一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂

摘要

本发明公开了一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，筛选出鸭乙肝病毒Core区最大一致性的保守区核酸序列，以此为模板，设计、合成引物和荧光探针。构建pGEM-T/DHBV Core重组质粒，制备PCR标准品。通过优化反应体系和扩增条件。本发明提供的实时荧光定量PCR检测方法具有通用性强、灵敏度高、特异性强、重复性好等优点，适于不同地区、不同鸭种的DHBV DNA的检测。

说明书

技术领域

本发明属于鸭乙型肝炎病毒检测技术领域，涉及一种鸭乙型肝炎病毒的 荧光定量PCR检测方法及试剂。

背景技术

1980年Mason等从家养的北京鸭体内发现鸭乙型肝炎病毒（Duck  Hepatitis B Virus，DHBV），DHBV属于禽嗜肝DNA病毒，其嗜肝性、毒粒 形态、结构和基因复制等方面与HBV很相似，目前，感染DHBV的北京麻 鸭已成为HBV复制、感染机制研究与治疗策略评估的重要实验动物模型]。 DHBV DNA的定量检测成为应用此模型的一个重要指标，以往多采用 Southern blot杂交、斑点杂交等方法对DHBV DNA进行定量，由于这些方法 灵敏度较低、稳定性差、操作复杂，已被定量PCR方法取代。但是，由于缺 乏标准的实验动物和统一、通用的DHBV DNA定量检测方法，各地研究者 往往选择本地麻鸭感染的DHBV，针对DHBV基因的不同区域建立检测方 法。由于不同地区、不同鸭种感染的DHBV基因存在差异，造成了研究者实 验结果缺乏可比性，借鉴已有方法也存在不确定性。

既往研究针对DHBV的P基因或S基因设计引物，建立DHBV PCR检 测方法，缺乏通用性，因为DHBV有不同的亚型，编码外膜蛋白和聚合酶蛋 白的S基因和P基因容易变异。

发明内容

本发明解决的问题在于提供一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测 方法及试剂，该方法适于不同地区、不同鸭种的定量检测，具有灵敏度高、 特异性强的特点。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，包括以下操作：

1）以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提 取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引 物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增；

所述的上游引物为：ggactcgaac ctagaaga；

所述的下游扩增引物为：ttatttccta ggcgaggg；

所述的检测探针为：accacagttg tctatgggag aag；

2）在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧 光信号；

3）根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲 线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型 肝炎病毒的含量。

所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基 因序列克隆到pGEM-T载体中。

所述的DHBV Core区基因序列的获得为：

以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物F1和下游引物R1进行PCR 扩增，所述的上游引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；

下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag。

所述的待检品的获取为：

血清中加入其体积1～2倍的DNA提取液，充分混匀，100℃煮沸5～ 15min，4℃放置过夜，离心取上清液，得到待检品；

所述的DNA提取液包括0.1～0.5mol/L的NaOH、2～2.5mol/L的NaCl、 以及质量浓度为0.5～1.0%的SDS。

所述的扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP，10～ 20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～100mM， 下游扩增引物25～100mM，检测探针5～20mM，作为模板的标准品或待检 品的体积分数为10～20%。

所述的扩增体系为25μl，包括：

2×HotStart Taq PCR MasterMix12.5μl，包括：0.1UHotStart Taq  Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl、pH8.3，100mM KCl和 3mM MgCl₂；

上游引物0.5μl、50mM；

下游扩增引物0.5μl、50mM；

检测探针0.5μl、10mM；

DEPC-H₂O9μl；

标准品或待检品2μl。

所述的荧光标记物为FAM，其对应的检测波长为490nm。

所述的扩增程序为：94℃预变性2min；94℃15s，49℃30s，72℃30s； 40个循环。

一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，包括标准品和PCR扩 增体系；

所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基 因序列克隆到pGEM-T载体中；

所述的PCR扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP， 10～20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～ 50mM，下游扩增引物25～50mM，检测探针5～10mM，作为模板的标准品 或待检品的体积分数为10～20%。

所述的pGEM-T/DHBV Core重组质粒中的DHBV Core区基因是以以上 游引物F1和下游引物R1对DHBV Core区基因进行PCR扩增，所述的上游 引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；

下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag；

所述的扩增体系为25μl，包括：

2×HotStart Taq PCR MasterMix12.5μl，包括：0.1UHotStart Taq  Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl、pH8.3，100mM KCl和 3mM MgCl₂；

