从含有琥珀酸二铵、琥珀酸一铵和/或琥珀酸的发酵液制备琥珀酸一铵的方法及琥珀酸一铵到琥珀酸的转化

摘要

用于从含有琥珀酸二铵（DAS）的澄清的发酵液或从含有琥珀酸一铵（MAS）的澄清的发酵液制备琥珀酸一铵（MAS）和/或琥珀酸（SA）的方法包括：（a）蒸馏所述发酵液以形成包括水和可选地包括氨的顶部馏出物以及包括MAS或SA的液态底部残留物；（b）使所述底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到所述底部残留物中，以得到足以使所述底部残留物制备与液态部分接触的含有MAS或SA的固态部分的温度和组成；（c）从所述液态部分中分离出所述固态部分；以及（d）回收所述固态部分。

说明书

相关申请

本申请要求2010年3月26日递交的第61/317,799号美国临时申请、2010 年4月1日递交的第61/320,053号美国临时申请和2010年4月30日递交的第 61/329,742号美国临时申请的权益，这些美国临时申请的主题通过引用方式并入 本文。

技术领域

本发明涉及从含有琥珀酸二铵（DAS）、琥珀酸一铵（MAS）和/或琥珀酸（SA） 的发酵液直接制备MAS的方法。本发明还涉及将如此获得的MAS转化成SA。

背景技术

糖发酵的某些碳质产物被视为石油衍生材料的替代物，以用作制造含碳化 学物质的原料。一种这样的产物为MAS。

SA可通过微生物使用可发酵的碳源（例如糖）作为起始物质制备而成。然 而，商业上最可行的并且在文献中描述的产生琥珀酸的微生物对发酵液进行中 和以维持适合最大生长、转化和生产率的pH值。通常，通过将氢氧化铵加入至 发酵液，来使发酵液的pH值维持为7或接近7，由此将琥珀酸转化成琥珀酸二 铵。

可替选地，可通过加入钠碱、钾碱、镁碱或其混合物（包括与铵碱的混合 物）使发酵液的pH值维持在所选的值。碱的添加使SA转化成SA的其他盐。 例如，其他碱可包括K⁺、Na⁺和Mg²⁺。

Kushiki（公布号为2005-139156的日本公布的专利申请）公开了一种从DAS 的水溶液获取MAS的方法，所述DAS的水溶液可以自加入有铵盐作为反离子 的发酵液获得。具体地，通过以下步骤自DAS的水溶液结晶出MAS：将乙酸 加入到DAS的水溶液以将该溶液的pH值调节至4.6和6.3之间，从而使不纯的 MAS从该溶液结晶出。

Masuda（日本未审查的专利公布P2007-254354，2007年10月4日）描述 了分子式为H₄NOOCCH₂CH₂COONH₄的“琥珀酸铵”的稀水溶液的部分脱氨。从 公开的分子式可以看出，“琥珀酸铵”为琥珀酸二铵。Masuda通过加热琥珀酸铵 的溶液来去除水和氨，以产生固态的基于琥珀酸的组合物，该组合物除了含有 琥珀酸铵以外，还含有琥珀酸一铵、琥珀酸、琥珀一酰胺、琥珀酰亚胺、琥珀 酰胺或琥珀酸酯中的至少一种。因此，可以推测，与Kushiki相似，Masuda也 公开了导致产生不纯的MAS的方法。Kushiki和Masuda的方法生成的物质都需 要经受多种提纯手段以制备高纯度的MAS。

期望具有一种用于从含有DAS、MAS和/或SA的发酵液直接制备基本上纯 的MAS的方法。

发明内容

本发明通过从含有DAS的澄清的发酵液经济地制备高纯度的MAS而提供 了这样的方法。从而，本发明提供一种用于从含有DAS的澄清的发酵液制备 MAS的方法，其中，DAS优选地构成该发酵液中所包括的全部二羧酸二铵盐的 至少90wt%（重量百分比），该方法包括：（a）蒸馏发酵液以形成包含水和氨的 顶部馏出物以及包含MAS、至少一些DAS和至少约20wt%的水的液态底部残 留物；（b）使底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到所述底部 残留物中，以得到足以使所述底部残留物分离成含有DAS的液态部分和基本上 不含有DAS的含有MAS的固态部分的温度和组成；（c）将所述固态部分从所 述液态部分中分离出；以及（d）回收所述固态部分。

