特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原的人抗体

摘要

本发明提供特异性结合HBV表面抗原(HBsAg)的抗体，其可有效预防和治疗乙型肝炎。

说明书

技术领域

本发明涉及特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的抗体。

背景技术

乙型肝炎病毒(HBV)是嗜肝DNA病毒科中的一员，它会引发急 性和慢性肝炎。世界人口中大约3.5亿人，尤其在韩国和中国5-8% 的人口是慢性HBV患者，而且HBV是肝病和肝癌的主因。虽然抗 HBV疫苗的发展使预防乙型肝炎成为可能，但仍有很多人由于HBV 感染而患上慢性肝炎。HBV感染会引起肝炎、肝硬化和肝癌，而且 在慢性肝炎患者中肝癌的发生率比正常人高300倍，WHO(世界卫生 组织)透露大约80%的肝癌是通过HBV感染由慢性乙型肝炎引起的。

目前可用的乙型肝炎治疗药物包括核苷酸类似物，如拉米夫定 (lamivudine)、阿德福韦酯(adefovir dipivoxil)以及其它核苷酸类似物， 已知它们能够抑制HBV的DNA聚合酶。但是，施用该类药物三年 后，在75%的患者中出现了抗性病毒，导致疗效降低，因此将它们与 乙型肝炎抗体制剂联合应用以预防垂直传播和肝移植后的感染。

目前应用的乙型肝炎抗体制剂是采用高技术纯化和病毒灭活的 方法，以具有抗-HBV抗体的人血为来源制备的，但由于具有高抗 -HBV抗体的昂贵人血浆可用性低以及灭活似乎可行的人血浆来源的 病毒成本高，这种方法不能满足日益增长的需要。

尽管和Milstein(1975)建立了制备单克隆抗体(mAb)的方 法，源于小鼠的单克隆抗体已主要用于诊断或一些治疗。然而，由于 以治疗目的施用于人体时，可能产生人抗鼠抗体(HAMA)，该鼠抗体 不能施用。为了解决HAMA的问题，已经开发出了嵌合的和人源化 的抗体。嵌合抗体含有鼠mAb的可变区(Fv片段)，其构成了整个抗 体分子的约30%。相比之下，人源化抗体含有鼠mAb的CDRs(互补 决定区)，其构成了整个抗体的约10%。虽然这类嵌合的和人源化的 抗体明显降低了HAMA反应，但在治疗需要长期和持续施用的慢性 病如慢性肝炎时，采用人抗体可能更好。

本发明致力于开发新的改进抗体(improved antibodies)，并发现这 类抗体可通过结合HBV表面抗原而用于灭活HBV。

发明概述

因此，本发明的一个目的是提供一种特异性结合乙型肝炎病毒表 面抗原的新抗体。

本发明的另一个目的是提供分别编码所述抗体的重链可变区和 轻链可变区的DNA，以及包括其的表达载体。

本发明的再一个目的是提供用所述表达载体转化的细胞系。

本发明的又一个目的是提供用于预防或治疗乙型肝炎的药物组 合物，其包括所述抗体。

根据本发明的一个方面，本发明提供特异性结合乙型肝炎病毒表 面抗原(HBsAg)的抗体，其包括：a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸 序列的重链可变区；b)具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列 中任何一个或多个的轻链可变区；c)重链恒定区；以及d)轻链恒定 区。

根据本发明的另一个方面，本发明提供编码具有SEQ ID NO:1 所示氨基酸序列的重链可变区或具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基 酸序列中任何一个或多个的轻链可变区的DNA，以及包括其的表达 载体。

根据本发明的再一个方面，本发明提供用所述表达载体转化的细 胞系。

根据本发明的又一个的方面，本发明提供用于预防或治疗乙型肝 炎的药物组合物，其包括所述抗体。

附图说明

结合附图从本发明下面的描述中，本发明的上述和其它目的及特 性将更加明显，图中分别显示如下：

图1：电泳(1%琼脂糖凝胶)分析的图像结果，显示PCR合成的分 别编码本发明的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的DNA；

