用于检测棘阿米巴原虫的引物及试剂盒

摘要

本发明涉及用于检测棘阿米巴原虫的引物及试剂盒，其引物序列分别为SEQ ID NO：1-2。本发明的试剂盒由DNA扩增试剂、正反向引物组合、阳性对照核酸和灭菌蒸馏水组成。本发明所采用的引物对棘阿米巴原虫是灵敏、特异的，直接的PCR反应体系配制简单且反应程序高效；本发明省去了模板DNA提取步骤，保证了有限临床样本的最大利用度；同时也使得检测的时间大大缩短，2小时内即可得到检测结果，对临床病变的早期诊断可以起到很好的辅助作用。

说明书

技术领域

本发明属于感染性眼病常见致病微生物的快速检测技术领域，具体涉 及一种用于检测棘阿米巴原虫的引物及试剂盒。

背景技术

棘阿米巴原虫是一种广泛存在于自然界中的自生生活的微生物，有滋 养体、包囊两个时相。滋养体普遍栖息在淡水、污水、海水或泥土中 ，环境不利时转化为包囊；包囊可存在于空气中。在一定条件下，棘 阿米巴原虫可从皮肤伤口、穿透性角膜外伤、损伤的眼结膜或经呼吸 道、生殖道等进入人体，多数寄生于眼、皮肤等部位，若机体免疫力 减弱还可进一步引发脑炎。棘阿米巴性角膜炎是一种顽固的进行性角 膜溃疡，患者有异物感、视力模糊、流泪、畏光，并常有严重疼痛， 严重时可致盲。它的发生与一定的危险因素有关，主要包括配戴角膜 接触镜、接触污染的水源和角膜外伤等。近年来由于角膜接触镜的佩 戴，棘阿米巴性角膜炎有明显上升趋势。棘阿米巴性角膜炎表现复杂 多样，在感染早期由于其临床症状和单疱病毒、真菌等引起的角膜感 染非常相似，所以经常被误诊而延误治疗。而棘阿米巴引发的脑炎好 发于免疫抑制的病人，感染前有过头部或眼部外伤，其诊断也是相当 困难。神经系统体征显示局灶性单侧损害，有严重的局灶性坏死和水 肿。患者头痛、发热呕吐、颈强直、眩晕、嗜睡、精神错乱、共济失 调直至昏迷和死亡。因此只有早期及时确诊是，才能更好的指导后续 治疗中的正确用药以及选择合适的手术时机。

对于棘阿米巴原虫目前常用的实验室诊断方法有病灶组织刮片检查、 分离培养和共聚焦显微观察。病变组织刮片的显微观察具有快速简单 ，不需特殊仪器等优点，但是阳性率不高，而且对于阿米巴包囊的检 出需要很有经验。对病变组织或刮片中阿米巴原虫的分离培养是一种 很确切的检验方法，但是培养过程繁琐，切需要较长时间，这也制约 了此方法的广泛应用。共焦显微镜直接观察病灶处有无阿米巴包囊是 一种很直接的检测方法，是由于角膜组织的低光水平反射和眼球的运 动限制了图像的生成，而且共焦显微镜也不是很普及的检测仪器。可 见对棘阿米巴原虫引起的眼部感染目前尚无快速有效的早期诊断方法 ，因此临床上亟需新的快速有效的棘阿米巴性角膜炎的诊断方法。

利用分子生物学方法诊断病原微生物为棘阿米巴性角膜炎的快速诊断 提供了新的思路。已有研究者将普通PCR的方法应用于细菌、真菌和病 毒引起的感染诊断，对细菌的16S rRNA、真菌rRNA基因的大、小亚基 和病毒种特异性序列进行扩增和分析，可有效鉴定至种属。普通PCR方 法诊断病原虽然高效特异，但要先对样本进行模板DNA的提取，这个过 程本身就会造成样本的损失；加上临床眼科病变样本量本来就很少， 即使采用高 效便捷的试剂盒提取方法，DNA得率依然是很低的。所以考虑到要进行 DNA提取，那么普通PCR难以适应临床需要。直接PCR方法就可以避开D NA提取的步骤，将临床样本直接进行棘阿米巴原虫特异性DNA的扩增， 既大大缩短了检测的时间，又高效特异，而且需要的话还可以进一步 进行基因型的鉴定。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测棘阿米巴原虫的引物及试剂盒，以 便快速、高效、准确地检测棘阿米巴原虫，同时省去样本DNA提取步骤 ，使得检测更加便捷。

本发明根据GenBank中所公布的不同株棘阿米巴原虫的核酸序列中同源 性较高的部位，设计并合成型特异性的正向和反向引物，其引物序列 分别为SEQ ID NO：1～2，单疱病毒扩增片段长度为304bp。

本发明的引物组，其引物的核苷酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ  ID NO：2。

其中正向引物ACF的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；

反向引物ACR的核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明还提供一种棘阿米巴原虫快速检测试剂盒，包括如下的组份：