本发明还提供了一种用于从含有DAS的发酵液制备SA的方法，该方法包 括：（a）蒸馏发酵液以形成包含水和氨的第一顶部馏出物以及包含MAS、至少 一些DAS和至少约20wt%的水的第一液态底部残留物；（b）使所述底部残留物 冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到底部残留物中，以得到足以使所述 底部残留物分离成含有DAS的液态部分和基本上不含有DAS的含有MAS的固 态部分的温度和组成；（c）从所述液态部分中分离出所述固态部分；（d）回收 所述固态部分；（e）将所述固态部分溶解在水中以制备MAS水溶液；（f）在足 以形成包括水和氨的第二顶部馏出物以及包括大部分的SA、少部分MAS和水 的第二底部残留物的温度和压力下，蒸馏MAS的水溶液；（g）使第二底部残留 物冷却和/或蒸发以使第二底部残留物分离成与第二固态部分接触的第二液态部 分，第二固态部分主要由SA组成且基本上不含有MAS；（h）从第二液态部分 中分离出第二固态部分；以及（i）回收第二固态部分。

本发明还提供了一种用于从含有MAS的澄清的发酵液制备MAS的方法， 该方法包括：（a）可选地，将MAS、DAS、SA、NH₃和/或NH₄⁺添加到发酵液 中以优选地维持发酵液的pH小于6；（b）蒸馏发酵液以形成包括水和可选地包 括氨的顶部馏出物以及包括MAS、至少一些DAS和至少约20wt%的水的液态 底部残留物；（c）使底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到底 部残留物中，以得到足以使底部残留物分离成含有DAS的液态部分和基本上不 含有DAS的含有MAS的固态部分的温度和组成；（d）从所述液态部分中分离 出所述固态部分；以及（e）回收所述固态部分。

本发明还提供了一种用于从含有MAS的澄清的发酵液制备SA的方法，该 方法包括：（a）可选地，将MAS、DAS、SA、NH₃和/或NH₄⁺添加到发酵液中 以优选地维持维持发酵液的pH小于6；（b）蒸馏发酵液以形成包括水和可选地 包括氨的顶部馏出物以及包括MAS、至少一些DAS和至少约20wt%的水的液 态底部残留物；（c）使底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到 底部残留物中，以得到足以使底部残留物分离成含有DAS的液态部分和基本上 不含有DAS的含有MAS的固态部分的温度和组成；（d）从所述液态部分中分 离出所述固态部分；以及（e）回收所述固态部分；（f）将所述固态部分溶解在 水中以制备MAS水溶液；（g）在足以形成包括水和氨的第二顶部馏出物以及包 括大部分的SA、少部分MAS和水的第二底部残留物的温度和压力下，蒸馏MAS 水溶液；（h）使第二底部残留物冷却和/或蒸发，以使第二底部残留物分离成与 第二固态部分接触的第二液态部分，所述第二固态部分主要由SA组成且基本上 不含有MAS；（i）从所述第二液态部分中分离出所述第二固态部分；以及（j） 回收所述第二固态部分。

本发明还提供了用于从含有DAS的澄清的发酵液制备MXS的方法。使含 有DAS的发酵液中的琥珀酸盐转化成MXS以从发酵液获得MXS，其中，当使 用钠（Na）碱时，MXS为琥珀酸一钠（MNaS），当使用钾（K）碱时，MXS 为琥珀酸一钾（MKS），或者当使用氨（NH₄或NH₃）碱时，MXS为MAS。因 此，该方法包括：（a）蒸馏发酵液以形成包括水和氨的顶部馏出物以及包括MXS （其中X为NH₄⁺、Na和K中的至少一种）、至少一些DYS（其中，DYS包括 DAS以及琥珀酸二钠（DNaS）和琥珀酸二钾（DKS）中的至少一种）和至少约 20wt%的水的液态底部残留物；（b）使底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地 将反溶剂添加到底部残留物中，以得到足以使底部残留物分离成含有DYS的液 态部分和基本上不含有DYS的含有MXS的固态部分的温度和组成；（c）从所 述液态部分中分离出所述固态部分；以及（d）回收所述固态部分。

本发明另外地还提供了一种用于从含有MXS的澄清的发酵液制备MXS的 方法，其中X为NH₄⁺、Na和K中的至少一种，该方法包括：（a）可选地，将 SA、NH₃、NH₄⁺、Na⁺和K⁺中的至少一种添加到发酵液中以优选地维持发酵液 的pH小于6；（b）蒸馏发酵液以形成包括水和可选地包括氨的顶部馏出物以及 包括MXS、至少一些DYS（其中，DYS包括DAS、琥珀酸二钠（DNaS）和琥 珀酸二钾（DKS）中的至少一种）以及至少约20wt%的水的液态底部残留物；（c） 使底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到底部残留物中，以得 到足以使所述底部残留物分离成含有DYS的液态部分和基本上不含有DYS的 含有MXS的固态部分的温度和组成；（d）从所述液态部分中分离出所述固态部 分；以及（e）回收所述固态部分。

