一种石灰岩高效侵蚀细菌苏云金芽孢杆菌NL-11及其应用

摘要

本发明公开了一种石灰岩高效侵蚀细菌苏云金芽孢杆菌NL-11及其应用，该石灰岩高效侵蚀细菌的分类命名为苏云金芽孢杆菌（

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种石灰岩高效侵蚀细菌苏云金芽孢杆菌NL-11及其应用。

背景技术

客土喷播技术是将植物种子和生长基质材料的混合物均匀、高压喷播在岩土坡面上的绿化技术。该技术主要是针对岩石等硬质边坡研发的一种绿化技术。目前已广泛应用于水利、公路、铁路等工程的坡面绿化中。但是，该技术针对于岩坡实现绿化必须具备两个条件：一是岩面上有植物赖以持续生长的种植基质；二是种植基质能长久固定在岩面上，抗风吹、暴雨和流水的冲蚀。然而在实际工程中，目前的客土喷播技术，难以解决上述两个技术难题，喷播基质难以长久的维持在岩石坡面上，使得这一技术的利用受到很多的限制。显然喷播基质已经成为岩石边坡客土喷播技术的核心内容，这种基质不仅要求提供适宜护坡植被生长的土壤性质，还要求具有粘着在岩石坡面上的粘结功能，与坡面实现完全长久的融合。

岩石侵蚀微生物菌群能加速岩石的土壤化进程，快速形成适应植物生存所需的土壤，模拟自然生态环境，促进岩石侵蚀成土的演替，为植物生长源源不断地提供营养成分。在岩石侵蚀微生物菌群的作用下，在岩体和喷播基质间形成了一个界面——生育基盘。这种生育基盘，既解决了岩面上植物赖以持续生长的种植基质问题（包括提供营养元素），也解决了种植基质能永久固定在岩面，实现岩面和种植基质的融合，促进了种植基质和岩石的物质循环。显然，筛选高效岩石侵蚀微生物菌株是客土喷播覆绿技术长期维持和广泛应用的关键。目前，国内针对不同岩石，筛选适宜的高效岩石侵蚀微生物菌株还未见报道。

发明内容

发明目的：针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种石灰岩高效侵蚀细菌苏云金芽孢杆菌NL-11，为岩石高效侵蚀微生物菌库的建立提供菌种支持。本发明的另一目的是提供上述石灰岩高效侵蚀细菌苏云金芽孢杆菌NL-11的应用。

技术方案：为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

一种石灰岩高效侵蚀细菌，其分类命名为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）NL-11，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012453，保藏日期：2012年11月9日；保藏地址：中国武汉武汉大学。

所述的苏云金芽孢杆菌在侵蚀岩石中的应用。

所述的岩石为石灰岩石。

苏云金芽孢杆菌NL-11，是从南京市幕府山裸露岩壁（其为石灰岩，主要由CaCO₃组成，富含Ca）表面筛选获得的，能加速石灰岩石中Ca、Mg、K、P等元素释放。

苏云金芽孢杆菌NL-11菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨固体培养基上28℃条件下培养，营养体细胞为杆状，较为粗壮，革兰氏染色阳性，有芽孢。

苏云金芽孢杆菌NL-11菌株16S rDNA基因序列，见SEQ ID No.1所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，苏云金芽孢杆菌NL-11菌株与Bacillus thuringiensis strain GL88的相似度为100%。结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）。

有益效果：与现有技术相比，本发明筛选出的高效侵蚀岩石菌株苏云金芽孢杆菌NL-11，对石灰岩有很强的侵蚀能力，能促进岩石中Ca、Mg等主要离子的释放，加速石灰岩侵蚀成土；同时兼有很强的解K、P的潜能；能降低喷播基质容重，增强喷播基质的抗冲性和抗剪性，具有很好的应用开发前景。

附图说明

图1是幕府山裸露岩壁上的采样菌落图；

图2是牛肉膏蛋白胨固体培养基上的苏云金芽孢杆菌NL-11菌落图；

图3是苏云金芽孢杆菌NL-11发酵培养15d，加菌发酵液与不加菌对照的可溶性Ca、Mg的比较结果图；

图4是苏云金芽孢杆菌NL-11发酵培养15d，加菌发酵液与不加菌对照的可溶性K、P的比较结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1菌株的获得和鉴定：