图2：包括本发明抗体的重链可变区和轻链可变区的噬菌体展示 载体pKS4H的图谱；

图3：说明利用淘选技术(the panning technique)从抗体库筛选抗 体过程的简图；

图4：从抗体库筛选出的本发明抗体的单链可变片段(scFv)的氨 基酸序列；

图5：表达本发明的人抗体的重链HB48-33-重-pRC13、HB48-35- 重-pRC13或HB48-59-重-pRC13的表达载体的图谱；

图6、7和8：分别为表达本发明的人抗体的轻链HB48-33-轻 -pKC12、HB48-35-轻-pKC12和HB48-59-轻-pKC12的表达载体的图 谱；

图9：从转化子表达的重链和轻链的SDS-PAGE分析；

图10：人抗体(HB48-33、HB48-35和HB48-59)对HBV表面抗 原的相对亲和力；

图11：通过插入HBV DNA序列而由pcDNA3.1制备的载体 pHBV1.3-MBRI的图谱，该载体用于制备急性乙型肝炎小鼠模型；

图12：显示本发明人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的中 和能力的曲线图，HB48-33、HB48-35和HB48-59是利用急性乙型肝 炎小鼠模型通过体内效力试验筛选出的。已证实注射图11的质粒24 小时后表达了HBV表面抗原(HBsAg)，经施用本发明抗体后表面抗 原减少。表面抗原采用Genedia HBsAg ELISA 3.0(Green Cross MS,韩 国)测定。

发明详述

以下将详述本发明。

本发明提供一种特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的 抗体，其包括：a)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的重链可变区； b)具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任何一个或多个的 轻链可变区；c)重链恒定区；以及d)轻链恒定区。本发明的抗体的 特征在于，通过特异性结合乙型肝炎病毒表面抗原以灭活HBV，有 效预防或治疗乙型肝炎。

特异性结合HBV表面抗原的抗体可通过改良的噬菌体展示方法 (a phage display method)(Smith,科学(Science),228,1315-1317,1985； 以及Hoogenboom&Chames,今日免疫学(Immunol Today),21, 371-378,2000)而优选地筛选。在噬菌体展示方法中，编码丝状噬菌 体(如M13、Fd或F1)表面蛋白的基因(基因III)与编码目标抗体的基 因融合，以生成具有以抗体-噬菌体形式暴露在表面的融合抗体(a  fused antibody)的病毒颗粒。随后，通过生物淘选技术，利用该抗体 的高特异性和亲和性以及该噬菌体的高感染性可从噬菌体库中筛选 目标抗体(Burton&Barbas,免疫学前沿(Adv.Immunol.),57,191-280, 1994；Winter等,免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.),12,433-455, 1994；以及Hoogenboom等，免疫技术(Imunotechnology),4,1-20, 1998；Kim等,Hybrid Hybridomics,21,385-392,2002)。噬菌体展示 载体可以为pKS4H(见韩国专利No.0635370)或pCANTAB5E，优选 pKS4H。

本发明人已经从噬菌体库中筛选出三种人抗体(HB48-33、 HB48-35和HB48-59)，并检测了抗体的亲和力和对于HBV表面抗原 的中和能力(图10和11)。另外，还分析了重链和轻链可变区的氨基 酸序列，并分别证实所有重链可变区具有SEQ ID NO:1所示的氨基 酸序列，轻链可变区具有SEQ ID NO:2、3和4所示的氨基酸序列。

本发明抗体的重链和轻链恒定区与人抗体的重链和轻链恒定区 相同。

本发明提供编码具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的抗体重链 可变区的DNA。优选地，该DNA可以包括编码SEQ ID NO:1所示 氨基酸序列的具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的多聚核苷酸。

