对如下：上游引物Bt-F：5’-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’，下游引物Bt-R：5’-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’；所述检测PCR扩增产物指对PCR扩增产物进行凝胶电泳并观察是否出现特征带型，Q型烟粉虱的特征带型为一条507bp条带；B型烟粉虱特征带型为507bp和660bp两条带，本发明还基于该方法提供了试剂盒。

说明书

技术领域

本发明属于生物检测技术，特别是一种同时鉴别Q型和B型烟粉虱的特异性PCR方法 及试剂盒。

背景技术

烟粉虱Bemisia taabaci属半翅目，粉虱科，广泛分布于世界各大洲，通过直接取食植物汁 液、分泌蜜露污染植物以及传播植物病毒对农业和园艺生产造成严重危害。烟粉虱入侵性极 强，过去二十多年来，烟粉虱入侵到全球多个国家和地区并取代了当地多个土著烟粉虱，对 世界各地多种重要作物造成了严重危害，除了本身刺吸植物汁液引起叶片甚至植株萎蔫、寄 主植物生理紊乱外，最重要的是烟粉虱传播的双生病毒病－番茄黄曲叶病毒病大面积暴发为 害（Brown&Czosnek,2002；Czosnek&Ghanim,2011），并由南方蔓延到北方（张穗等，2006； 吴永汉等，2007；周莹等，2010）。病毒病的流行给番茄生产带来了巨大威胁，局部地区的番 茄大棚甚至绝收。因而，烟粉虱成为全球密切关注的“超级害虫”(Liu et al.，2007;Martinez- Carrillo and Brown,2007;Bethke et al.，2009)。烟粉虱是一个包括许多遗传型的复合种，被命 名的生物型至少有24个（Dinsdale et al.，2010），截止到2011年，已经报道的亚种至少有32 个，目前我国至少存在6种生物型(B，Q，ZHJ-1，ZHJ-2，ZHJ-3，FJ-l)(万方浩等，2009)， 这其中分布最为广泛、危害最为严重的生物型为近年来入侵我国并逐步形成蔓延扩散趋势的 B型和Q型烟粉虱。根据最近发表的系统发育分析文献，杂交试验和交配行为观察结果表明 烟粉虱至少包括28个遗传结构差别明显、但外部形态无法区分的隐种（Dinsdale et al.,2010; Xu et al.,2010;De Barro et al.,2011;Hu et al.,2011）。然而，形态学上尚缺乏的有力证据以及 遗传学角度的分类方法是否合理，使得隐种的命名法则在分类学上无充足的依据，所以本申 请中依然沿用生物型的概念。在所有烟粉虱的生物型中，B型和Q型烟粉虱当属入侵性强、 在全世界范围内广泛分布、危害性最严重。

B型烟粉虱起源于中东-小亚细亚地区（De Barro et al.,2011），90年代中后期，B型烟粉 虱入侵中国，并给农业和园艺生产带来了经济损失。2005年在中国云南首次发现了Q型烟粉 虱（禇栋等，2005），在随后的几年内，发现Q型烟粉虱逐渐取代了B型烟粉虱，2009年底 我国已经至少有21个省市发现了Q型烟粉取代了原来为害的B型烟粉虱（Pan et al.,2011）; 但在一些地区，田间发现二者是混合发生的（褚栋等，2007；褚栋等，2009）。

B型烟粉虱和Q型烟粉虱表观一致，在形态上无法区分，但二者在生物学特性、寄主植 物、生理和分子水平上存在明显差异，例如Q型烟粉虱比B型烟粉虱具有更强的寄主适应性 和抗药性（Muniz,2000;Horowitz et al.,2003），对病毒病的传播能力更强（pan et al.,2012） 等，而且许多遗传型之间存在生殖隔离。目前经常用于区分其生物型的分子鉴定方法就是采 用mtCOI特异性引物进行特异性PCR扩增，然后将PCR扩增产物进行测序和序列比对，进 而来确定是何种生物型（罗晨等，2002）。但是这种方法需要经过PCR扩增、克隆、测序、 序列比对等诸多步骤，耗时较长，而且需要大量的资金作为支持。

