一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法

摘要

本发明公开了一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法。干酪乳杆菌经廉价增菌培养基高密度培养、离心浓缩分离、与高效复合保护剂混溶、再经冷冻干燥，制成干酪乳杆菌直投式冻干发酵剂。所制备的发酵剂的活菌含量可达1×1011cfu/g以上；常压封存、4℃下保藏1年，其活菌含量仍在1010cfu/g以上，仍保持较高的发酵活力；以万分之一以下的接种量进行37℃大豆酸乳发酵，4～5h即可凝乳，其发酵的大豆酸奶制品，酸度达到70～80oT、pH值为4.6左右，感官风味好。本发明可用于发酵乳制品工业和植物蛋白加工产业。

说明书

  

技术领域

本发明涉及一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法，属于发酵乳制品及植物蛋白加工技术领域。 

背景技术

益生菌系指与人和动植物体保持共生关系的对宿主具有健康促进作用的一大类微生物的总称。目前，国际公认的与人体共生的典型的益生乳酸菌主要包括：以双歧杆菌和嗜酸乳杆菌为代表的第一代益生乳酸菌和以干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌为代表的第二代新型益生乳酸菌。较之第一代益生乳酸菌，第二代新型益生乳酸菌更耐氧、耐胃酸、耐胆盐；发酵性能更好、存活力更高。 

目前，干酪乳杆菌发酵产品主要为牛乳产品，而其发酵植物蛋白酸乳产品，在国内外尚处于研究起步阶段，且缺乏生产性能优良的专用菌种。 

我国具有天然的大豆资源优势，大豆不仅在营养保健的各种功能性成分和促进益生菌繁殖的生长因子方面可与牛乳相媲美，而且不含胆固醇和乳糖。因此，研制开发出综合益生菌和大豆的有益特性于一身、集感官风味和多种营养保健功能于一体的第二代新型益生菌（如干酪乳杆菌）发酵大豆乳产品，是当今发酵乳制品工业和大豆加工产业的发展方向与新的增长点，必将引领市场与消费者对健康食品需求的新潮流。 

发酵剂的制备是研制开发新型发酵乳制品的关键环节和首要任务。传统培养型发酵剂存在活菌含量低（10⁷～10⁸cfu/mL）、接种量大（2%～5%）、保藏期短（4℃，1～2d）、生产工序多、劳动强度大、培养周期长、菌种极易退化和污染等弊端，这将直接导致发酵乳制品产品质量不稳和生产效率低下。因而，新型发酵剂——高效浓缩型直投式发酵剂应运而生。高效浓缩型直投式发酵剂系乳酸菌经液体深层高密度培养、浓缩分离、与保护剂介质混溶、再经冷冻或冷冻干燥、无菌包装，制成直投式冻藏发酵剂或直投式冻干发酵剂。具有活菌含量高（10¹⁰～10¹²cfu/g）、保藏期长（冻干发酵剂4℃，>1年）、接种量较传统培养型发酵剂降低1000～10000倍、在发酵乳制品生产中省略了发酵剂的制备工序、减少了菌种车间的投资和空间、防止了菌种的退化和污染，可使发酵乳制品工业的劳动生产率和产品质量大大提高。直投式冻藏发酵剂在应用中，维持冷冻费用较高，运输不方便，对发酵剂中心的依赖性过强。而直投式冻干发酵剂，保藏和运输方便，机械化程度高，便于工业化批量生产，是今后直投式发酵剂的主要发展方向。 

影响高效浓缩型直投式冻干发酵剂细胞存活率及贮藏稳定性的主要因素有：菌种特性、培养基、培养条件与收获期、起始细胞浓度、冻干保护剂及其pH值、冷冻速度、干燥过程、残留水分、包装形式、保藏温度等。其中，优化筛选廉价增菌培养基和高效冻干保护剂是研制开发直投式冻干发酵剂的关键技术。研究表明：乳酸菌对营养要求十分苛刻，实验室常用的乳酸菌培养基（如MRS、M17等），成分复杂，制作繁琐，价格昂贵。目前，常用的脱脂乳培养基和乳清培养基虽然经济易得，价格低廉，但脱脂乳培养基粘度大，不易浓缩分离菌体；而乳清培养基在加热灭菌过程中易发生乳清蛋白的热变性而产生沉淀。因此，根据我国资源优势，积极寻求来源广泛，经济易得的廉价原料，优化筛选适合乳酸菌大量生长的增菌培养基，是实现我国大规模工业化生产直投式冻干发酵剂的关键技术之一。冻干保护剂是最为复杂、最难选择的关键因素，它不仅影响乳酸菌在冻干过程中的细胞存活率，也影响保藏期间的细胞稳定性，其配方及其制备方法属于商业机密。因此，优化筛选高效冻干保护剂是研制开发直投式冻干发酵剂的关键技术之二。 

