中药复方当归补血汤有效部位及其同步制备方法和应用

摘要

本发明公开了一种中药复方当归补血汤有效部位及其同步制备方法和应用，方法如下：当归和黄芪粉碎；当归粉超临界CO

说明书

技术领域

本发明涉及天然药物的提取分离纯化领域，特别是涉及一种中药复方当归 补血汤有效部位及其同步制备方法和应用。

背景技术

当归补血汤出自金元时代李东垣《内外伤辨惑病论·暑伤胃气论》，其是由 黄芪1两、当归酒洗2钱，即芪归5∶1比例组成的。本方主治血虚发热证，具 有益气生血功效，多用于治劳倦内伤，气血虚，阳浮于外之虚热证，广为应用。 随着现代医学科学技术的渗入，发现其具有免疫促进、保护心肌、改善造血功 能、耐缺氧等作用，其中当归所含阿魏酸、藁本内酯、当归多糖，黄芪中所含 皂苷、黄酮、黄芪多糖为当归补血汤补血的主要有效组分。但传统剂型汤剂对 于很多脂溶性成分难以溶出发挥作用，且煎煮和携带都不方便，不利于此方的 临床应用和推广。虽然现有技术中存在许多提取当归黄芪的方法，但均是单一 提取，这种单一提取方法造成了资源的浪费，增加了其深加工的成本。

发明内容

基于此，有必要针对上述技术问题，提供一种中药复方当归补血汤有效部 位及其同步制备方法及应用。

解决上述技术问题的技术方案如下：

一种中药复方当归补血汤有效部位的同步制备方法，包括如下步骤：

（1）粉碎：取当归和黄芪，粉碎至10-120目，得当归粉和黄芪粉；

（2）超临界CO₂萃取：取步骤（1）所得的当归粉，超临界CO₂萃取，得 当归挥发油和当归药渣；

所述超临界CO₂萃取的技术参数为：

分离釜Ⅰ温度为40-50℃，萃取釜温度为3-5℃，加压至25-35MPa，调节 CO₂流速为10-14L/h，保持萃取釜的压力和温度，萃取1.5-2.5h；

（3）醇提：将步骤（1）所得的黄芪粉和步骤（2）所得的当归药渣混合， 得混合物，于混合物中按重量体积比为1：6-10添加体积分数为20%-95%的乙 醇溶液，提取1-5次，过滤，合并滤液，并减压浓缩至无乙醇味，得浓缩液；所 述提取的方法为：将混合物浸泡于乙醇溶液中2-3h，再于75-100℃状态下煎煮 1-2h；

（4）柱分离：将步骤（3）所得的浓缩液经300-400目滤网过滤，得滤液， 将滤液依次通过由大孔吸附树脂和阴离子交换树脂组成的压力为0.2-0.8Mpa的 高压串联树脂，收集未吸附液；

（5）洗脱：先用6-10BV的水洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，得多糖溶 液；后用6-10BV的体积分数为20-50%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，收集洗 脱液，得总皂苷溶液；再用6-10BV的体积分数为70-95%的乙醇溶液洗脱大孔 吸附树脂，收集洗脱液，得总黄酮溶液；最后用6-10BV的体积分数为50-70% 的氨乙醇液洗脱阴离子交换树脂，得阿魏酸及其极性相近的成分的溶液；

（6）真空冷冻干燥：先将步骤（4）所得的未吸附液和步骤（5）所得的多 糖溶液混合，得总多糖溶液；再分别将所述总多糖溶液、步骤（5）所得的总皂 苷溶液、总黄酮溶液和总阿魏酸溶液，浓缩，冷冻干燥，即得总多糖粗品、总 皂苷粗品、总黄酮粗品和阿魏酸粗品；

在其中一些实施例中，步骤（2）所述超临界CO₂萃取装置的技术参数为： 分离釜Ⅰ温度为45℃，萃取釜温度为4℃，加压至30MPa，调节CO₂流速为12L/h， 保持萃取釜的压力和温度，萃取2h。

