一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒

摘要

本发明公开了一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒，包括膜分类基因芯片条，含检测赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、阴性对照探针和阳性对照探针，每条探针2个重复；以及核酸制备所需试剂和核酸杂交所需试剂；本试剂盒即是要开发一种便携式、灵敏和快速的检测试剂盒，该试剂盒既能对自然样品中的几种常见赤潮藻，包括赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻进行同时检测，又不需要昂贵的仪器，也即实现对自然样品中多种赤潮藻的现场检测。

说明书

技术领域

本发明涉及海洋生物技术领域，尤其涉及的是一种可简易检测自然水样中多种赤 潮藻的试剂盒。

背景技术

赤潮是指由于海洋浮游生物，包括藻类（主要原因种）、原生动物和细菌的过度繁 殖或聚集造成海水变色的现象。近年来，由于人类活动的加剧，海洋日趋富营养化，导 致赤潮频发，并已成为一种全球性的生态灾害，给水产养殖业、捕捞业和滨海旅游业造 成了巨大损失，同时也给海洋生态环境带来负面影响，甚至直接威胁人类健康。

有害赤潮在我国呈现出爆发次数增多、面积扩大、持续时间延长和危害加剧的趋势。 如在2004年我国爆发赤潮的次数就达120次，特别是1998-2000年连续3年我国的黄 海、渤海和南海就发生面积达上千平方公里的特大赤潮，为世界罕见，因此，赤潮引起 了公众和政府的高度重视。

对赤潮原因种进行正确鉴定是研究、认识和防治其引起的赤潮的前提和基础，同时 更应建立简单、快速和特异性强的检测方法，监测赤潮高发区的水环境，对可能爆发的 有害赤潮进行预警，特别是指导渔业生产者及时采取应对措施，以减少经济损失。特别 是由于赤潮藻多种多样，在全世界的4000多种浮游生物中，能形成赤潮的达260多种。 因此，在自然水域中多种赤潮藻常常同时存在，在水环境的日常监测中，就有必要建立 一种能同时对自然水样中的多种赤潮藻进行检测的技术。

当前，对自然水样中的赤潮藻的检测的传统方法，主要是以其分类学特征为基础， 借助光镜和电镜对其细胞形态特征进行观察，并最终对其进行鉴定。

形态鉴定法的缺点

（1）赤潮藻一般个体较小，识别困难，光镜有时只能鉴定到属，而要进一步确定 其具体种类，可能需要进行电镜观察，因而工作繁锁且检测成本较高，难以适应日常水 环境监测对大量样品的快速、准确处理的要求；

（2）赤潮的发生通常是暴发性事件，自然水体中的赤潮藻在赤潮发生早期的细胞 浓度较低，并与非赤潮藻混合在一起，一些常规的监测手段，如藻种采集、定性和定量 记录等较为困难，因而可能延误赤潮藻的预警；

（3）赤潮藻细胞的表观形态极易随生活环境和生理状态发生更改，因此其鉴定的 经验依赖度高，这就使得有些赤潮微藻的鉴定成为分类学家的专长，也增加了自然海域 中赤潮种源的鉴定、监控以及预警的难度。

最近，分子生物学技术为赤潮藻的鉴定提供了新思路。赤潮藻的分子检测技术以藻 细胞的基因组核糖体DNA（rDNA）为靶目标，其主要原因是藻类基因相对恒定，不会 像其表观形态特征随环境条件的不同而发生变化。因此，其可克服形态学鉴定法的缺点， 具有特异性强，检测迅速的特点。近年来，出现了大量有关赤潮藻分子检测方法，包括： DNA测序、限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）、 随机扩增多态性DNA（RAPD）(random amplified polymorphic DNA)、全细胞荧光原位 杂交（fluorescence in situ hybridization,FISH）、实时荧光定量PCR和三明治杂交 （sandwich hybridization,SHA），这些方法都只能对自然样品中的单种赤潮藻进行检测。 最近，还出现了可对自然样品中的多种赤潮藻进行并行检测的基因芯片法。然而，当前 还没有一种可以对自然水样中的多种赤潮藻进行现场检测的分子技术。