综上可见，积极研制开发可替代进口产品的具有自主创新的高效浓缩型直投式益生菌大豆酸乳发酵剂，对于提高发酵大豆乳制品产品的质量和功能性，推动我国高效浓缩型直投式益生菌发酵剂产业化的技术进步，促进我国发酵大豆乳制品及植物蛋白加工产业的发展，具有重要意义。 

申请号为200410018684.4的中国发明公开了“益生乳酸菌发酵剂的制备方法及其在新鲜干酪中的应用”，是将一株干酪乳杆菌经高密度培养，离心浓缩，与保护剂混溶后进行冷冻干燥得到冻干发酵剂，但其所用改良MRS培养基成分复杂，制作繁琐，成本较高；且未明确该菌是否也适用于发酵大豆酸乳。申请号为200810175856.7的中国发明公开了“干酪乳杆菌Zhang高密度培养方法、使用它们制备冻干菌粉的方法与所得到的冻干菌粉及其用途”，制备了干酪乳杆菌Zhang的冻干菌粉，但其所用高密度培养基成分复杂，制作繁琐，成本较高；冻干时间为36h，效率有待于进一步提高，且未涉及该菌是否也适用于发酵大豆酸乳。 

发明内容

本发明的目的是提供一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法，以实现干酪乳杆菌直投式发酵剂的工业化规模生产。 

本申请人前期进行了大量新型益生菌的收集、分离筛选工作，对新型益生菌在大豆乳中的生长、发酵特性等进行了详细研究，发现来自于中国科学院微生物研究所的干酪乳杆菌AS1.62，在大豆乳培养基中具有良好的生长和发酵特性，培养12小时活菌数可达10⁹cfu/mL，并对其进行了后续大豆酸乳直投式发酵剂制备方法的研究。针对乳酸菌对营养要求苛刻的特点，通过大量试验，选择价廉易得的半野生植物——菊芋为原料，研究了菊芋汁基础培养基的制备工艺；并以干酪乳杆菌AS1.62为试验菌株，研究了在菊芋汁基础培养基添加单一营养因子对干酪乳杆菌细胞生长量的影响，进一步利用正交试验优化筛选出干酪乳杆菌的菊芋汁复合增菌培养基；通过研究接种量、培养温度、基质起始pH值、培养方式等因素对干酪乳杆菌细胞生长量的影响，进一步利用正交试验优化确定了干酪乳杆菌增殖培养的工艺条件；研究了离心力、离心时间对细胞离心损失率和存活率的影响，确定了最高活菌收得率的最适离心工艺条件；与此同时，在大量试验基础上，研究了不同的复合保护剂对干酪乳杆菌冻干存活率的影响，优化筛选出抗冷冻干燥的复合保护剂配方；对优化筛选出的抗冷冻干燥的复合保护剂配方制成的干酪乳杆菌冻干粉剂，通过细胞加速试验，进一步筛选出既抗冷冻干燥又耐贮藏的优良复合保护剂配方。通过研究添加复合保护剂的干酪乳杆菌菌悬液在冷冻过程中冷冻速度对细胞存活率的影响，确定了合理可行的冷冻干燥工艺；通过研究干酪乳杆菌冻干发酵剂在不同封存方式（常压封存、真空封存）下包装、在不同温度（-18℃、4℃）下贮藏的活菌数和发酵活力的变化，确定了冻干发酵剂的保藏条件和保藏期。 

具体的，本发明提供的一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法，包括以下步骤： 

（1）干酪乳杆菌的增殖培养

①干酪乳杆菌廉价增菌培养基的制备

a．干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基的制备

原料：菊芋，蒸馏水；  

制备工艺：(a)菊芋清洗、称重；(b) 菊芋与水按质量体积比为1:1混合；(c)加热灭酶：加热至100℃，煮沸5min；(d)加水捣碎：补加适量80℃热水，在捣碎机中将菊芋和水捣碎成浆状；(e)过滤：用100目滤布挤压过滤；(f)滤渣加水压榨：滤渣补加适量80℃热水挤压过滤；(g)滤汁混合、定容：将两次过滤的滤汁混合，用蒸馏水定容至1kg菊芋生产1L汁（定义为100%的菊芋汁）；(h)调配：将菊芋汁加热浓缩至含糖量为10%，用NaOH溶液调节pH至7.0，制得干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基，备用；

b．干酪乳杆菌复合增菌培养基的制备

原料及配比：干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基100mL，酵母膏0.5～0.8g，蛋白胨0.3～0.6g，大豆蛋白胨1.2～1.6g，牛肉膏0.8～1.2g，甘油0.1mL；