上游引物0.5μl、50mM；

下游扩增引物0.5μl、50mM；

检测探针0.5μl、10mM；

DEPC-H₂O 9μl；

模板2μl。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明提供的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，针对C 基因设计诊断PCR的引物与探针。由于DHBV核心抗原稳定性强，免疫原 性强，编码核心蛋白的C基因不易变异，具有高保守性，因此，针对C基因 设计诊断PCR的引物与探针可以避免S基因和P基因容易变异的缺陷，所建 立的PCR方法具有通用性。

本发明提供的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法及试剂，所设计 的引物及检测探针与多达44条序列逐一进行了比较，使所设计的引物与44 条序列最大程度的匹配，使引物与DHBV序列尽可能的吻合。从而保证了能 够最全面的检测世界各地不同基因型和不同鸭种感染的DHBV病毒。

本发明提供的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，是一种通用性 强、灵敏度高、特异性强、重复性好，适于不同地区、不同鸭种的DHBV DNA 的Taqman实时荧光定量PCR方法。

附图说明

图1为重组质粒pGEM-T/DHBV Core酶切鉴定；其中，泳道1为重组质 粒pEGM-T/DHBV Core，泳道2为pEGM-T/DHBV core重组质粒BamH I和 XhoI双酶切，泳道3为DNA marker；

图2为PCR扩增产物电泳图，其中，泳道1为DNA marker，泳道2为 PCR扩增产物；

图3为FQ-PCR标准品扩增曲线；

图4为标准品回归曲线；

图5为ABI7300与Bio-RAD IQ5检测结果相关性分析；

图6ABI7300与Bio-RAD IQ5检测结果差值与均值分布图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明 的解释而不是限定。

本发明提供的一种鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，包括以下 操作：

1）以包含DHBV Core基因片段的质粒载体作为标准品，以鸭血清中提 取到的DNA为待检品；分别以标准品和待检品为模板，在包含上游扩增引 物、下游扩增引物和连接有荧光标记物的检测探针的扩增体系中进行扩增；

所述的上游引物为：ggactcgaac ctagaaga；

所述的下游扩增引物为：ttatttccta ggcgaggg；

所述的检测探针为：accacagttg tctatgggag aag；

2）在扩增结束后，分别采集标准品和待检品的扩增产物荧光标记物的荧 光信号；

3）根据标准品的扩增产物的荧光信号与质粒载体的对应关系建立标准曲 线，然后根据待检品的荧光信号在标准曲线上的位置，确定待检品中鸭乙型 肝炎病毒的含量。

具体的，所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV  Core区基因序列克隆到pGEM-T载体中。

所述的DHBV Core区基因序列的获得为：

以pBR322/2DHBV质粒为模板，以上游引物F1和下游引物R1进行PCR 扩增，所述的上游引物F1为：gggatccata tcaatgcttc tag；

下游引物R1为：gctcgagtta tttcctaggc gag。

所述的扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP，10～ 20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～100mM， 下游扩增引物25～100mM，检测探针5～20mM，作为模板的标准品或待检 品的体积分数为10～20%。

相应的鸭乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测试剂，包括标准品和PCR 扩增体系；

所述的标准品为pGEM-T/DHBV Core重组质粒，是将DHBV Core区基 因序列克隆到pGEM-T载体中；

所述的PCR扩增体系包括0.05～0.1U的聚合酶、250～500μM的dNTP， 10～20mM Tris-HCl，50～100mM KCl、1.5～3mM MgCl₂，上游引物25～ 50mM，下游扩增引物25～50mM，检测探针5～10mM，作为模板的标准品 或待检品的体积分数为10～20%。

下面以具体的实施例对各部分进行详细的说明。

实施例1：鸭乙肝病毒荧光定量PCR诊断方法引物、探针的设计

在GenBank中共检索到44条鸭乙肝病毒全基因组序列，分别来自中国 （包括北京、湖北、上海、重庆、四川、桂林、河南、广东等地）和外国（美 国、德国、印度、加拿大、南非、澳大利亚等），通过DNASIS软件比较， 各地DHBV基因序列存在很多差异，而不同地区报道的Core区序列 bp241-414处序列基本一致，两两比较一致率最小为98%，最高可达100%。