在其中一些实施例中，步骤（5）所述洗脱为：先用10BV的水洗脱大孔吸 附树脂，收集洗脱液，得多糖溶液；后用8BV的体积分数为40%的乙醇溶液洗 脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，得总皂苷溶液；再用8BV的体积分数为80%的 乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，得总黄酮溶液；最后用8BV的体积 分数为60%的氨乙醇液洗脱阴离子交换树脂，得阿魏酸及其极性相近的成分的 溶液。

在其中一些实施例中，步骤（3）所述提取的方法为：将步骤（1）所得的 黄芪粉和步骤（2）所得的当归药渣混合，得混合物，按混合物的重量体积比为 1：6-10添加体积分数为60-95%的乙醇溶液，浸泡2-3h，于温度为78-100℃下 煎煮1-2h，取滤渣，再于所述滤渣中按重量份配比为1：6-10添加体积分数为 20-60%的乙醇溶液，浸泡2-3h，于温度为78-100℃下煎煮1-2h，过滤，合并2 次滤液，并浓缩至无乙醇味，得浓缩液。

在其中一些实施例中，步骤（3）所述提取的方法为：于混合物中按重量体 积比为1：8添加体积分数为70%的乙醇溶液，浸泡2-3h，于温度为80℃下煎煮 2h，取滤渣，再于所述滤渣中按重量体积比为1：8添加体积分数为40%的乙醇 溶液，浸泡2-3h，于温度为80℃下煎煮2h，过滤，合并2次滤液，并浓缩至无 乙醇味，得浓缩液。

在其中一些实施例中，步骤（3）所述减压浓缩中压力为20-100kPa，温度 为20-80℃，时间为20-120min；步骤（6）所述浓缩中真空度为0.06Mpa～ 0.10Mpa、温度为70℃-90℃；所述冷冻干燥中真空度小于20pa，冷冻温度为 -45℃～-60℃。

在其中一些实施例中，步骤（3）所述减压浓缩中压力为60kPa，温度为50 ℃，时间为80min；步骤（6）所述浓缩中真空度为0.8MPa，温度为80℃，浓 缩至初体积的20%为止。

在其中一些实施例中，步骤（4）所述大孔吸附树脂型号为D101、HPD-100、 XDA-5或AB-8；所述阴离子交换树脂型号为D280。

根据上述的同步制备方法制得的中药复方当归补血汤有效部位，总多糖粗 品中总多糖的含量为50-60%、总皂苷粗品中总皂苷的含量为50-60%、总黄酮粗 品中总黄酮的含量为50-68%、阿魏酸粗品中阿魏酸的含量为50-60%。

所述总黄酮主要包括：毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、槲皮素等；所 述总皂苷主要包括黄芪皂苷Ⅰ～Ⅷ、异黄芪皂苷、大豆皂苷等；所述总多糖主要 包括当归多糖AAP、当归多糖APS-1cⅠ、APS-1cⅡ、X-C-3-Ⅲ和X-C-3-IV、葡 萄糖、木糖、甘露糖及鼠李糖等；所述阿魏酸粗品中包括阿魏酸、丁二酸等。