本发明提供编码具有SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列中任 何一个或多个的抗体轻链可变区的DNA。优选地，该DNA可以包括 编码SEQ ID NO:2、3和4所示氨基酸序列的具有SEQ ID NO：6、7 和8所示核苷酸序列中任何一个或多个的多聚核苷酸。

本发明提供表达特异性结合HBV表面抗原的抗体的重链可变区 的表达载体，其包括编码该抗体的重链可变区的DNA。优选地，所 述表达载体可以为“HB48-33-重-pRC13”、“HB48-35-重-pRC13”或 “HB48-59-重-pRC13”，其图谱如图5所示。

具体地，该载体可以通过将用淘选法筛选出的抗体的VH片段 (HB48VH)插入到合适的载体，如pRC13载体(保藏编号No. KCLRF-BP-00054；韩国专利No.523732)来制备。

本发明提供表达特异性结合HBV表面抗原的抗体的轻链可变区 的表达载体，其包括编码抗体轻链可变区的DNA。优选地，该表达 载体可以为其图谱如图6所示出的“HB48-33-轻-pKC13”、其图谱如 图7所示出的“HB48-35-轻-pKC13”或其图谱如图8所示出的 “HB48-59-轻-pKC13”。

具体地，该载体可以通过将用淘选法筛选出的抗体的各VL片段 (HB48-33VL、HB48-35VL或HB48-59VL)插入到合适的载体，如 pKC12载体(保藏编号No.KCLRF-BP-00054；韩国专利No.523732) 来制备。

本发明提供一种用表达本发明抗体的重链和轻链可变区的表达 载体转化的动物细胞系。该动物细胞系可以是CHO(中国仓鼠卵巢)、 HEK 293或NSO细胞系，优选CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系。

本发明的抗体可通过将重链和轻链的可变区相互连接来制备。

可通过诸如竞争性ELISA法(Kim等,Hybridoma,20,265-272, 2001)测定本发明抗体对抗原的亲和力。如图10所示，在本发明的人 抗体中，HB48-35的亲和力最高，而HB48-59和HB48-33的亲和力 分别比HB48-35低约1.3倍和4倍。此外，通过将HBV DNA高压水 注射至C57BL6小鼠以诱导乙型肝炎样症状(高压水注射 (Hydrodynamic injection)；Liu等,基因治疗(Gene Therapy),6, 1258-1266,1999)而制备HBV小鼠模型，在该HBV小鼠模型中， HB48-33、HB48-35和HB48-59抗体显示出对HBV的中和能力，其 中小鼠血液中抗体将HBV的表面抗原降低到基准水平(图12)。因此， 本发明的抗体可通过结合HBV表面抗原来灭活HBV，用于预防或治 疗乙型肝炎。

考虑到该结果，本发明提供一种预防或治疗乙型肝炎的药物组合 物，其包括所述抗体。本发明的药物组合物可根据常规方法制成药物 制剂。制剂过程中，优选将抗体与载体混合或用载体稀释，或装入容 器形式的载体中。当载体作为稀释剂时，其可以为固体、半固体或液 体，用作用于抗体的囊泡、赋形剂或培养基。因此，制剂可以是片剂、 丸剂、粉剂、袋装剂、胶囊、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、 气溶胶、软和硬明胶胶囊、注射用无菌溶液、无菌粉剂等形式。合适 的载体、赋形剂或稀释剂的实例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、 甘露醇、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷 酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿 物油。制剂还可以包括填充剂、抗凝血剂、润滑剂、润湿剂、调味剂、 乳化剂、防腐剂等。本发明的抗体组合物还可以进一步包括与抗体协 同作用的干扰剂、抗-HBV单克隆抗体、抗-HBV多克隆抗体、核苷 类似物、DNA聚合酶抑制剂、siRNA制剂或用作抗病毒剂的治疗用 疫苗。