所以，以该区域为模板，设计引物，并将多对引物与所有DHBV Core 区核酸序列匹配，获得最大程度匹配的引物与探针。所设计的引物序列及荧

光探针序列如下：

上游引物F:DHBV bp 256-273 GGACTCGAACCTAGAAGA(Tm值 54℃)，

下游引物R:DHBV bp 397-414 TTATTTCCTAGGCGAGGG(Tm值 54℃)，

荧光探针DHBV-Probe:DHBV bp 286-308(FAM)：

ACCACAGTTGTCTATGGGAGAAG (TAM RA)(Tm值68℃)。

为使引物与44条序列最大程度的匹配，将设计的多对引物进一步与各序 列进行逐一比较，尽可能使获得的引物与发布的DHBV序列吻合，上、下游 引物及探针序列均斜体划线表示，不同的核酸序列大写标注。

检测结果如表1所示，引物、探针与42条DHBV Core基因序列100% 一致，上游引物仅与DQ276978.1有两处差异（bp261C→T,bp270A→G），下 游引物与X12798.1有一处差异（bp397C→A）。因此可以以所设计的引物对 以此区域为模板，建立用于检测DHBV DNA的通用、准确的实时荧光定量 PCR方法。

表1：GenBank所有DHBV全基因组core序列bp241~414展示

实施例2．PCR标准品的制备：

(1)．pGEM-T/DHBV Core重组质粒的构建：以GenBank提供的DHBV Core区基因序列为依据，使用负链延伸原理设计正向及负向引物，并在正负 向引物两端分别加上BamHI与Xhol酶切位点和保护碱基G，序列如下（划 线处为引入的酶切位点）：

F1:GGGATCCATATCAATGCTTCTAG；

R1:GCTCGAGTTATTTCCTAGGCGAG；

PCR扩增pBR322/2DHBV质粒的DHBV Core基因，100μl反应体系如 下：

10×buffe 10μl，10mM dNTP2μl，1U/μl HotStart Taq Polymerase1μl，25mM  MgCl₂ 6μl，50mM F引物1μl，50mM R引物1μl，DEPC-H₂O 77μl，DHBV 质粒（10倍稀释）模板1μl。

PCR扩增条件：首先94℃预变性300s；94℃50s，57℃50s，72℃90s， 30个循环；72℃300s。

将被BamHI与Xhol双酶切的扩增产物与同样被BamHI与Xhol双酶切 pGEM-T载体连接，构建pGEM-T/DHBV Core重组质粒，转化感受态细菌 Top10，质粒DNA提取并鉴定测序。

提取质粒产物经限制性内切酶BamH I和XhoI双酶切后电泳，得到789bp 的片段，如图1所示，结果DHBV Core基因片段成功插入pGEM-T载体， 并将目的片段进行测序，测序结果在GenBank数据库中做BLAST比对分析， 与M60677.1 DHBV complete genes完全相同。

(2)．PCR标准品的制备：

取pGEM-T/DHBV Core重组质粒3μl溶于300μlTE中，检测260nm、280 nm的OD值，计算OD₂₆₀/OD₂₈₀，考察核酸纯度，并计算重组质粒分子量及 DNA拷贝数。

分子量计算：MW=（pGEM-T载体碱基数+DHBV Core区碱基数）×660 道尔顿/碱基。

拷贝数计算：6.02×10²³（拷贝数/摩尔）×（浓度g/ml）/（MWg/mol）= copies/ml。

所提取的质粒pGEM-T/DHBV Core产物，OD₂₆₀=0.273，OD₂₆₀/OD₂₈₀= 1.83，表明DNA纯度完全满足实验要求，pGEM-T/DHBV Core拷贝数为 3.16×10¹⁴copies/ml。

用TE将pGEM-T/DHBV Core重组质粒稀释为1×10¹、1×10²、1×10³、 1×10⁴、1×10⁵、1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹、1×10¹⁰copies/ml作为标准品。

实施例3：FQ-PCR反应体系的优化：

采用矩阵法对引物和探针浓度进行最佳优化筛选，以获得最低的Ct值和 较高的荧光强度。优化PCR扩增条件，荧光信号收集选择FAM（490nm）， 数据采集定在延伸结束时。同机设置阳性对照、阴性对照、空白对照及不同 浓度标准品。

经优化的FQ-PCR25μl反应体系为：

2×HotStart Taq PCR MasterMix12.5μl（包括0.1HotStart Taq  Polymerase/μl，500μM dNTP each，20mM Tris-HCl（pH8.3），100mM KCl， 3mM MgCl2），F引物0.5μl（50mM），R引物0.5μl（50mM），DHBV-Probe0.5μl （10mM），DEPC-H2O 9μl，DHBV模板2μl。