而随着分子生物学的进一步发展，研究者试图寻找通过PCR扩增即可明显鉴定两个生物 型的方法。例如Shatters JRG等（2009）报道通过比较B型和Q型烟粉虱二者之间的mtCOI 序列，针对各自的特异性序列分别设计出各自的特异性引物，通过PCR扩增的方法来鉴别这 两个生物型。另外比较常见的鉴定物种的技术也包括随机扩增多态性DNA(random amplified  polymorphic DNA,RAPD)技术结合特征序列扩增区域(sequence characterized amplified regions, SCAR)标记技术来筛选出需要鉴定物种的特异片段，然后将目标特异性片段进行克隆和测序， 并以此片段序列进行特异性引物设计，然后以该对特异性引物对基因组DNA片段再次进行 PCR扩增，进而将与原特异性片段相对应的位点鉴别出来。SCAR标记为共显性遗传，待检 DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示(黎裕等,1999)。这样根据特异性扩增片段长度 的大小来进行物种鉴别的方法与通常采用的限制片段长度多态性(restriction fragment length  polymorphism,RFLP)、碱基序列测定、荧光定量PCR等技术相比，免去了筛选限制性内切酶 和碱基序列测定的过程或者费用高昂、仪器设备要求条件高的不利条件，不仅操作简便、成 本低，而且结果稳定、灵敏度高、重复性好，而且特异性引物一旦获得，即可用于大规模样 品的检测分析，可快速对靶标样品进行鉴别。但是目前对B型烟粉虱和Q型烟粉虱进行生物 型鉴定的分子标记中采用的引物对仅能鉴定单个生物型（Shatters et al.,2009）。

发明内容

本发明提供一种用于鉴定B型烟粉虱和Q型烟粉虱的方法及基于该方法的试剂盒。本发 明的技术方案如下：

用于检测B型烟粉虱和Q型烟粉虱的方法，包括对待测烟粉虱的DNA进行PCR扩增和 检测PCR扩增产物，其特征在于：

所述PCR扩增所采用的引物对如下：

上游引物Bt-F：5’-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’，

下游引物Bt-R：5’-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’；

所述检测PCR扩增产物指对PCR扩增产物进行凝胶电泳并观察是否出现特征带型，Q 型烟粉虱的特征带型为一条507bp条带；B型烟粉虱特征带型为507bp和660bp两条带。

所述PCR扩增的体系为：Taq DNA聚合酶0.05U/μl、1×Taq缓冲液、氯化镁1.5mM、 dNTPs 200μM、上游引物和下游引物的浓度分别为0.5μM、DNA模板浓度为 0.17×10^-5~0.2ng/ul，加ddH₂O至20μl。

所述PCR扩增的程序为：94℃预变性3分钟；然后进行30个循环：94℃变性1分钟、 59℃退火45秒、72℃延伸110秒；最后72℃延伸10min。

用于检测B型烟粉虱和Q型烟粉虱的试剂盒，其特征在于包括一对PCR引物：

上游引物Bt-F：5’-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’，

下游引物Bt-R：5’-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’；

还包括用于PCR检测的试剂：Taq DNA聚合酶、dNTPs、氯化镁、Taq DNA聚合酶缓冲 液和无菌水。

所述PCR引物预混于PCR预混体系中，所述PCR预混体系如下：Taq DNA聚合酶 0.05U/μl、1×Taq缓冲液、1.5mM氯化镁、200μM dNTPs、上游引物和下游引物分别0.5μM 和无菌水。