采集石灰岩（江苏省南京市幕府山）裸岩表面的菌落（见图1），采用稀释平板法，在28℃培养箱中，以筛选培养基（5g蔗糖，2g Na₂HPO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.005g FeCl₃，0.1g CaCO₃，1g 石灰岩石粉（清洗过的幕府山岩石，过200目筛，主要相关化学成分见表1），18g 琼脂粉，1000mL 蒸馏水）培养48h左右，挑取单菌落，反复划线纯化，并将所得菌株分别接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基斜面上，4℃冰箱保存，获得纯菌株。该菌株主要生物学特征：在牛肉膏蛋白胨固体培养基上28℃条件下培养（见图2），营养体细胞为杆状，较为粗壮，革兰氏染色阳性，有芽孢。

表1 幕府山石灰岩的主要相关化学成分

成分CaOMgOP₂O₅K₂O含量（%）50.024.170.680.31

用接种环取少量纯菌株接种于装有50mL筛选培养基（培养基同上，不加琼脂粉）的250mL三角瓶中，28℃，180r/min 震荡培养72h。按照常规方法，提取菌株DNA测序。得16S rDNA基因序列，见SEQ ID No.1 所示。将所测16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列进行BLAST比对。结果表明，该菌株与Bacillus thuringiensis strain GL88的相似度为100%。结合形态、生理生化特征及16S rDNA序列分析，鉴定为苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）NL-11。

实施例2菌株的石灰岩侵蚀能力：

用接种环取少量纯菌株接种于装有50mL筛选培养基（培养基同上，不加琼脂粉）的250mL三角瓶中，28℃，180r/min震荡培养72h，得到活化菌种。

取上述菌液2mL，接种于装有50mL发酵培养基（15g蔗糖，0.2g MgSO₄·7H₂O，0.1g CaSO₄·2H₂O，0.2g NaCl，0.2g 酵母膏，0.5g (NH₄)₂SO₄，10g石灰岩石粉，蒸馏水 1000mL，pH 7.0~7.5）的250mL三角瓶中，25℃，180r/min震荡培养。

发酵培养第15d，将菌悬液倒入灭菌的离心管中，4℃，5000r/min 离心10min，用无菌注射器吸取上清液，经细菌过滤器（滤膜孔径为0.22um）过滤后得到无菌滤液。

取上述无菌滤液20mL加3滴浓硝酸酸化后，利用ICP Optima 4300DV（美国）测试溶液中可溶性Ca、Mg、K、P浓度。苏云金芽孢杆菌NL-11对岩石的侵蚀结果如图3、图4和表2所示，与不加菌的对照相比，加菌后发酵液中可溶性Ca、Mg、K、P浓度分别是不加菌对照的2.9、3.5、3.3、9.3倍。

按照解钾率(%)={[(菌液中钾含量－对照液中钾含量)×菌液体积]÷(岩石粉量×岩石粉钾含量)}×100%计算其解钾率为33.82%。

由于目前国内尚无细菌对岩石侵蚀能力的评价标准，一方面本发明参照丁丽君等（2009年）关于岩石微生物对碳酸盐岩石的风化作用研究等有关文献及其本发明的实验数据，确定细菌对于石灰岩的主要元素Ca等释放到培养液中的浓度是不加菌对照的2倍以上，即确定为石灰岩的高效侵蚀菌株；另一方面，依据农业部关于硅酸盐细菌生产菌种标准的要求，解钾能力≥20%的菌株为高效解钾菌株；同时依据郝晶等（2006年）关于高效解磷细菌菌株的分离、筛选等资料，确定培养液中P的浓度是不加菌对照的8倍以上，即为高效解磷菌株。可见，该株菌对石灰岩有很强的侵蚀能力，能促进岩石中Ca等主要离子的释放，加速石灰岩侵蚀成土；同时兼有很强的释放岩石粉中K、P的能力，是很有应用前景的高效石灰岩侵蚀、高效解钾和高效解磷细菌菌株。