1）DNA扩增试剂：

DNA扩增试剂每份含10μL 2×MightyAmp 缓冲液、0.5μL Mighty Amp DNA聚合酶；

2）正反向引物组合：

正反向引物组合是针对棘阿米巴原虫保守序列设计并合成的正向及反 向引物等量混合液；

3）阳性对照核酸：

阳性对照核酸为含有棘阿米巴原虫正反向引物扩增的目的序列的质粒 pUC-AC；

4）灭菌蒸馏水。

本发明的引物组合试剂盒用于对棘阿米巴性角膜炎临床样本或棘阿米 巴污染水体样本进行棘阿米巴原虫检测，方法如下：

1）样本的处理：病变角膜刮片用5~10μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小离 心管；污染水体取2mL高速离心后，弃上清后加入适量纯水重悬沉淀。

2）棘阿米巴原虫特异性DNA扩增体系的配置： 

在反应管中分别加入下列组分：

（3）棘阿米巴原虫特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

步骤1: 98℃ 5分钟，

步骤2: 98℃ 30秒，

步骤3: 65℃ 30秒，每一个循环温度降低0.5℃，

步骤4: 72℃ 30秒，

步骤5: 重复2、3、4步骤9个循环，

步骤6: 98℃ 30秒，

步骤7: 60℃ 30秒， 

步骤8: 72℃ 30秒，

步骤9: 重复6、7、8步骤25个循环，

步骤10: 72℃ 10分钟，

步骤11: 4℃ 保持。

4）棘阿米巴原虫特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测棘阿米巴原虫特异性DNA，根据扩增产物分子 量是否与棘阿米巴原虫特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增， 从而确定有无棘阿米巴原虫感染或污染。

本发明通过根据棘阿米巴原虫基因组DNA的保守序列，设计并合成可以 扩增棘阿米巴原虫特异性DNA的正反向引物，利用特殊PCR扩增试剂无 需进行样本DNA提取而直接进行PCR反应的方法检测。本发明省去了模 板DNA提取步骤，减少了样本量损失的一个重要环节，特别保证了有限 临床样本的最大利用度；同时也使得检测的时间大大缩短，2个小时即 可出检测结果，对临床病变的早期诊断可以起到很好的辅助作用。本 发明采用的直接PCR扩增试剂扩增效率很高，扩增的虽然是未经模板D NA提取的粗样，但是特殊的聚合酶依然有很高的扩增效率。本发明采 用的TouchDown的扩增程序，既避免了粗样本中模板的复杂性可能带来 的非特异性扩增，又保证了特异序列的高效扩增。

具体实施方式

下面对本发明的试剂盒和检测方法进行具体的描述。

一、本发明的引物组的筛选

从GenBank数据库中下载8株不同种属棘阿米巴原虫的18s rRNA核酸序 列，包括Acanthamoeba griffini（gi|1336827），A.castellanii（ gi|516527），A. hatchetti（gi|2979668），A. polyphaga（gi| 2979656），A. rhysodes（gi|507402），A. sp. Liu-E1（gi|29 79655），A.stevensoni（gi|2979669），A. sp. Vazaldua（gi|2 979658），利用序列分析软件DNAMAN version 6进行同源性比较， 在同源性为100% 的区位，设计PCR 扩增引物，利用DNAMAN软件中的引物分析功能对所设计引物进行各项 参数的具体分析，最终确定本发明的正反向引物组。

二、引物组的效果检测

直接PCR检测棘阿米巴原虫试剂盒的制备 （5样次）：

(1)DNA扩增试剂，1管，内装15份扩增反应（每样次需做1个阳性反应 ，1个实验样品反应,1个阴性反应）所需试剂，10.5μL/份，每份含有 10μL 2×MightyAmp 缓冲液、0.5μL MightyAmp DNA聚合酶；（ MightyAmp 缓冲液及对应DNA聚合酶是TaKaRa公司生产的一种PCR反应 体系，货号为DR071）

(2)正反向引物组合，1管，内装15份，2μL/份，每份含棘阿米巴原虫 正向引物和反向引物的浓度均为5μM，引物的具体序列如SEQ ID N O：1～2。 

 (3)阳性对照核酸，1管，内装5μL包含棘阿米巴原虫目的DNA的质粒 ，命名为pUC-AC。质粒制备的具体操作是利用上述正反向引物对棘阿 米巴基因组DNA进行PCR扩增，将所得的目的大小的片段用切胶回收试 剂盒进行回收，然后连接到克隆质粒pMD-18T上，转入大肠杆菌DH5α 中，经氨苄培养基平板筛选培养，挑取阳性克隆进行测序验证，确定 为棘阿米巴原虫18s rRNA中保守序列后，提取此阳性克隆的质粒即可 作为阳性核酸。