上述制备方法制得的中药复方当归补血汤有效部位在制备治疗贫血、白细 胞减少症、原发性血小板减少性紫癜、痹证或水肿药物中的应用。

一种中药复方当归补血汤有效部位及其同步制备方法及应用具有以下优点 和有益效果：

（1）本发明所述制备方法将大孔树脂和阴离子交换树脂高压串联，可同步 分离总多糖、阿魏酸、总黄酮及总皂苷。

（2）本发明所述制备方法简便，实用，易于工业化生产，同时有效避免了 单一提取所带来的资源浪费，提高了综合利用率，降低了深加工的成本。

具体实施方式

下述各实施例中超临界CO₂萃取装置生产厂家：海安华安超临界设备有限 公司，型号为HA221-40-200；

本发明中总多糖、总皂苷、总黄酮、阿魏酸粗品的含量测定方法如下：

1、总多糖的测定

精密称取120℃减压干燥至恒重的葡萄糖对照品适量，置10mL量瓶中，加 适量蒸馏水溶解后，稀释至刻度，摇匀，制得1mg·mL^-1葡萄糖对照品溶液。精 密取1mg·mL^-1葡萄糖对照品溶液0.0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、 l.0mL，分别置10mL具塞试管中，用纯水补足至lmL，精密加入lmL5%苯酚 试液和5mL浓硫酸后立即置于沸水浴加热15min，取出用冷水冷却至室温，室 温放置10min左右，于488nm处测定吸光度。以吸光度值(A)为纵坐标，浓度(X) 为横坐标作线性回归。

精密称取总多糖提取物样品各3份，每份10mg，置于10mL容量瓶中， 加蒸馏水超声溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述样品1.0mL置10mL容量瓶中， 精密加入lmL5%苯酚试液和5mL浓硫酸后立即置于沸水浴加热15min，取出用 冷水冷却至室温，室温放置10min左右，于488nm处测定吸光度。外标两点法 计算含量。

2、总皂苷的测定

精密称取黄芪甲苷对照品10mg置于10ml容量瓶中，用甲醇溶解，定容至 刻度，制得浓度为1mg/ml的对照品溶液，精密吸取对照品溶液0.05、0.1、0.2、 0.3、0.4、0.5ml，置10ml具塞锥形瓶中，加无水乙醇补足体积至0.5ml，再分 别加8%的香草醛无水乙醇试液0.5ml和72%的冰乙酸5.0ml摇匀，立即放入 62℃恒温水浴中，保温20min后，置冷水浴中冷却至室温，以随行试剂作空白， 于540nm波长处检测吸光度。以吸光度（Y）为纵坐标，黄芪甲苷的浓度（X） 为横坐标，绘制标准曲线。

精密称取总皂苷提取物样品各3份，每份10mg置于10mL容量瓶中，加 甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述样品1.0mL置10mL具塞锥形瓶中， 加8%的香草醛无水乙醇试液0.5ml和72%的硫酸5.0ml摇匀，立即放入62℃ 恒温水浴中，保温20min后，置冷水浴中冷却至室温，以随行试剂作空白，于 540nm波长处检测吸光度，外标两点法计算含量。

3、总黄酮的测定

精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，加乙醇制成每1mL含毛蕊异黄 酮苷0.01mg的对照品溶液。精密称取总黄酮提取物样品10mg置于10mL容量 瓶中，加乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述毛蕊异黄酮苷对照品溶液 和供试品溶液,于200～400nm波长范围内进行光谱扫描，结果其最大吸收波长均 在250nm。最终确定在250nm波长处测定黄芪总黄酮含量。

精密量取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液0.25、0.50、1.0、1.25、2.0、4.0mL， 分别置100mL量瓶中，各加水至刻度，摇匀，以同浓度的乙醇溶液为空白，在 250nm波长处测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标,绘制标准曲线。精 密量取供试品溶液1mL于10mL容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，以同浓度的乙 醇溶液为空白，在250nm波长处测吸光度，外标两点法计算含量。

4、阿魏酸的测定

精密称取阿魏酸标准品10mg于100ml的容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度， 分别吸取10、20、30、40、50μL于具塞试管中，分别加入乙醇90、80、70、60、 50μL使成0.1mL乙醇溶液，各加蒸馏水至lmL,pH10的氨-氯化铵缓冲液2mL, Folin试剂0.5m l,振摇5分钟后加入5%无水碳酸钠1ml,于70℃水浴上加热10 分钟,冷却后用分光光度计在690nm波长处侧定吸收值,以吸收值为纵坐标,阿 魏酸浓度为横坐标绘制标准曲线。

精密称取阿魏酸提取物样品各3份，每份10mg置于10mL容量瓶中，加 乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。取上述样品1.0mL置10mL具塞锥形瓶中， 各加蒸馏水至lmL,pH10的氨-氯化铵缓冲液2mL,Folin试剂0.5m l,振摇5分 钟后加入5%无水碳酸钠1ml,于70℃水浴上加热10分钟,冷却后用分光光度 计在690nm波长处侧定吸收值，外标两点法计算含量。