制备工艺：将酵母膏、蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏、甘油添加到干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基中，用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.0，121℃ 15min灭菌、冷却，备用；

②干酪乳杆菌增殖培养

干酪乳杆菌经MRS（Man Rogosa Sharpe）液体培养基活化后，以0.1%～0.5%（约1×10⁶cfu/mL～5×10⁶cfu/mL）接种量接入pH值为6.5～7.0的菊芋汁复合增菌培养基中，在有氧条件下35～37℃培养16～18h至对数末期或稳定初期，活菌数可达4～5×10⁹cfu/mL，获得干酪乳杆菌的高浓度培养物；

（2）干酪乳杆菌细胞的浓缩分离

干酪乳杆菌高浓度培养物在常温下5000～7500r/min（2550g～5738g）离心10～20min进行细胞浓缩分离，离心后弃去上清液，获得活菌收得率高于95%的干酪乳杆菌浓缩细胞；

（3）在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂

复合保护剂配方：蒸馏水100mL，β-环状糊精10g，蔗糖6～7g，甘油0.1～0.2g，酵母粉1.0～1.2g，维生素E 0.3～0.6g；

复合保护剂制备工艺：①在蒸馏水中添加蔗糖、甘油、酵母粉，加热溶解混匀，冷却至室温；②用NaOH溶液调节pH值至6.8～7.0；③115℃灭菌10min，冷却至室温；④在无菌条件下加入经过105℃ 、60min干热灭菌并冷却后的β-环状糊精和经过滤除菌后的维生素E，混匀；

在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂工艺：在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加菌株高浓度培养物体积20%～30%的复合保护剂，制成菌悬液，混匀即可；

（4）干酪乳杆菌直投式发酵剂的冻干工艺 

将添加了复合保护剂的干酪乳杆菌菌悬液分装于冻干盘或瓶内，厚度0.75cm，-20℃冷冻12h；在冷冻干燥机中于真空度3～10Pa、冷阱温度-55～-45℃下真空冷冻干燥11～13h，制成干酪乳杆菌冻干发酵剂成品，冻干发酵剂的活菌数可达1×10¹¹cfu/g以上，含水量为2～3%。

本发明取得的有益效果如下： 

1．本发明制备的高效浓缩型直投式干酪乳杆菌发酵剂，其发酵性能和技术指标可与国际知名品牌商业发酵剂相媲美（活菌含量可达1×10¹¹cfu/g以上；常压封存、4℃下保藏1年，其活菌含量仍在10¹⁰cfu/g以上，仍保持较高的发酵活力），而成本较进口商业发酵剂降低30%以上。

2．本发明制备的干酪乳杆菌冻干发酵剂，可作为生产大豆酸乳的直投式发酵剂使用，接种量较传统培养型发酵剂降低10000～100000倍，在工业生产中省略了发酵剂的制备工序，减少了菌种车间的投资和空间，防止了菌种的退化和污染，可提高发酵乳制品工业和植物蛋白加工产业的劳动生产率和产品质量。 

3．本发明制备的干酪乳杆菌冻干发酵剂，以万分之一以下的接种量进行37℃大豆酸奶发酵，4～5h即可凝乳，其发酵的大豆酸奶制品，酸度达到70～80 ^oT、pH值为4.6左右，感官风味好。可用于发酵乳制品工业和植物蛋白加工产业。 

附图说明

图1为实施例1、2、3制备的干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂常压封存后在4℃和-18℃条件下贮藏1年的活菌数变化。 