现有的分子检测方法的缺点

（1）现有的分子检测技术除基因芯片技术除外均只能对自然样品的单种赤潮藻进 行鉴定和检测，不能对自然样品的多种赤潮藻进行检测；

（2）无法实现现场检测：现有的分子检测方法必须借助特别的实验仪器，如DNA 测序需要PCR仪和测序仪，限制性片段长度多态性和随机扩增多态性DNA需要DNA 电泳仪，全细胞荧光原位杂交需要荧光显微镜，实时荧光定量PCR需要荧光定量PCR 仪，三明治杂交需要酶标仪等，这就使得这些检测方法必须在实验室才能完成，无法对 自然水体中的赤潮藻进行现场检测。

（3）现有芯片检测技术的缺点：虽然现有的芯片技术能实现对自然样品中多种赤 潮藻的并行检测，但其核酸制备需要核酸扩增仪，结果的判读需要荧光扫描仪，使其检 测费用较高，且也难以成为现场检测技术。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足提供一种可简易检测自然水样 中多种赤潮藻的试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种可简易检测自然水样中多种赤潮藻的试剂盒，包括膜分类基因芯片条，含检 测赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶 原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、阴性对照探针和阳性对照探针， 每条探针2个重复；

核酸制备所需试剂：

自然样品核酸粗提试剂：2%(m/v)CTAB,0.5%(v/v)β-mercaptoethanol,1.4M NaCl, 20mM EDTA,100mM Tris-Cl,10U RNase Inhibitor；

5×NASBA Buffer：0.2M Tris-HCl,60mM MgCl₂,0.35M KCl₂,25mM DTT,20 mM dNTP；

NTP：10mM ATP,10mM GTP,10mM CT P，6.5mM UTP,3.5mM Digoxigenin-11-UTP；

5×Primer mix：75%DMSO,1μM NASBA-P1,1μM NASBA-P2,25mM DT T,20 mM dNTP；

4×Enzyme mix：1.5M山梨醇,0.42mg/ml BSA,16U/ml RNase H,6400U/ml T7 RNA Polymerase,1280U/ml RT-M-MLV，4000U/ml RNA inhibitor；

核酸杂交所需试剂：

RNA变性剂：1.5M NaCl，0.15M二水柠檬酸三钠，pH7.0,0.15M甲醛；

杂交液：1%Blocking Reagent II，0.75M NaCl,0.075M二水柠檬酸三钠，50μg/ml 鲑精DNA；

Buffer II：1%Blocking Reagent II,0.1M Tris,0.15NaCl,pH7.5；

碱性磷酸酶标记的DIG抗体：AP-抗DIG；

20×SSC：3MNaCl，0.3M二水柠檬酸三钠，pH7.0；

10×BufferI：1.0M Tris,1.5MNaCl,pH7.5；

10×BufferIII：1.0M Tris,1.0M NaCl,0.5M MgCl₂,pH9.5；

10%SDS；

显色剂：2.81%NBT，2.19%BCIP，70%二甲基甲酰胺。

所述膜分类基因芯片条的制备方法为：

（1）按下表序列信息：

探针信息

（2）将合成的探针干粉溶解于0.1M Tris-HCl(pH7.5)，配制成浓度为10μM的溶 液；

（3）隔着衬纸在尼龙膜上用软铅笔划格,每格大小为5×5mm²,其总大小为0.25 cm²，沿总框线将所用的尼龙膜剪下，在尼龙膜第一格的左上角用软铅笔点上点标记；

（4）将尼龙膜飘浮于双蒸水表面,让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC 中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；

（5）探针点膜及固定：将配制的探针溶液用毛细吸管或移液器在上述处理过的尼 龙膜上点样0.5~1μl，自然晾干；将点样后的尼龙膜夹于两层滤纸中间，在80°C烘箱 内处理2h。