表2 苏云金芽孢杆菌NL-11对石灰岩的元素释放

处理钙（mg/L）镁（mg/L）钾（mg/L）磷（mg/L）加菌465.43111.5112.5611.41对照160.4232.253.861.23

注：P＜0.05。

实施例3  菌株对喷播基质的影响：

将菌株活化后（方法同实施例2），按照100mL/kg拌入喷播基质（林地土壤，添加腐植酸有机肥 25%、石灰岩石粉（过100目筛）4%、喷播木纤维 0.3 %、保水剂 0.3 %、绿化喷播粘合剂 0.03%），对照则在喷播基质中拌入相同体积的培养基，进行上盆试验（盆钵直径17cm，深15cm），置于25℃温室中，保持喷播基质湿润。4个月后，采用环刀法测试喷播基质容重；采用CC索波夫斯基抗冲仪测定喷播基质抗冲性；采用土壤剪力测定仪测定喷播基质抗剪性。

土壤容重反映土壤的质地、结构及肥力等综合物理状况，直接影响土壤的蓄水透水性能和通气性能。由表3可知，加菌喷播基质的容重为对照的86.73%。加菌降低了基质容重，有利于提高基质的透水通气性能。

土壤抗冲性是指土壤抵抗径流的机械破坏和推动下移的能力，表征土壤抗侵蚀能力的强弱。由表3可知，加菌喷播基质的抗冲指数较对照提高了8.14%。

土壤的抗剪强度反映了土体的稳定性。抗剪能力强，说明土壤稳固性好，能提高坡体的稳定性；反之，土壤稳固性差，边坡容易失稳。由表3可知，加菌喷播基质的抗剪强度较对照提高了17.56%。

表3  苏云金芽孢杆菌NL-11对喷播基质的影响

处理容重（g/cm³）抗冲指数抗剪强度（kPa）加菌0.851.8685.7对照0.981.7272.9

注：P＜0.05。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  南京林业大学 广州中茂园林建设工程有限公司

 

<120>  一种石灰岩高效侵蚀细菌苏云金芽孢杆菌NL-11及其应用

 

<130>  100

 

<160>  1    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  1419

<212>  DNA

<213>  Bacillus thuringiensis

 

<400>  1

taggcggctg gctccaaaaa ggttacccca ccgacttcgg gtgttacaaa ctctcgtggt     60

 

gtgacgggcg gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat    120

 

tactagcgat tccagcttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaacggt    180

 

tttatgagat tagctccacc tcgcggtctt gcagctcttt gtaccgtcca ttgtagcacg    240

 

tgtgtagccc aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt    300

 

tgtcaccggc agtcacctta gagtgcccaa cttaatgatg gcaactaaga tcaagggttg    360

 

cgctcgttgc gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca    420

 

cctgtcactc tgctcccgaa ggagaagccc tatctctagg gttttcagag gatgtcaaga    480

 

cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc    540

 

ccccgtcaat tcctttgagt ttcagccttg cggccgtact ccccaggcgg agtgcttaat    600

 

gcgttaactt cagcactaaa gggcggaaac cctctaacac ttagcactca tcgtttacgg    660

 

cgtggactac cagggtatct aatcctgttt gctccccacg ctttcgcgcc tcagtgtcag    720

 

ttacagacca gaaagtcgcc ttcgccactg gtgttcctcc atatctctac gcatttcacc    780

 

gctacacatg gaattccact ttcctcttct gcactcaagt ctcccagttt ccaatgaccc    840

 

tccacggttg agccgtgggc tttcacatca gacttaagaa accacctgcg cgcgctttac    900

 

gcccaataat tccggataac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt    960

 

tagccgtggc tttctggtta ggtaccgtca aggtgccagc ttattcaact agcacttgtt   1020

 

cttccctaac aacagagttt tacgacccga aagccttcat cactcacgcg gcgttgctcc   1080

 

gtcagacttt cgtccattgc ggaagattcc ctactgctgc ctcccgtagg agtctgggcc   1140

 

gtgtctcagt cccagtgtgg ccgatcaccc tctcaggtcg gctacgcatc gttgccttgg   1200

 

tgagccgtta cctcaccaac tagctaatgc gacgcgggtc catccataag tgacagccga   1260

 

agccgccttt caatttcgaa ccatgcagtt caaaatgtta tccggtatta gccccggttt   1320

 

cccggagtta tcccagtctt atgggcaggt tacccacgtg ttactcaccc gtccgccgct   1380

 

aacttcttga gagcaagctc tcaatccatt cgctcgact                          1419