具体实施方式

    以下实施例用于说明本发明。 

实施例1  一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法，是通过以下步骤实现的： 

（1）干酪乳杆菌的增殖培养

①干酪乳杆菌廉价增菌培养基的制备

a．干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基的制备

原料配比：菊芋，蒸馏水；

制备工艺：(a)菊芋清洗、称重；(b)料水的质量体积比为1：1；(c)加热灭酶：加热至100℃，煮沸5min；(d)加水捣碎：补加适量80℃热水，在捣碎机中将菊芋和水捣碎成浆状；(e)过滤：用100目滤布挤压过滤；(f)滤渣加水压榨：滤渣补加适量80℃热水挤压过滤；(g)混合滤汁定容：将两次过滤的滤汁混合，用蒸馏水定容至1kg菊芋生产1L汁（定义为100%的菊芋汁）；(h)调配：加热浓缩至含糖量为10%左右；用NaOH溶液调节pH至7.0左右；

b．干酪乳杆菌复合增菌培养基的制备

原料配比：干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基100mL，酵母膏0.5g，蛋白胨0.3g，大豆蛋白胨1.6g，牛肉膏1.2g，甘油0.1mL，pH6.5～7.0；

制备工艺：在100mL菊芋汁基础培养基中添加酵母膏0.5g、蛋白胨0.3g、大豆蛋白胨1.6g、牛肉膏1.2g、甘油0.1mL，用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.0，121℃ 15min灭菌冷却备用；

②干酪乳杆菌增殖培养的工艺条件

干酪乳杆菌经MRS液体培养基活化后，以0.5%（约5×10⁶cfu/mL）接种量接入pH值为6.5～7.0的菊芋汁复合增菌培养基中，在有氧条件下37℃培养16h至对数末期或稳定初期，活菌数可达4.3×10⁹cfu/mL，获得干酪乳杆菌的高浓度培养物；

（2）干酪乳杆菌细胞的浓缩分离

干酪乳杆菌高浓度培养物采用在常温下7500r/min（5738g）离心10min进行细胞浓缩分离，离心后弃去上清液，获得活菌收得率为95.34%的干酪乳杆菌的浓缩细胞；

（3）在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂

复合保护剂配方：蒸馏水100mL，β-环状糊精10g，蔗糖6g，甘油0.2g，酵母粉1.2g，维生素E 0.3g，pH值6.8～7.0，过滤或加热除菌即可；

复合保护剂配方的制备工艺：①在100mL蒸馏水中添加蔗糖6g、甘油0.2g、酵母粉1.2g，加热溶解混匀，冷却至室温；②用NaOH溶液调节pH值至6.8～7.0；③115℃灭菌10min，冷却至室温；④采用无菌操作加入经过105℃ 60min干热灭菌并冷却后的β-环状糊精10g和经过过滤除菌后的维生素E 0.3g，混匀即可；

在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂工艺：在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加菌株高浓度培养物体积30%的复合保护剂，制成干酪乳杆菌菌悬液，混匀；

（4）干酪乳杆菌直投式发酵剂的冻干工艺

将添加保护剂的干酪乳杆菌菌悬液分装冻干盘/瓶，厚度0.75cm，-20℃冷冻12h；在冷冻干燥机中于真空度3～10Pa、冷阱温度-55～-45℃下真空冷冻干燥13h，制成干酪乳杆菌冻干发酵剂。冻干发酵剂的活菌数可达1.19×10¹¹cfu/g，含水量为2.1%。

实施例2  一种干酪乳杆菌大豆酸乳直投式发酵剂的制备方法，该方法是通过以下步骤实现的： 

（1）干酪乳杆菌的增殖培养

①干酪乳杆菌廉价增菌培养基的制备

a．干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基的原料配比与制备工艺同实施例1。

b．干酪乳杆菌复合增菌培养基的制备 

原料配比：干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基100mL，酵母膏0.7g，蛋白胨0.5g，大豆蛋白胨1.5g，牛肉膏1.0g，pH6.5～7.0；

制备工艺：在100mL菊芋汁基础培养基中添加酵母膏0.7g、蛋白胨0.5g、大豆蛋白胨1.5g、牛肉膏1.0g、甘油0.1mL，用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.0，121℃ 15min灭菌冷却备用；

②干酪乳杆菌增殖培养的工艺条件

干酪乳杆菌经MRS液体培养基活化后，以0.1%（约1×10⁶cfu/mL）接种量接入pH值为6.5～7.0的菊芋汁复合增菌培养基中，在有氧条件下35℃培养18h至对数末期或稳定初期，活菌数可达4.85×10⁹cfu/mL，获得干酪乳杆菌的高浓度培养物；

（2）干酪乳杆菌细胞的浓缩分离

干酪乳杆菌高浓度培养物采用在常温下5000r/min（2550g）离心20min进行细胞浓缩分离，离心后弃去上清液，获得活菌收得率为98.35%的干酪乳杆菌浓缩细胞；