本发明采用OPA、OPB、OPC系列，每个系列包含20条共60条RAPD随机引物对分别 供试虫源的DNA进行PCR扩增。扩增结果中发现一条随机引物能够扩增出Q型烟粉虱的特 异性条带（核苷酸序列如Seq ID No.1所示），该条带在B型烟粉虱的扩增产物中没有出现。 通过分离并测序该条带，并基于该条带设计Q型烟粉虱特异性SCAR引物，在设计出的引物 中发现一对特异性引物在B型和Q型烟粉虱中都扩增出特征条带。经田间特异性验证，该对 特异性引物在B型和Q型烟粉虱中能稳定扩增出特征带型，而在其它亚类型的烟粉虱中扩增 不出条带。

本发明基于该对特异性引物，提供用于检测B型烟粉虱和Q型烟粉虱的PCR方法和试 剂盒，这样仅进行一次PCR扩增即可通过对扩增谱带的识别同时快速判定B型烟粉虱和Q 型烟粉虱，从而显著缩短了烟粉虱生物型的判定技术，也节约了成本，是其分子鉴定技术上 的一大改进，该技术改进为烟粉虱不同生物型的分布和识别进行快速检测提供了更简便的方 法，更适宜于田间大批量的样品测试。

附图说明

图1OPA-17对三种烟粉虱的PCR扩增结果

（M：200bp ladder；1-5：Q型烟粉虱；6-10：B型烟粉虱；11-15： 温室白粉虱；16：空白；）

图2特异性SCAR引物在不同粉虱种类中的PCR扩增结果

（M：200bp ladder;1-2：Q型烟粉虱；3-4：B型烟粉虱；5-6：温室白 粉虱；7-8：桔绿粉虱；9-10：黑刺粉虱；11-12：ZJ-2型烟粉虱）

图3SCAR引物对单头Q型烟粉虱成虫DNA及其不同浓度下扩增结果

（M：200bp Marker；1：单头Q型烟粉虱基因组DNA原液3.4ng/μl；2：DNA稀释10¹倍；3：DNA稀释10²倍；4：DNA稀释10³倍；5：DNA稀释10⁴倍；6：DNA稀释10⁵倍。）

图4特异性引物对扩增田间9个烟粉虱种群的检测结果

（M:MarkerⅡ；其它泳道依次为山东、浙江、山西、河南、上海、江西、海南、天津和河 北种群）

图5特异性引物对扩增田间9个烟粉虱种群的检测结果

（M：MarkerⅡ；其它泳道依次为广东、安徽、北京、长沙、广西、辽宁、新疆和甘肃种群）

具体实施方式

以下通过具体实验过程和实验结果说明本发明：

生物材料

B型烟粉虱和Q型烟粉虱饲养于中国农业科学院蔬菜花卉研究所，从2009年饲养至今， 寄主植物分别为甘蓝、一品红，种群维持饲养期间不使用任何农药；

桔绿粉虱采集自中国农业科学院院内,记载的已知文献为：刘循，万方浩，张桂芬，2009， 昆虫学报，52(8):895-900。

温室白粉虱、黑刺粉虱和浙江省本地烟粉虱种群ZJ-2型由中国农业科学院植物保护研究 所张桂芬研究员提供；记载的已知文献为：刘循，万方浩，张桂芬，2009，昆虫学报，52(8): 895-900。

供试的田间种群为2011年采集自中国不同地区和寄主上的粉虱类害虫成虫，以上供试种 群根据粉虱成虫的形态特征初步判断其种类或者是否为烟粉虱，其中的烟粉虱样品首先采用 mtCOI基因扩增和序列比对（罗晨等，2002）来确定其生物型，部分种类也同时采用Shatters 等（2009）公开发表的B型和Q型烟粉虱各自的引物对来鉴定其生物型，之后作为本研究中 的验证用材料。

生物材料发放声明：

以上供试昆虫均为目前文献中记载过的或者公知的烟粉虱不同生物型或不同种类，本领 域技术人员可以通过采集和常规验证方法获得，本实验室也有保存，可自申请日起20年内向 公众发放用于验证试验。