通过向包括人的哺乳动物施用本发明组合物，可预防或治疗 HBV感染和HBV相关疾病。组合物中抗体的剂量取决于对象、病症 严重程度、施用频率和医生的决定。作为有效成分的抗体可以每天以 约0.001-10mg/kg体重，优选0.005-1mg/kg体重的有效剂量，通过非 肠道途径单剂量或分剂量地施用于哺乳动物。在某些情况下，相对于 上述剂量，小剂量或大剂量可能是合适的，而大剂量可以每天分为小 剂量施用。

以下实施例仅用于说明目的，而非旨在限制本发明的范围。

实施例1：RNA的分离

为筛选出特异性结合HBV表面抗原的抗体，建立了人抗体库。 采用来自人骨髓、人胸腺、人脾脏和人类B细胞的RNA混合物。除 了人类B细胞RNA外，其它RNA均购自Clontech(美国)，人类B 细胞RNA按如下分离：

将取自健康成人的50mL血液通过与50mL PBS混合进行稀释。 将3mL Ficoll-Paque PLUS(通用医疗集团(GE Healthcare),美国)放 入15mL试管中，并向其中加入4mL稀释的血液。将混合物在3000rpm 离心以分离白血球。将2mL分离的白血球与6mL PBS混合，以100×g 离心10分钟。将100μL白血球与1mL三唑(Trizole)(生命科技公司 (Life Technology),美国)混合以分离RNA。

同时，分离的RNA用蒸馏水稀释，测定260nm处的吸收度来计 算其数量(1.8μg/μL;Ultraspec 2000UV-VIS分光光度计,GE,美国)。 详细过程如下：

将1mL三唑(trizole)加入到100μL白血球中，充分摇匀，室温(15 ℃-30℃)放置5分钟。然后加入200μL氯仿，剧烈振荡15秒，室温 放置3分钟。随后，将混合物在2~8℃的条件下，15,000rpm离心 15分钟，上清液转移至新的试管。加入500μL异丙醇，混匀，室温 放置10分钟。随后，将混合物在2~8℃的条件下，15,000rpm离心5 分钟以去除上清液。向其中加入1mL 75%乙醇，将混合物在2~8℃的 条件下，15,000rpm离心5分钟以除去乙醇，将RNA团块在室温干 燥5分钟，向其中加入150μL蒸馏水以悬浮RNA团块，在260nm处 测定悬浮液的吸收度。剩余物在-20℃保存。

实施例2：抗体基因的扩增

将1μg实施例1分离的RNA和1μL pd(T)_12-18(0.5μg/μL)与蒸 馏水混合使终体积为12.5μL。使混合物在70℃反应2分钟并在冰中 冷却。然后，向其中加入5X反应缓冲液、10mM dNTP mix、重组 RNase抑制剂和MMLV逆转录酶(Clontech,美国)，使终体积为20μL， 随后在42℃反应1小时并在95℃反应5分钟以合成cDNA。用 LiquiMix QM Premix,Magenta(Neurotics Inc,韩国)进行PCR反应，4 μL cDNA为模板，19μL蒸馏水，以及1μL(25pmol/μL)引物设计为 scFv区、重链可变区和轻链可变区(κ(kappa)和λ(lambda))分别为：[ScFv: SEQ ID NO:9(正向)，10(反向-κ)和11(反向-λ)；重链可变区：SEQ ID  NO:12(正向-VH1)，13(正向-VH2)，14(正向-VH3)，15(正向-VH4)， 16(正向-VH5)，17(正向-VH6)，18(正向-VH7)，19(反向)；轻链可 变区κ链：SEQ ID NO：20(正向-VK1/3A)，21(正向-VK1/3B)，22(正 向-VK2)，23(正向-VK4)，24(正向-VK5)，25(正向-VK6)，26(反向 -JK-A)，27(反向-JK-B)和28(反向-JK-C)；轻链可变区λ链：SEQ ID NO：29(正向-VL1~3-A)，30(正向-VL1~3-B)，31(正向-VL4)，32(正 向-VL5)，33(正向-VL6)，34(正向-VL7)，35(正向-VL8)，36(正向 -VL9)，37(正向-VL10)，38(反向-JL-A)和39(反向-JL-B)。