（3）在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂

复合保护剂配方：蒸馏水100mL，β-环状糊精10g，蔗糖6～7g，甘油0.1～0.2g，酵母粉1.0～1.2g，维生素E 0.3～0.6g，pH值6.8～7.0，过滤或加热除菌即可；

复合保护剂配方的制备工艺：①在100mL蒸馏水中添加蔗糖6g、甘油0.1g、酵母粉1.0g，加热溶解混匀，冷却至室温；②用NaOH溶液调节pH值至6.8～7.0；③115℃灭菌10min，冷却至室温；④采用无菌操作加入经过105℃ 60min干热灭菌并冷却后的β-环状糊精10g和经过过滤除菌后的维生素E 0.5g，混匀即可；

在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂工艺：在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加菌株高浓度培养物体积20%的复合保护剂，制成菌悬液，混匀即可；

（4）干酪乳杆菌直投式发酵剂的冻干工艺

将添加保护剂的干酪乳杆菌菌悬液分装冻干盘/瓶，厚度0.75cm，-20℃冷冻12h；在冷冻干燥机中于真空度3～10Pa、冷阱温度-55～-45℃下真空冷冻干燥11h，制成干酪乳杆菌冻干发酵剂。冻干发酵剂的活菌数可达1.43×10¹¹cfu/g，含水量为2.7%。

实施例3  一种干酪乳杆菌直投式大豆酸乳冻干发酵剂的制备方法，该方法是通过以下步骤实现的： 

（1）干酪乳杆菌的增殖培养

①干酪乳杆菌廉价增菌培养基的制备

a．干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基的原料配比与制备工艺同实施例1。

b．干酪乳杆菌复合增菌培养基的制备 

原料配比：干酪乳杆菌菊芋汁基础培养基100mL，酵母膏0.8g，蛋白胨0.6g，大豆蛋白胨1.2g，牛肉膏0.8g，甘油0.1mL，pH6.5～7.0；

制备工艺：在100mL菊芋汁基础培养基中添加酵母膏0.8g、蛋白胨0.6g、大豆蛋白胨1.2g、牛肉膏0.8g、甘油0.1mL，用NaOH溶液调节pH值至6.5～7.0，121℃ 15min灭菌冷却备用；

②干酪乳杆菌增殖培养的工艺条件

干酪乳杆菌经MRS液体培养基活化后，以0.3%（约1×10⁶cfu/mL）接种量接入pH值为6.5～7.0的菊芋汁复合增菌培养基中，在有氧条件下37℃培养17h至对数末期或稳定初期，活菌数可达4.3×10⁹cfu/mL，获得干酪乳杆菌的高浓度培养物；

（2）干酪乳杆菌细胞的浓缩分离

干酪乳杆菌高浓度培养物采用在常温下6000r/min（3672g）离心15min进行细胞浓缩分离，离心后弃去上清液，获得活菌收得率为96.05%的干酪乳杆菌浓缩细胞；

（3）在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂

复合保护剂配方：蒸馏水100mL，β-环状糊精10g，蔗糖7g，甘油0.1g，酵母粉1.0g，维生素E 0.6g，pH值6.8～7.0，过滤或加热除菌即可；

复合保护剂配方的制备工艺：①在100mL蒸馏水中添加蔗糖7g、甘油0.1g、酵母粉1.0g，加热溶解混匀，冷却至室温；②用NaOH溶液调节pH值至6.8～7.0；③115℃灭菌10min，冷却至室温；④采用无菌操作加入经过105℃ 60min干热灭菌并冷却后的β-环状糊精10g和经过过滤除菌后的维生素E 0.6g，混匀即可；

在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加复合保护剂工艺：在干酪乳杆菌浓缩细胞中添加菌株高浓度培养物体积25%的复合保护剂，制成干酪乳杆菌菌悬液，混匀；

（4）干酪乳杆菌直投式发酵剂的冻干工艺

将添加保护剂的干酪乳杆菌菌悬液分装冻干盘/瓶，厚度0.75cm，-20℃冷冻12h；在冷冻干燥机中于真空度3～10Pa、冷阱温度-55～-45℃下真空冷冻干燥12h，制成干酪乳杆菌冻干发酵剂。冻干发酵剂的活菌数可达1.24×10¹¹cfu/g，含水量为2.4%。

  

附表说明：

表1 为在常压封存、-18℃贮藏的干酪乳杆菌直投式发酵剂对大豆酸乳发酵及品质的影响。