本发明还提供了一种用于从含有DAS的澄清的发酵液制备琥珀酸镁（MgS） 的方法，该方法包括：（a）蒸馏发酵液以形成包括水和氨的顶部馏出物以及包 括MgS、至少一些DYS（其中，DYS包括DAS和MgS）和至少约20wt%的水 的液态底部残留物；（b）使所述底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶 剂添加到所述底部残留物中，以得到足以使底部残留物分离成含有DAS和MgS 的液态部分和基本上不含有DYS的含有MgS的固态部分的温度和组成；（c）从 所述液态部分中分离出所述固态部分；以及（d）回收所述固态部分。

本发明还提供了一种用于从含有MAS的澄清的发酵液制备MgS的方法， 该方法包括：（a）可选地，根据发酵液的pH，将SA、NH₃、NH₄⁺和Mg²⁺中的 至少一种添加到发酵液中；（b）蒸馏发酵液以形成包括水和可选地包括氨的顶 部馏出物以及包括MgS、至少一些MAS和至少约20wt%的水的液态底部残留 物；（c）使底部残留物冷却和/或蒸发，以及可选地将反溶剂添加到底部残留物 中，以得到足以使底部残留物分离成含有MAS的液态部分和基本上不含有MAS 的含有MgS的固态部分的温度和组成；（d）从所述液态部分中分离出所述固态 部分；以及（e）回收所述固态部分。

附图说明

图1为用于从含有DAS的发酵液制备MAS的方法的一个示例的框图；

图2为示出在水中和30%的DAS水溶液中的MAS的溶解度随温度变化的 图；

图3为示出本发明的方法的所选择的方面的流程图；

图4为示出在135℃下MAS(HSu-)、DAS(Su-2)和SA(H2Su)随pH变化的 图；

图5为在25℃下与图4相似的图；

图6为在所选择的温度下的MAS、DAS和水的三元图；

图7为通过本发明的方法制备的MAS晶体的显微相片；

图8为通过本发明的方法制备的SA晶体的显微相片。

具体实施方式

应该理解，与所附的权利要求书不同的是，下文说明书的至少一部分旨在 涉及针对附图中的说明而选择的方法的代表性示例并且不旨在限定或限制本发 明。

通过参考图1可以理解本发明的方法，图1以框图形式示出本发明的方法 的一个代表性示例10。

生长容器12通常为原位蒸汽灭菌发酵器，生长容器12可以用来培养微生 物培养基（未示出），该微生物培养基随后用于制备含有DAS、MAS和/或SA 的发酵液。这样的生长容器在现有技术中是已知的并且不作进一步讨论。

该微生物培养基可包括能够从可发酵碳源（例如碳水化合物糖类）制备SA 的微生物。微生物的代表性示例包括但不限于：大肠杆菌（Escherichia coli或 E.coli）、黑曲霉（Aspergillus niger）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum） （也称为黄色短杆菌（Brevibacterium flavum））、粪肠球菌（Enterococcus  faecalis）、小韦荣球菌（Veillonella parvula）、产琥珀酸放线杆菌（Actinobacillus  succinogenes）、产琥珀酸曼氏杆菌（Mannheimia succiniciproducens）、产琥珀酸 厌氧螺菌（Anaerobiospirillum succiniciproducens）、拟青霉（Paecilomyces Varioti）、 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）、栖瘤 胃拟杆菌（Bacteroides ruminicola）、嗜淀粉拟杆菌（Bacteroides amylophilus）、 真养产碱杆菌（Alcaligenes eutrophus）、产氨短杆菌（Brevibacterium  ammoniagenes）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、布伦氏假丝 酵母（Candida brumptii）、链状假丝酵母（Candida catenulate）、假丝酵母（Candida  mycoderma）、诞沫假丝酵母（Candida zeylanoides）、帕鲁迪格拿假丝酵母（Candida  paludigena）、萨纳瑞西斯假丝酵母（Candida sonorensis）、产朊假丝酵母（Candida  utilis）、诞沫假丝酵母（Candida zeylanoides）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces  hansenii）、尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）、绵毛状腐质菌（Humicola  lanuginosa）、柠檬克勒克酵母（Kloeckera apiculata）、乳酸克鲁维酵母 （Kluyveromyces lactis）、威克海姆-克鲁维酵母（Kluyveromyces wickerhamii）、 简青霉（Penicillium simplicissimum）、异常毕赤酵母（Pichia anomala）、贝氏毕 赤酵母（Pichia besseyi）、媒介毕赤酵母（Pichia media）、季也蒙毕赤酵母（Pichia  guilliermondii）、尹氏毕赤酵母（Pichia inositovora）、斯氏毕赤酵母（Pichia  stipidis）、巴氏酵母（Saccharomyces bayanus）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces  pombe）、念珠球拟酵母菌白色球拟酵母（Torulopsis candida）、解脂耶氏酵母亚 罗解脂酵母（Yarrowia lipolytica）、它们的混合物等。