PCR反应条件为：95℃5分钟，95℃1分钟，55℃2分钟，72 ℃2分钟，30个循环，最后72℃15分钟。

通过在1.2%琼脂糖凝胶上进行电泳来鉴定扩增的抗体DNA(图 1)，采用Qiagen试剂盒(Qiagen,德国)进行纯化。如图1所示，获得 了对应于重链和轻链可变区(κ和λ)的350bp DNA带。图1中，M是 指分子量标记(size marker)，VH：重链可变区(1道：I型重链可变区； 2道：II型重链可变区；3道：III型重链可变区；4道：VI型重链可 变区；5道：V型重链可变区；6道:VI型重链可变区；以及7道： VII型重链可变区)，而VL是指轻链可变区(9道：1/3κ轻链可变区； 10道：2κ轻链可变区；11道：4κ轻链可变区；12道：5κ轻链可变 区；13道：6κ轻链可变区；15道：1~3λ轻链可变区；16道：4λ轻 链可变区：17道：5λ轻链可变区；18道：6λ轻链可变区；19道：7λ 轻链可变区；20道：8λ轻链可变区；21道：9λ轻链可变区；以及 22道：10λ轻链可变区)。

实施例3：抗体DNA的限制性酶切

分别用限制性内切酶SfiI/BspEI和BspEI/NotI对实施例2制备的 VH和VL(κ和λ)进行酶切，酶切片段从1.2%琼脂糖凝胶电泳分离， 采用Qiagen试剂盒纯化。

实施例4：抗体DNA的连接(Ligation)和库的制备

采用限制性内切酶SfiI/BspEI酶切噬菌体展示载体pKS4H(株式 会社绿十字(Green cross Corp.)，韩国，见韩国专利No.0635370)，利 用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，随后采用Qiagen试剂盒纯化。将40μg pKS4H与10μg实施例3制备的VH混合，向其中加入T4DNA连接 酶(ligase)(New England BioLabs,美国)，随后在25℃反应过夜。连接 混合物采用Qiagen试剂盒纯化，并通过电穿孔法转化到大肠杆菌(E. coli)XL1-blue(Stratagene,美国)中，转化体在100mL培养基中培养过 夜，并分离质粒。该质粒被命名为“pKS4H-VH-ΔVL”。

用限制性内切酶BspEI/NotI对质粒pKS4H-VH-ΔVL进行酶切， 并如上所述进行纯化。然后，将40μg pKS4H-VH-ΔVL质粒与10μg 实施例3制备的VL PCR DNA以及T4DNA连接酶(New England  BioLabs,美国)混合，在25℃反应过夜。连接混合物采用Qiagen试剂 盒纯化，并通过电穿孔法转化到大肠杆菌(E.coli)XL1-blue(Stratagene, 美国)中。转化体在100mL含有羧苄青霉素和四环素的培养基中在37 ℃培养2小时。随后，如Engberg等人(Mol.Biotechnol.,6,287-310, 1995)的报道，将M13辅助噬菌体(Stratagene,美国)接种到培养基中 并培养16小时以制备噬菌体库。同时，从大肠杆菌分离质粒并命名 为“pKS4H-VH-VL”，该质粒图谱在图2示出。