以下将结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

一种中药复方当归补血汤有效部位的同步制备方法，包括如下步骤：

（1）粉碎：按当归补血汤中芪归的重量份比为5:1称取当归和黄芪，总重 100g，粉碎至10-120目，得当归粉和黄芪粉；

（2）超临界CO₂萃取：取步骤（1）所得的当归粉，采用超临界CO₂萃取 装置进行萃取，当分离釜Ⅰ温度为40℃，萃取釜温度为3℃时，打开CO₂储气 罐，对萃取釜进行加压，至压力为25MPa，调节CO₂流速为10L/h，保持萃取釜 的压力25MPa和温度3℃，萃取1.5h，即得当归挥发油和当归药渣；

（3）提取：将步骤（1）所得的黄芪粉和步骤（2）所得的当归药渣混合， 得混合物，先将混合物于体积分数为60%的乙醇溶液中浸泡2h，再于80℃温度 下煎煮1h，重复提取3次，过滤；药渣再用30%的乙醇溶液于80℃提取2次， 每次1h，过滤，合并提取液，并于压力为20kPa，温度为20℃的条件下，减压 浓缩80min，至无乙醇味，得浓缩液；

（4）柱分离：将步骤（3）所得的浓缩液趁热经300-400目滤网过滤，得澄 清滤液，将滤液依次通过由AB-8大孔吸附树脂和D280阴离子交换树脂组成的 两节压力为0.2Mpa的高压串联树脂，完成上样，并收集未吸附液，其中，上样 量为原料（重量g）：树脂（重量g）=1:1，流速为1/10BV/min；

（5）洗脱：先用6BV的水洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，即得多糖溶液； 再用6BV的体积分数为30%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，即得 总皂苷溶液；再用6BV的体积分数为70%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，收集 洗脱液，即得总黄酮溶液；再用6BV的体积分数为50%的氨乙醇液洗脱阴离子 交换树脂，得阿魏酸及其极性相近成分的溶液；

（6）真空冷冻干燥：先将步骤（4）所得的未吸附液和步骤（5）所得的多 糖溶液混合，得总多糖溶液；再将所述总多糖溶液、步骤（5）所得的总皂苷溶 液、总黄酮溶液和阿魏酸及其极性相近的成分的溶液，于真空度为0.09Mpa，温 度80℃条件下浓缩至初体积的20%为止，得浓缩液；将所得浓缩液于真空度为 18pa，温度为-45℃冷冻干燥，即得总多糖粗品、总皂苷粗品、总黄酮粗品和阿 魏酸粗品。

经检测，本实施例中当归挥发油58%、总多糖粗品中总多糖的含量为53%、 总皂苷粗品中总皂苷的含量为54%、总黄酮粗品中总黄酮的含量为63%、阿魏 酸粗品中阿魏酸的含量为54%。

实施例2

一种中药复方当归补血汤有效部位的同步制备方法，包括如下步骤：

（1）粉碎：按当归补血汤中芪归的重量份比为5:1称取当归和黄芪，总重 1kg，粉碎至10-120目，得当归粉和黄芪粉；

（2）超临界CO₂萃取：取步骤（1）所得的当归粉，采用超临界CO₂萃取 装置进行萃取，当分离釜Ⅰ温度为45℃，萃取釜温度为4℃时，打开CO₂储气 罐，对萃取釜进行加压，至压力为30MPa，调节CO₂流速为12L/h，保持萃取釜 的压力30MPa和温度4℃，萃取2h，即得当归挥发油和当归药渣；