随机引物采用Operon公司的RAPD通用引物系列，采用OPA、OPB、OPC系列，每个 系列包含20条引物，随机引物和特异性引物分别由上海英竣生物工程公司合成和北京擎科生 物工程公司合成。

序列测序由北京擎科生物工程公司进行。

PCR扩增中使用的聚合酶为2×Taq10MASTER Mix(0.1U TaqE/μl)购自奥赛博科技发展 有限公司。

粉虱害虫的基因组DNA提取试剂盒和克隆试剂盒分别购自北京百泰克生物技术有限公 司和北京全式金生物技术有限公司。

实施例1RAPD扩增筛选特异性随机引物

2.1单头粉虱害虫DNA提取

基因组DNA的提取采用DNA提取试剂盒（北京百泰克生物技术有限公司，溶液型）， 方法参照试剂盒说明书进行。

具体操作如下：将单头烟粉虱成虫置于滴有10μl的细胞裂解液（试剂盒提供）的Parafilm 膜上，以0.2ml的PCR管的底部作为匀浆器充分研磨，用另20的裂解液清洗匀浆器2次， 合并混匀；然后以微量移液器移入1.5ml离心管；加入蛋白酶K，2μl，混匀，55℃，水浴4 小时或者过夜；离心几秒，加入RNase A2.5μl（10μg/μl），置于37℃烘箱15-30min；取出上 述样品，晾至室温，加入蛋白沉淀液25μl，漩涡振荡器上高速震荡25s；冰浴5min，沉淀蛋 白；室温离心，13000r/min，离心5min；小心吸取上清液到另一个新管中（不要吸入沉淀）； 加入等体积的异丙醇50μl，颠倒混匀30次；室温离心，12000r/min，离心10min，弃上清； 加入1ml 70%乙醇颠倒漂洗DNA沉淀，室温离心，12000r/min，离心2min，弃上清；加入 1ml无水乙醇颠倒漂洗DNA沉淀，室温离心，12000r/min，离心2min，弃上清；加入20μl DNA 溶解液，溶解DNA65℃，水浴60min，放于-20℃保存备用。

2.2RAPD扩增

应用RAPD扩增技术，以上述材料与方法中的供试样品的DNA为模板，采用60条随机 引物分别进行PCR扩增，记录筛选出来的特异条带以及相应扩增引物，并对这些条带进行标 记。

扩增总体积为20μl，分别包含10μl2×Taq10MASTER Mix（其中包括Taq DNA Polymerase  0.1U/μl、2×Taq PCR Buffer、3mM MgCl₂和400μM dNTP mix）、DNA模板1μl、10mM的 RAPD引物3μl和6μl dd H₂O。

PCR反应程序为：首先进行94°C预变性4min，之后进行40个循环，包括94°C1min， 37°C退火50s，72°C延伸1min35s，最后72°C延伸10min。

2.3特异性扩增产物回收克隆

RAPD扩增中，发现OPA-17引物扩增时，在Q型烟粉虱出现一条很亮的扩增条带，大 小约为721bp（图1中箭头所示），但在B型烟粉虱中未见到该条带的出现。在温室白粉虱 种类中也未出现，见图1。

在琼脂糖凝胶电泳上回收该特异性条带，采用DNA纯化试剂盒（北京百泰克）进行纯 化，之后把该纯化片段连接到pEASY-T载体（北京全式金）上，转化到TOP10感受态细胞， 37°C条件下倒置培养过夜，挑取白色阳性克隆，加入LB液体培养基中37°C过夜振荡培养， 最后采用北京百泰克生物技术有限公司的质粒提取试剂盒提取质粒，阳性质粒采用特异性引 物扩增验证后，送北京交擎科生物工程有限公司进行测序。