经优化的PCR扩增条件：首先94℃预变性2min，94℃15s，49℃30s， 72℃30s，40个循环。

图2所示为扩增产物电泳图，片段为159bp，与设计完全相符。

由图3可见，阳性反应管的扩增曲线为一条平滑的“S”型曲线，阴性反应 管为水平线。

实施例4：对针对鸭乙肝病毒C基因设计的FQ-PCR方法进行评价：

（1）标准曲线的建立：采用优化的PCR反应条件对制备的标准品进行 PCR扩增，获得标准曲线，评价线性范围。以DHBV DNA标准品实测浓度 的常用对数值（LogC）为横坐标（X），每个反应管内的荧光信号到达设定的 域值时所经历的循环数（CT值)为纵坐标（Y），进行线性回归，回归方程为： Y=-3.9898X+49.086，r²=0.9993，如图4所示，表明在1×10³～ 1×10¹⁰copies/ml范围内线性良好。

（2）灵敏度检测：采用优化条件进行PCR扩增对1×10¹、1×10²、1×10³、 1×10⁴copies/ml的pGEM-T/DHBV Core重组质粒进行定量PCR反应，能检出 的最低模板浓度确定方法的灵敏度。反应体系中加入1×10³、1×10⁴copies/ml 的模板2μl均可得到走势良好的扩增曲线，而加入1×10¹、1×10²copies/ml模 板无法得到良好的扩增曲线，本方法的最低检测下限为1×10³copies/ml。

（3）特异性检测：对DHBV质粒、DHV、HBV、E.coli进行检测，考 察方法的特异性。

以DHV、HBV、E.coli为阴性对照，均未检出DHBV-DNA。而阳性DHBV 质粒均可得到良好的扩增曲线。

（4）重复性检测：根据CLSI EP15-A2原则，对DHBV DNA高中低3 个不同浓度中高浓度（＞10⁸copies/ml）、中浓度（10⁵~10⁷copies/ml）、低浓度 （＜10⁴copies/ml）的鸭外周血DHBV-DNA每天重复3次检测，连续检测5 天，检测结果取对数检测结果如表2所示，计算其批内标准差为0.01~0.06， 批间标准差0.05~0.16，CV值1.3~1.8%，表明其重复性好。

表2DHBV DNA重复测定结果

（5）方法适应性评价：根据CLSI EP9-A原则，用ABI7300与Bio-RAD IQ5荧光定量PCR仪在同样的反应体系和扩增条件下分别检测8个样本，每 个样本重复测定2次，共进行5天，检测结果取常用对数进行不同仪器实验 结果的线性相关分析，和两种仪器检测结果差值的F检验和t检验，评价不 同仪器同一方法结果的正确性和精密度。40个检测结果进行线性相关分析， 回归方程为Y=1.0101X+0.0476，r²=0.9941，表明该方法在两台仪器上的 检测结果相关性良好。两种仪器重复检测结果差值的F检验， Fc=S₁²/S₂²=0.367，p>0.05，表明两仪器检测结果差值呈正态分布且精密度好。 两种仪器重复检测结果平均值的差值的t检验，t_c=0.565，p>0.05，表明两仪 器检测结果无显著性差异。（图5、6所示）

实施例5：西安麻鸭DHBV-DNA感染筛查

血清DHBV-DNA的提取：采用碱裂解法提取血清中DNA，血清50μl 加入50μlDNA提取液(0.1mol/L NaOH，2mol/L NaCl，0.5%SDS)于0.5ml  Eppendorf管中充分混匀，100℃煮沸10分钟，4℃条件放置过夜，10000rpm 离心5min，取上清液2μl加入PCR反应管中进行扩增。PCR反应体系及扩 增条件如上所述。

对80份西安麻鸭血清DHBV进行检测，结果显示血清中DHBV-DNA 含量范围1×10³~1×10⁹copies/ml，阳性检出率可达63.75%（51/80），其中血 清中病毒含量超过1×10⁸copies/ml的占30%（24/80）。在51例阳性麻鸭体内 病毒数<10⁴copies/ml的占45.10%（23/51），>10⁸copies/ml的占47.06%（24/51）， 而10⁵~10⁷copies/ml的仅占7.84%（4/51）。