实施例5：筛选结合HBV表面抗原的抗体

结合HBV表面抗原的抗体通过改良的淘选技术(Engberg等,Mol. Biotechnol.,6,287-310,1996；以及Kim等,基因(Gene),241,19-25, 2000)来筛选。具体地，将HBV表面抗原(株式会社绿十字(Green cross  Corp.),韩国)用PBS稀释，并用稀释的抗原包被每个免疫管(NUNC, 丹麦)。然后将实施例4制备的噬菌体库加入到包被的免疫管，并在 37℃孵育2小时。采用0.1M甘氨酸缓冲液(pH 2.0)洗提结合HBV的 噬菌体。随后，用噬菌体感染大肠杆菌(E.coli)XL1-blue并加入辅助 噬菌体。将该大肠杆菌孵育过夜并向其中加入PEG溶液(20%PEG 8,000和15%NaCl)。然后，收集沉淀的噬菌体(噬菌体挽救(phage  rescue))，并使噬菌体与HBV表面抗原包被的免疫管再次进行反应， 上述过程重复4次。从该过程中筛选出三个结合HBV表面抗原的人 抗体，并命名为HB48-33、HB48-35和HB48-59。图3说明了采用噬 菌体展示库筛选人抗体的过程。

根据常规方法(Kim等,基因(Gene),241,19-25,2000)，使来自第 4次淘选的各个菌落在2mL培养基中生长，通过IPTG(异丙基-β-D-1- 硫代半乳吡喃糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside))处理以诱导 抗体表达。通过ELISA法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，酶 联免疫吸附检测)采用包被HBV表面抗原的96孔板测定抗体的表达。

实施例6：筛选出的抗体的序列分析

将分泌实施例5筛选出的人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59 的菌落在含有50μg/mL羧苄青霉素的10mLLB培养基中生长过夜， 并采用Qiagen质粒微型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA,美国)从中分离 质粒。将质粒用SfiI/NotI酶切，并在琼脂糖凝胶中电泳以鉴定抗体 片段的插入。分析插入质粒中的scFv的DNA序列，用Genotech (Daejeon,韩国)的SEQ ID NO:40所示的测序引物p033分析scFv的 核苷酸序列。

采用基于网络的程序(www.expasy.org:DNA-蛋白质翻译工具 (DNA to Protein translate tool))将人抗体HB48-33、HB48-35和 HB48-59的scFv的DNA序列翻译成氨基酸。翻译的氨基酸序列见图 4。如图4所示，人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59具有以相同 氨基酸序列表示的重链可变区和不同氨基酸序列表示的轻链可变区。

实施例7：表达载体的构建

为了将抗体片段转化为完整的免疫球蛋白，采用抗体表达载体 pRC13和pKC12(见韩国专利No.523732；保藏号：KCLRF-BP-00054)。

重链表达载体pRC13是其中抗体的VH片段易于插入HindIII和 ApaI位点的载体。如图5的示例，采用SEQ ID NO:41(正向)和42(反 向)所示的引物在95℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的条件下， 通过PCR扩增编码人抗体HB48-33、HB48-35和HB48-59的重链可 变区的DNA，用HindIII/ApaI酶切，并插入至经相同限制性内切酶 酶切的pRC13中。重组载体被命名为“HB48-33-重-pRC13”、 “HB48-35-重-pRC13”或“HB48-59-重-pRC13”(见图5)。

同时，轻链表达载体pKC12是其中抗体的VL片段易于插入NheI 和ApaI位点的载体。如图6、7和8的示例，采用SEQ ID NO:43(正 向)和44(反向)所示的引物在95℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分 钟的条件下，通过PCR扩增编码人抗体HB48-35和HB48-59的κ轻 链可变区的DNA，采用SEQ ID NO:43(正向)和45(反向)所示的引 物在95℃1分钟、55℃2分钟、72℃2分钟的条件下，通过PCR 扩增编码人抗体HB48-33的λ轻链可变区的DNA。用NheI/ApaI酶 切扩增的DNA，并插入至经相同限制性内切酶酶切的pKC12中。重 组载体被分别命名为“HB48-33-轻-pKC12”,“HB48-35-轻-pKC12”和 “HB48-33-轻-pKC12”(见图6、7和8)。