（3）提取：将步骤（1）所得的黄芪粉和步骤（2）所得的当归药渣混合， 得混合物，于混合物中按重量体积比为1：8添加体积分数为70%的乙醇溶液中 浸泡2h，再于80℃温度下煎煮2h，过滤，再于滤渣中按重量体积比为1：8添 加体积分数为40%的乙醇溶液中浸泡2h，于80℃温度下煎煮2h，过滤，合并2 次滤液，并于压力为60kPa，温度为50℃的条件下，减压浓缩80min，至无乙醇 味，得浓缩液；

（4）柱分离：将步骤（3）所得的浓缩液趁热经300-400目滤网过滤，得澄 清滤液，将滤液依次通过由AB-8大孔吸附树脂和D280阴离子交换树脂组成的 两节压力为0.2Mpa的高压串联树脂，完成上样，并收集未吸附液，其中，上样 量为原料（重量g）：树脂（重量g）=1:1，流速为1/10BV/min；

（5）洗脱：先用10BV的水洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，即得多糖溶 液；再用8BV的体积分数为40%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液， 即得总皂苷溶液；再用8BV的体积分数为80%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂， 收集洗脱液，即得总黄酮溶液；再用8BV的体积分数为60%的氨乙醇液洗脱阴 离子交换树脂，得阿魏酸及其极性相近的成分的溶液；

（6）真空冷冻干燥：先将步骤（4）所得的未吸附液和步骤（5）所得的多 糖溶液混合，得总多糖溶液；再将所述总多糖溶液、步骤（5）所得的总皂苷溶 液、总黄酮溶液和阿魏酸及其极性相近的成分的溶液，于真空度为0.09Mpa，温 度80℃条件下浓缩至初体积的20%为止，得浓缩液；将所得浓缩液于真空度为 18pa，温度为-50℃冷冻干燥，即得总多糖粗品、总皂苷粗品、总黄酮粗品和阿 魏酸粗品。

经检测，本实施例中当归挥发油58%，总多糖粗品中总多糖的含量为56%、 总皂苷粗品中总皂苷的含量为58%、总黄酮粗品中总黄酮的含量为67%、阿魏 酸粗品中阿魏酸的含量为56%。

实施例3

一种中药复方当归补血汤有效部位的同步制备方法，包括如下步骤：

（1）粉碎：按当归补血汤中芪归的重量份比为5:1称取当归和黄芪，总重 10kg，粉碎至10-120目，得当归粉和黄芪粉；

（2）超临界CO₂萃取：取步骤（1）所得的当归粉，采用超临界CO₂萃取 装置进行萃取，当分离釜Ⅰ温度为50℃，萃取釜温度为5℃时，打开CO₂储气 罐，对萃取釜进行加压，至压力为35MPa，调节CO₂流速为15L/h，保持萃取釜 的压力35MPa和温度5℃，萃取2h，即得当归挥发油和当归药渣；

（3）提取：将步骤（1）所得的黄芪粉和步骤（2）所得的当归药渣混合， 得混合物，于混合物中按重量体积比为1：10添加体积分数为80%的乙醇溶液 中浸泡2h，再在85℃温度下煎煮2h，过滤，再于滤渣中按重量体积比为1：9 添加体积分数为60%的乙醇溶液中浸泡2h，再在85℃温度下煎煮2h，过滤，再 于滤渣中按重量体积比为1：9添加体积分数为40%的乙醇溶液中浸泡2h，再在 85℃温度下煎煮2h合并3次滤液，并于压力为20kPa，温度为20℃的条件下， 减压浓缩20min，至无乙醇味，得浓缩液；

（4）柱分离：将步骤（3）所得的浓缩液趁热经400目滤网过滤，得澄清 滤液，将滤液依次通过由AB-8大孔吸附树脂和D280阴离子交换树脂组成的两 节压力为0.7Mpa的高压串联树脂，完成上样，并收集未吸附液，其中，上样量 为原料（重量g）：树脂（重量g）=1:1，流速为1/10BV/min；

（5）洗脱：先用10BV的水洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液，即得多糖溶 液；再用8BV的体积分数为50%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂，收集洗脱液， 即得总皂苷溶液；再用8BV的体积分数为80%的乙醇溶液洗脱大孔吸附树脂， 收集洗脱液，即得总黄酮溶液；再用10BV的体积分数为70%的氨乙醇液洗脱 阴离子交换树脂，得阿魏酸及其极性相近的成分的溶液；