优选的微生物为以入藏号PTA-5132保存在ATCC的大肠杆菌菌株。更优选 的是三种抗生素抗性基因（cat、amphl、tetA）被去除的该大肠杆菌菌株。抗生 素抗性基因cat（用于对氯霉素抗性的编码）和amphl（用于对卡那霉素抗性的 编码）的去除可通过以下文献中描述的所谓的“λ-红”方法进行，该方法的主题以 引用方式并入本文：Datsenko KA和Wanner BL.，《美国国家科学协会公报》，2000 年6月6日；97（12）6640-5。可以使用由Bochner等人在以下文献中最初描述 的方法来去除四环素耐药基因tetA，该方法的主题以引用方式并入本文：J Bacteriol.，1980年8月；143（2）：926-933。葡萄糖为用于该微生物的优选的 可发酵碳源。

可以将可发酵碳源（例如，碳水化合物和糖类）、可选地氮源和复合营养素 （例如，玉米浆）、附加的培养基组分（诸如维生素、盐和可以增进细胞生长和 /或产物形成的其他物质）和水加入到生长容器12中以用于微生物培养基的生长 和维持。通常，微生物培养基在好氧条件下生长，该好氧条件通过鼓吹富氧气 体（例如，空气等）提供。通常，提供酸（例如，硫酸等）和氢氧化铵以在微 生物培养基的生长期间进行pH值控制。

在一个示例（未示出）中，通过将富氧气体变为缺氧气体（例如，CO₂等）， 而将生长容器12中的好氧条件（通过鼓吹富氧气体提供）转换为厌氧条件。厌 氧环境引起可发酵的碳源在生长容器12中原位生物转化为琥珀酸。可提供氢氧 化铵以在可发酵的碳源生物转化为SA期间进行pH值控制。由于存在氢氧化铵， 所制备的SA至少部分地被中和为DAS，使得制备成包括DAS的发酵液。CO₂提供了用于制备SA的另外的碳源

在另一示例中，生长容器12的内容物可以借助流14被转移到独立的生物 转化容器16，以使碳水化合物源生物转化为SA。将缺氧气体（例如，CO₂等） 鼓吹到生物转化容器16中以提供引发制备SA的厌氧条件。提供氢氧化铵以在 碳水化合物源生物转化为SA期间进行pH值控制。由于存在氢氧化铵，所制备 的SA至少部分地被中和为DAS，使得制备成包括DAS的发酵液。CO₂提供了 用于制备SA的另外的碳源。

在另一示例中，生物转化可以在相对低的pH值（例如，3到6）下进行。 可以提供碱（氢氧化铵或氨水）以在碳水化合物源生物转化为SA期间进行pH 值控制。根据所需的pH值，由于存在氢氧化铵或不存在氢氧化铵，制备SA， 或者所制备的SA至少部分地被中和为MAS、DAS或包括SA、MAS和/或DAS 的混合物。因此，可选地，在附加的步骤中，通过提供氨水或氢氧化铵，生物 转化期间所制备的SA可以随后被中和，产生包括DAS的发酵液。因此，“含有 DAS的发酵液”通常是指发酵液包括通过生物转化或其他方法添加的和/或产生 的DAS和可能的任一数量的其他组分（诸如MAS和/或SA）。类似地，“含有 MAS的发酵液”通常是指发酵液包括通过生物转化或其他方法添加的和/或产生 的MAS和可能的任一数量的其他组分（诸如DAS和/或SA）。

从可发酵的碳源的生物转化（在容器12或容器16中，取决于生物转化发 生的位置）产生的发酵液通常含有不溶的固体，诸如细胞生物质和其他悬浮物 质，在蒸馏之前，将所述不溶的固体借助流18转移到澄清装置20。去除不溶的 固体使发酵液澄清。这减轻或防止堵塞随后的蒸馏设备。可以通过多种固液分 离技术中的单独的任一种技术或技术组合来去除不溶的固体，所述固液分离技 术包括但不限于离心分离和过滤（包括但不限于超过滤、微过滤或深度过滤）。 可以使用已知的技术选择过滤技术。可以通过任一数量的已知方法去除可溶的 有机化合物，这些已知方法例如但不限于离子交换和物理吸附。