(4) 灭菌蒸馏水，1管，内装1mL。

检测方法按照以下(1)-(4)程序进行：

（1）样本的处理：病变角膜刮片用5～10μL灭菌蒸馏水吹打重悬于小 离心管；污染水体取2mL高速离心后，弃上清加入适量纯水重悬沉淀。

（2）棘阿米巴原虫特异性DNA扩增体系的配置： 

在反应管中加入下列组分：

同时各做阳性和阴性对照，即阳性反应中模板各加入对应阳性核酸， 阴性反应则不加模板。

（3）棘阿米巴原虫特异性DNA扩增程序（TouchDown法）：

98℃ 5分钟/ 98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低 0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72 ℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

（4）棘阿米巴原虫特异DNA的琼脂糖凝胶电泳检测：

常规琼脂糖凝胶电泳检测棘阿米巴原虫特异性DNA，根据扩增产物分子 量是否与棘阿米巴原虫特异性DNA预定分子量相符确定有无阳性扩增， 从而确定有无棘阿米巴原虫感染或污染。

本发明的直接PCR法检测棘阿米巴原虫的引物及试剂盒不仅可以对棘阿 米巴性角结膜炎的病灶刮片进行棘阿米巴原虫的检测，还可以对日常 污染水体样本进行棘阿米巴原虫的检测。下列具体实施例进一步说明 本发明，但不应当作对本发明的限制。

实施例1本发明的试剂盒的敏感性检测

将已知浓度棘阿米巴原虫悬液梯度稀释为10⁴,10³,10²,10¹,10⁰ copie s/μL，采用本发明试剂盒中的DNA扩增试剂和引物组合进行扩增，评 价直接PCR对棘阿米巴原虫检测的敏感性，具体方法如下：

1) DNA扩增试剂10.5μL，各梯度棘阿米巴原虫悬液1μL,正反向引物 组合2μL，补灭菌蒸馏水至20μL；

2) 98℃ 5分钟/ 98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度 降低0.5℃），72℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒 ，72℃ 30秒；（25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

3) PCR反应结束后，在各浓度梯度反应管中加入上样缓冲液，进行琼 脂糖凝胶电泳检测。

结果显示，本发明的试剂盒对微量的棘阿米巴原虫就可扩增出阳性结 果，检测敏感性可达10个拷贝数，灵敏度很高，在实际操作中使用本 发明的引物检测的时候不会出现假阴性。

实施例2：本发明的试剂盒的特异性检测

利用眼科常见的其他致病原如细菌中的表皮葡萄球菌，真菌中的茄病 镰刀菌，病毒中的I型单纯疱疹病毒以及角膜刮片中常混有的角膜上皮 细胞对棘阿米巴原虫的引物进行了特异性检测。

具体操作同实施例1的具体方法，结果显示，本发明的试剂盒中棘阿米 巴原虫引物组合只对棘阿米巴原虫有特异扩增，对其他病原微生物未 有扩增，说明本发明的引物在检测的时候不会出现假阳性。

实施例3：本发明的试剂盒对动物病变组织样品的检测

利用临床上高度怀疑棘阿米巴性角膜炎病变角膜组织刮取物对本发明 的试剂盒进行有效性验证，具体方法如下：

(1)病变角膜刮取物加入5~10μL灭菌蒸馏水吹打散开至均匀。

(2)视样品量取1~5μL上述样品悬液分别加入1个小PCR反应管中，加入 10.5μL  DNA扩增试剂，然后再加入棘阿米巴原虫引物组合2μL，加灭菌蒸馏水 补足20μL 。同时对做加阳性核酸的阳性对照和不加模板的阴性对照 。

(3)将上述反应管放入PCR仪进行TouchDown PCR反应：98℃ 5分钟/  98℃ 30秒，65℃-60℃ 30秒（每一个循环温度降低0.5℃），72 ℃ 30秒;（9个循环）/ 98℃ 30秒，60℃ 30秒，72℃ 30秒；（ 25个循环）/72℃ 10分钟，4℃ 保持。

(4)PCR反应结束后，进行常规琼脂糖凝胶电泳检测。

结果棘阿米巴性角膜炎病变角膜组织样品扩增出与阳性反应管大小相 同的棘阿米巴原虫特异DNA条带，阴性反应管无扩增。

实施例4：本发明的试剂盒对日常污染水体的检测

利用高度怀疑污染棘阿米巴原虫的角膜接触镜浸泡液对本发明的引物 和试剂盒进行有效性验，具体方法如下：

取2 ml 角膜接触镜的浸泡液，10000r/min离心10min，弃上清保留 沉淀；加入纯水重悬沉淀吹打均匀；余步骤同实施例3中(2)～(4)，结 果显示角膜接触镜浸泡液体样品反应管扩增出与阳性反应管大小相同 的棘阿米巴原虫特异DNA条带，阴性反应管无阳性扩增。

上述的结果标明本发明的引物可以用来检测棘阿米巴原虫。