（6）真空冷冻干燥：先将步骤（4）所得的未吸附液和步骤（5）所得的多 糖溶液混合，得总多糖溶液；再将所述总多糖溶液、步骤（5）所得的总皂苷溶 液、总黄酮溶液和阿魏酸及其极性相近的成分的溶液，于真空度为0.09Mpa，温 度80℃条件下浓缩至初体积的20%为止，得浓缩液；将所得浓缩液于真空度为 18pa，温度为-50℃冷冻干燥，即得总多糖粗品、总皂苷粗品、总黄酮粗品和阿 魏酸粗品。

经检测，本实施例中当归挥发油58%，总多糖粗品中总多糖的含量为53%、 总皂苷粗品中总皂苷的含量为56%、总黄酮粗品中总黄酮的含量为62%、阿魏 酸粗品中阿魏酸的含量为52%。

实施例4

当归补血汤有效部位提取物对血虚动物模型的影响。

1受试药物与仪器

下述当归挥发油、阿魏酸、总黄酮、总皂苷和总多糖是由实施例2制得； 环磷酰胺(上海华联制药有限公司生产，批号010312)。

2实验动物

KM小鼠，雄性，体重（20±2）g，SPF级。

3实验方法

取雄性小鼠70只，随机均匀分成7组，分别是当归挥发油组、阿魏酸组、 总黄酮组、总皂苷组、总多糖组、模型对照组和正常对照组。各试药均由 0.5%CMC-Na配制而成。空白对照组外，其余7组造血虚模型。其中，受试用 药组以高剂量灌胃当归补血汤5个有效部位，灌胃剂量见表1。正常对照组灌胃 同体积生理盐水，每天给药1次，连续10d。造模方法为于给药的第1日，每鼠 尾部放血0.5ml/20g，于第2、4、6、8d先禁食不禁水12h，对造模的7组小鼠 腹腔注射环磷酰胺0.8、0.4、0.4、0.4mg/10g，正常对照组注射同体积生理盐水。 于第9天断尾取血测血常规及凝血时间，第10天以0.4%戊巴比妥钠溶液麻醉后 腹主动脉取血，检测各项指标。从第二天开始，每天称量小鼠体质量。观察指 标：动物一般体征，血常规。

4实验结果

实验结果显示，动物从第三次注射环磷酰胺开始，模型对照组动物开始出 现毛色暗淡、竖毛、懒动、少食、少饮、体质量下降、唇爪苍白、颤抖、闭目 甚至瞎眼等现象。各给药组状态稍好。红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、红 细胞比容（HCT）、血小板（PLT）值是贫血的主要诊断指标。与正常组比较， 模型组RBC、HGB和HCT均显著减少，处于贫血状态。与模型组比较，试药 组能明显提高贫血小鼠RBC、HGB和HCT，参见表1。

给药剂量：根据《内外伤辩惑论》记载，当归补血汤用量及现在临床用量 决定用量，黄芪30克，当归6克。按临床等效剂量计算方法：临床用量/正常成 人体重*10*提取物的提取率=（g/kg）

表1当归补血汤有效部位对环磷酰胺所致血虚小鼠血常规检查结果

注：与模型对照组比较^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.005;与正常组比较 ^△P<0.05,^△△P<0.01,^△△△P<0.005。

从表1可知，当归补血汤各有效部位均可使环磷酰胺所致血虚小鼠的一般 体征得到一定程度的改善，且能提高贫血小鼠的RBC、HGB、HCT和PLT。

虽然受试药物为实施例2，但是实施例1和实施例3具有同样的作用，即当 归补血汤各有效部位均可使环磷酰胺所致血虚小鼠的一般体征得到一定程度的 改善，且能提高贫血小鼠的RBC、HGB、HCT和PLT。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域 的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和 改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附 权利要求为准。