本发明有益效果为：

现有的大多分子技术只能对自然水样中的单种赤潮藻进行检测。最近出现的基因 芯片检测技术虽然能对多种赤潮藻进行检测，但其检测成本、仪器要求及技术要求均较 高，不能实现对自然样品的现场检测，很难推广应用到基层单位。

本试剂盒即是要开发一种便携式、灵敏和快速的检测试剂盒，该试剂盒既能对自然 样品中的几种常见赤潮藻，包括赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中 肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻进行同时检测，又不需要昂贵的 仪器，也即实现对自然样品中多种赤潮藻的现场检测。

附图说明

图1为本试剂盒的检测效果示意图（水样中含有所有目标赤潮藻）；注：斑点杂交 信号，其中A1/J2和A2/J1分别为阳性和阴性对照结果；B1/B2、C1/C2、D1/D2、E1/E2、 F1/F2、G1/G2、H1/H2、I1/I2、J1/J2呈阳性结果，表明检测的样品中分别含有与其对应 的8种赤潮藻赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、中肋骨条藻、柔弱角 毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

1．试剂盒组成

1.1膜分类基因芯片条，含检测赤潮异湾藻、东海原甲藻、新月菱形藻、共生甲藻、 中肋骨条藻、柔弱角毛藻、三叶原甲藻、塔玛亚历山大藻共8种赤潮藻的种特异性探针、 阴性对照探针和阳性对照探针，每条探针2个重复；

膜分类基因芯片条的制备方法：

（1）按下列序列信息（表1）合成检测探针。

表1探针信息

（2）将合成的探针干粉溶解于0.1M Tris-HCl(pH7.5)，配制成浓度为10μM的溶 液；

（3）隔着衬纸在尼龙膜上用软铅笔划格,每格大小为5×5mm²,其总大小为0.25 cm²，沿总框线将所用的尼龙膜剪下，在尼龙膜第一格的左上角用软铅笔点上点标记；

（4）将尼龙膜飘浮于双蒸水表面,让其吸水后沉入水中，再捞出浸泡于20×SSC 中5min，再将膜放置于滤纸上晾干；

（5）探针点膜及固定：将配制的探针溶液用毛细吸管或移液器在上述处理过的尼 龙膜上点样0.5~1μl，自然晾干；将点样后的尼龙膜夹于两层滤纸中间，在80°C烘箱 内处理2h。

1.2核酸制备所需试剂

自然样品核酸粗提试剂(2%(m/v)CTAB,0.5%(v/v)β-mercaptoethanol,1.4M NaCl, 20mM EDTA,100mM Tris-Cl,10U RNase Inhibitor)；

5×NASBA Buffer(0.2M Tris-HCl,60mM MgCl₂,0.35M KCl₂,25mM DTT,20 mM dNTP)；

NTP(10mM ATP,10mM GTP,10mM CTP，6.5mM UTP,3.5mM Digoxigenin-11-UTP)；

5×Primer mix(75%DMSO,1μM NASBA-P1,1μM NASBA-P2,25mM DTT,20 mM dNTP)；

4×Enzyme mix(1.5M山梨醇,0.42mg/ml BSA,16U/ml RNase H,6400U/ml T7 RNA Polymerase,1280U/ml RT-M-MLV，4000U/ml RNA inhibitor)；