从图1可知，Q型烟粉虱的特异性扩增片段为721bp，回收克隆后测定其序列如Seq ID No.1所示。

2.4特异性SCAR引物的设计及验证

基于Q型烟粉虱在RAPD扩增中出现的特异性条带Seq ID No.1，采用PrimerPremier5.0 软件设计SCAR特异性引物，其中一对特异性引物如下：

Bt-F（5’-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’）；

Bt-R(5’-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’)，

采用该引物对Q型烟粉虱进行特异性PCR扩增验证，以其它粉虱种类（B型烟粉虱、温 室白粉虱、黑刺粉虱、桔绿粉虱及ZJ-2型烟粉虱）作为对照种群。

本发明中优化的PCR扩增条件和扩增程序如下：

反应体系设定为20μl，其中2×Taq10MASTER Mix（其中包括TaqDNAPolymerase  0.1U/μl，2×Taq PCR Buffer，3mM MgCl₂和400μM dNTP mix）为10μl，上游引物和下游引 物（10μM）分别为1μl，DNA模板为1μl，ddH₂O为7μl。

优化的反应程序如下：94℃预变性3min，之后进行30个循环（94℃变性1min，59℃退 火45sec，72℃延伸1min50sec），最后72℃延伸10min。反应结束后，吸取PCR产物5μl进 行琼脂糖凝胶电泳检测。

PCR扩增结果显示：在Q型烟粉虱中出现一条507bp的特异性条带（见图2中1-2号泳 道）；而在B型烟粉虱中出现两条带，大小约为507bp和660bp（见图2中3-4号泳道），而 作为对照的其他粉虱种类中均未出现任何条带，见图2。

2.5特异性引物对田间烟粉虱种群的特异性和稳定性验证

利用采自全国各地田间的不同种群验证引物对的特异性和稳定性，采集的种群先采用 mtCOI基因扩增并经序列测定后确定其生物型或者种类，详细信息见下表。

验证试验中采用的田间烟粉虱种群的采集信息

特异性验证的PCR程序和体系同2.4中的记载。

扩增结果见图4和图5。

结果表明，Q型烟粉虱中出现一条很强的单一条带，而B型烟粉虱中出现两条条带，即 对采集自田间的18个烟粉虱田间种群生物型的验证结果与以mtCOI结合测序分析后的生物 型验证结果一致，说明该特异性引物的扩增重复性和稳定性很强，适合于田间烟粉虱种群的 生物型快速检测。

2.6特异性引物对Q型烟粉虱的灵敏度检验

由于引物对在Q型烟粉虱中扩增出一条DNA片段，因此采用Q型烟粉虱来检验引物对 扩增的灵敏度。

将单头Q型烟粉虱的基因组DNA浓度为3.4ng/μl，依次梯度稀释之后，采用2.4的扩增程序 和取样方式进行扩增和检测，结果发现DNA模板稀释10⁵倍时未见扩增条带，见图3，表明该 SCAR引物对具有很高的扩增灵敏度，可以达到pg级。

综上本发明筛选出来的特异性引物对（Bt-F（5’-TCT CAT CGG TGT CTTATT G-3’）和 Bt-R(5’-CTT CGG GTC GTT TCT CGT-3’)可以根据扩增谱带的差异准确鉴别B型烟粉虱和 Q型烟粉虱，且该SCAR标记的灵敏度高，可以在单头Q型烟粉虱成虫的基因组DNA浓度 为3.4ng/μl时稀释10000倍后进行PCR扩增，仍能成功检出很强的、单一的预期特异性条带， 说明该特异性SCAR引物具有很高的灵敏度，扩增灵敏度可达到pg级别。引物对可同时鉴别 B型和Q型烟粉虱实现了更大程度的快速和节约时间与成本，属于技术的改进。对于检测室 内及田间的B型和Q型烟粉虱种群均表现出很强的特异性和适用性，因此可直接用于田间烟 粉虱种群的大批量快速检测。