实施例8：分泌抗体的动物细胞系的构建

在转染前，在5%CO₂、37℃的孵育箱中，使2×10⁵CHO(中国 仓鼠卵巢)细胞在装有包括10%FBS(生命科技公司(Life  Technologies)，美国)的α-MEM培养基(生命科技公司，美国)的T-25 瓶(NUNC,丹麦)中生长24小时，直至达到50%融合(confluency)。然 后，将30μg脂质体(lipofectin)(生命科技公司，美国)加入至1.5mL 的opti-MEM(生命科技公司，美国)并在室温静置90分钟。同时将8 μgHB48-33-重-pRC13&7μgHB48-33-轻-pKC12、8μgHB48-35-重 -pRC13&7μgHB48-35-轻-pKC12和8μgHB48-59-重-pRC13&7μg HB48-59-轻-pKC12分别混合，加入到15mL opti-MEM中，然后室温 静置90分钟。90分钟后，将含有脂质体的培养基与含有HB48-33- 重-pRC13&HB48-33-轻-pKC12、HB48-35-重-pRC13&HB48-35-轻 -pKC12和HB48-59-重-pRC13&HB48-59-轻-pKC12的培养基分别混 合，室温孵育15分钟。反应过程中，将培养基从细胞中移除，将细 胞用PBS冲洗三次用于转染。将反应混合物加入至洗过的细胞中并 孵育6小时。6小时后，移除反应混合物，加入α-MEM培养基并孵 育48小时。然后用胰蛋白酶(trypsin)(生命科技公司，美国)处理该细 胞以脱离烧瓶，用α-MEM培养基稀释并在96-孔板(NUNC,丹麦)进 行次培养。此时，α-MEM培养基不含核糖核苷和脱氧核糖核苷，但 包含10%透析的FBS(生命科技公司，美国)和550μg/mL G418(Sigma, 美国)。每两天用新鲜培养基替换该培养基。收集培养物上清液形成 的菌落进行ELISA分析，将筛选的细胞转移至12孔板。当细胞在12 孔板长好后，将细胞转移至6孔板，当细胞在6孔板也长好后，用甲 氨蝶呤(MTX,Choongwae Pharma Corporation,韩国)处理细胞。MTX 的初始浓度为20nM，然后依据细胞的适应能力增加到80nM，320 nM和1μM。筛选出在1μM的浓度存活的并具有大量抗体分泌物的 细胞系。筛选的细胞系用转瓶和无血清培养基在孵育箱中，以65rpm、 5%CO₂和37℃大量培养。在装有100mL无血清培养基的250mL烧 瓶中培养10⁸细胞，当细胞数量变成初始接种的两倍，以1,000rpm 离心5分钟收集细胞。将收集的细胞再在装有200mL培养基的500 mL烧瓶中培养，当细胞数量变成初始接种的两倍，以1,000rpm离 心5分钟收集细胞，并转移到装有1L培养基的3L转瓶中。向其中 加入丁酸钠(Aldrich,美国)直至终浓度为2mM，将细胞培养5天，从 培养基中收集上清液。从转瓶收集的上清液中采用蛋白A-琼脂糖柱 (protein A-agarose column)(Amersham Pharmacia Biotech,美国)纯化 抗体并用SDS-PAGE分析。

如图9所示，观测到约50kDa的重链带和25kDa的轻链带，显 示抗体已正确合成。

实施例9：抗体亲和力的测量

采用竞争性ELISA法(Kim等,Hybridoma,20,265-272,2001)测定 实施例8得到的抗体对HBV表面抗原的亲和力，结果如图10所示， 简要过程如下：

(1)抗体最佳浓度的确定

A.板的准备

将以PBS稀释的100μL 2μg/mL HBV表面抗原(株式会社绿十字 (Green cross Corp.),韩国)加入酶标板(ELISA plate)的各孔并在4℃孵 育过夜。板上的各孔均用PBST冲洗一次，向各孔中均加入300μL 1% BSA-PBS溶液，并在室温孵育1小时。

B.第一次反应

向板上的每个孔中加入100μL各纯化的抗体(0.5μg/mL)，在室 温孵育2小时，并用PBST冲洗四次。

C.第二次反应

将在1%BSA-PBS中以1:5000稀释的100μL羊抗人IgG(Fab特 异的)-过氧化物酶标记物(perxoidase conjugate)(Sigma)加入各孔，在室 温孵育1小时，并用PBST冲洗四次。