1.3核酸杂交所需试剂

RNA变性剂（1.5M NaCl，0.15M二水柠檬酸三钠，pH7.0,0.15M甲醛）；

杂交液（1%Blocking Reagent II，0.75M NaCl,0.075M二水柠檬酸三钠，50μg/ml 鲑精DNA）；

Buffer II（1%Blocking Reagent II,0.1M Tris,0.15NaCl,pH7.5）；

碱性磷酸酶标记的DIG抗体(AP-抗DIG)；

20×SSC(3M NaCl，0.3M二水柠檬酸三钠，pH7.0)；

10×Buffer I(1.0M Tris,1.5M NaCl,pH7.5)；

10×Buffer III(1.0M Tris,1.0M NaCl,0.5M MgCl₂,pH9.5)；

10%SDS；

显色剂(2.81%NBT，2.19%BCIP，70%二甲基甲酰胺)；

2．本试剂盒检测所需自备器材和试剂：

2.1自备器材：

水样采集器具；

5ml一次性注射器、过滤器及微孔滤膜（如孔径0.45μm，直径13mm）；

剪刀和镊子；

涡旋振荡器；

低速离心机；

移液器、各种规格的灭菌枪头、1.5ml和200μl离心管；

恒温设备（如水浴锅等）；

2.2自备试剂

去离子水；

3．本检测试剂盒的使用操作步骤：

（1）水样的采集及藻细胞的过滤：采集自然水样，混匀，用5ml一次性灭菌针头 吸取检测样品，将滤膜（孔径0.45μm，直径13mm）安置于过滤器上，手推过滤；

（2）洗膜及膜的简切处理：用针头吸取去离子水，将含有藻细胞的滤膜洗涤2次， 将滤膜从过滤器取下，用灭菌的剪刀将其剪成碎屑，并用镊子将膜碎屑放入1.5ml离心 管中；

（3）RNA粗提液的制备：用枪头吸取50-100μl自然样品核酸粗提试剂加入到离 心管中，短暂离心后，于涡旋振荡器上剧烈振荡至少5min，并经短暂离心，上清液即 为RNA粗提液；

（4）核酸扩增(NASBA)反应：在200μl离心管中分别加入2μl去离子水、4μl 5×NASBA Buffer、5μl NTP和5×Primer mix和步骤（3）制备的RNA粗提液1μl及阴性 和阳性对照，离心混匀；65℃水浴锅孵育5min后在41℃水浴锅孵育5min；加入5μl 4×Enzymemix，并迅速放回41℃并孵育5min；轻弹离心管混匀，41℃水浴锅孵育5min， 1000rpm离心30s收集试管壁上的液体，41℃水浴锅孵育90min。

（5）核酸变性：步骤（4）制备的RNA与RNA变性剂以1:3的体积比混匀反应 约5min，使RNA变性；用枪头在每个方格里点样1~2μl,自然晾干；将点样后的NCM 夹于两层滤纸中间,在80°C烘箱内处理2h。

（6）核酸杂交：将膜分类基因芯片条放入杂交袋中，按膜大小加入含步骤（4） 制备的变性RNA的杂交液（0.2ml/cm²），封口混匀后，于42°C水浴中孵育1～2h。

（7）洗膜：剪开杂交袋，按下列次序进行洗膜：a.用2×SSC/0.1%SDS室温 洗膜5min2次；b.用0.1×SSC/0.1%SDS42°C洗膜15min2次；c.用Buffer I室温洗 膜2min；d.用Buffer II温洗膜30min（袋中进行）。

（8）抗体反应：剪开含探针的杂交袋一角,加入1/5000体积的AP-抗DIG，在室 温振荡30min；在室温下分别用Buffer I洗膜15min2次，Buffer III洗膜2min1次。

（9）显色反应：在杂交袋中按膜大小加入Buffer III（0.2ml/cm²），并按8/1000的 比例加入显色剂，封口混匀，置于暗处,显色15min~2h,可短时间取出膜观察,勿搅动； 在样品明显出现颜色而本底开始变色时,停止显色,取出膜,置于50ml水中15～30 min，将膜置于滤纸上晾干,对光观察结果，可将膜封装于干的杂交袋中备查。

（10）结果判读（参照图1）：参照阴性和阳性对照结果进行检测样品的判读，其 中阳性对照有显色斑点（PC）、阴性对照无显色斑点（NC）；对于检测样品，如果对应 区域（种特异性探针已知）有显色斑点（同阳性对照）则表明水样中有该种赤潮藻的存 在，如果对应区域无显色斑点（同阴性对照），则表明水样中该藻的存在。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换， 而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。