D.底物反应

将100μL TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，微孔过氧化物底物系统 (Microwell peroxidase substrate system)(KPL,MD,美国)加入到各孔中 并在405nm处检测O.D.值。产生半最大结合值时的抗体浓度确定为 最佳抗体浓度。

(2)竞争性ELISA

A.板的准备

将以PBS稀释的100μL 2μg/mL HBV表面抗原(株式会社绿十 字，韩国)加入到酶标板的各孔中并在4℃孵育过夜。每个孔均用PBST 冲洗一次，向每个孔中均加入300μL 1%BSA-PBS溶液，并在室温 孵育1小时。

B.第一次反应

将2μg HBV表面抗原连续经两倍稀释，10μL该稀释的HBsAg 加入到板的各孔中。然后，将90μL稀释至上述(1)中确定的最佳浓度 的抗体加入到各孔中，在室温孵育2小时，并用PBST冲洗四次。

C.第二次反应

将在1%BSA-PBS中以1:5000稀释的100μL羊抗人IgG(Fab 特异的)-过氧化物酶标记物(Sigma)加入到各孔中，在室温孵育1小时， 并用PBST冲洗四次。

D.底物反应

将100μL TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺，微孔过氧化物底物系统 (KPL,MD,美国)加入到各孔中并在405nm处检测O.D.值。将抑制 50%最大结合值(没有竞争EGFR存在的O.D.值)的HBsAg浓度确定 为Kd。

如图10所示，在本发明的人抗体中，HB48-35的亲和力最高， 而HB48-59和HB48-33的亲和力分别比HB48-35的低约1.3倍和4 倍。

实施例10：采用急性乙型肝炎小鼠模型的体内效力试验

在C57BL6小鼠模型中比较HB48-33、HB48-35和HB48-59对 HBsAg的中和能力，该小鼠模型通过高压水注射HBV DNA来表现 乙型肝炎样症状。

20只四周龄、体重约20克的雌性C57BL6小鼠购自查尔斯河实 验室(Charles Liver Laboratory)(MA,美国)，如表1所示，分成四组， 每组5只。

<表1>

  组   小鼠数量   试验材料和路线   剂量   对照组   5   PBS，高压水注射   0.2mL   实验组I   5   HB48-330.1mg，高压水注射   0.2mL   实验组I   5   HB48-350.1mg，高压水注射   0.2mL   实验组I   5   HB48-590.1mg，高压水注射   0.2mL

将20μg通过将HBV DNA插入至pcDNA3.1(Invitrogen,美国) 而构建的载体pHBV-MBRI(Shin等，病毒研究(Virus Research)119, 146-153,2006;见图11)以重量体积浓度9.5%，0.3mL/min的速度经 小鼠尾静脉注射所有小鼠以诱导急性肝炎。24小时后，将0.2mL表 1所列的试验材料经小鼠尾静脉注射。在注射前(0小时)、注射后24 小时和注射后48小时分离血清。分离的血清用山羊血清稀释10倍， 然后采用Genedia HBsAg ELISA 3.0(Green Cross MS,韩国)测定 HBsAg的血液浓度，结果见图12。如图12所示，在静脉注射PBS 的对照组中，HBsAg的血液浓度维持最大值48小时。相较而言，在 经0.1mg HB48-33(实验组I)、0.1mg HB48-35(实验组II)和0.1mg HB48-59(实验组III)处理的组中，在24小时到48小时，几乎没有检 测到HBsAg的血液浓度。因此，证实本发明的抗体可非常有效地中 和HBV表面抗原。

虽然以上述具体实施例描述了本发明，但应该认识到本领域技术 人员可对发明做出各种修改和变化，其也应落入所附权利要求定义的 本发明的范围内。