离心分离的示例为连续的碟式离心机。在离心分离之后，增加一精过滤 （polishing filtration）步骤可以是有用的，该精过滤诸如为可包括使用诸如硅藻 土等的过滤辅助工具的死端过滤或错流过滤，或者更优选地为超过滤或微过滤。 超过滤膜或微过滤膜例如可以为陶瓷或高分子材料。高分子膜的一个例子是科 氏滤膜系统公司（Koch Membrane Systems）（850大街，威明顿市，马萨诸塞州， 美国）制造的SelRO MPS-U20P（pH值稳定的超过滤膜）。其是在市场上可购买 到的聚醚砜膜，截留分子量为25,000道尔顿，通常在0.35MPa到1.38MPa的压 力（最大压力为1.55MPa）并且在高达50°C的温度下工作。作为组合使用离心 分离和精过滤的替选方法，可单独采用利用超过滤膜或微过滤膜的错流过滤。

将产生的基本上没有微生物培养基和其他固体的含有DAS的澄清的发酵液 或含有MAS的澄清的发酵液通过流22转移到蒸馏装置24。

澄清的发酵液应该含有一定量的DAS和/或MAS，该量占发酵液中的所有 二羧酸铵盐的至少大部分、优选地至少约70wt.%、更优选地80wt.%以及最优选 的至少约90wt.%。通过高压液相色谱法（HPLC）或其他已知的方法，可以容易 地确定DAS和/或MAS占发酵液中的全部二羧酸盐的重量百分比含量（wt.%）。

水和氨作为顶部镏出物自蒸馏装置24去除，并且至少一部分水和氨可选地 借助流26再循环至生物转化容器16（或在厌氧模式下工作的生长容器12）。只 要蒸馏是以确保蒸馏的顶部镏出物含有水和氨并且蒸馏的底部残留物优选地至 少包括一些DAS和至少约20wt.%的水的方式进行，则蒸馏温度和压力不是关 键。水的更优选的量为至少约30wt.%以及进一步更优选的量为至少约40wt.%。 自蒸馏步骤去除氨的速率随着温度升高而增大，并且通过在蒸馏期间注入蒸汽 （未示出）也可增大该速率。通过在真空下、在压力下进行蒸馏或者通过用诸 如空气、氮气等的非反应性气体鼓吹所述蒸馏装置，也可增大蒸馏期间去除氨 的速率。

在蒸馏步骤期间对水的去除可通过使用有机共沸剂而加强，条件是底部残 留物含有至少约20wt.%的水，所述有机共沸剂诸如甲苯、二甲苯、己烷、环己 烷、甲基环己烷、甲基异丁基酮、庚烷等。如果在能够形成共沸混合物的有机 试剂的存在下进行蒸馏（该共沸混合物由水和该有机试剂组成），则蒸馏产生包 括水相和有机相的双相底部残留物，在这种情况下，水相可以与有机相分离， 并且水相被用作蒸馏的底部残留物。只要底部残留物中的水含量被维持在至少 约30wt.%的水平，则基本上避免诸如琥珀酰胺和琥珀酰亚胺的副产物。

用于蒸馏步骤的优选温度的范围是约50℃到约300℃，该温度取决于压力。 更优选的温度范围是约90℃到约150℃，该温度取决于压力。约110℃到约140 ℃的蒸馏温度是优选的。“蒸馏温度”是指底部残留物的温度（对于分批蒸馏，该 温度可以为当取出最后期望的量的顶部镏出物时的温度）。

加入可与水混溶的有机溶剂或者氨分离溶剂可有助于在如上文所讨论的各 种蒸馏温度和压力下去除氨。这样的溶剂可包括能够形成惰性的氢键的疏质子 溶剂、双极性溶剂、含氧溶剂。示例包括但不限于：二甘醇二甲醚、三甘醇二 甲醚、四乙二醇二甲醚、丙二醇、亚砜（诸如二甲亚砜（DMSO）、酰胺（诸如 二甲基甲酰胺（DMF）和二甲基乙酰胺）、砜类（诸如二甲基砜）、环丁砜、聚 乙二醇（PEG）、丁氧基三乙二醇、N-甲基吡咯烷酮（NMP）、γ-丁内酯（GBL）、 醚类（诸如二氧己环）和甲基乙基酮（MEK）等。这样的溶剂有助于自澄清的 发酵液中的DAS或MAS去除氨。无论哪种蒸馏技术，优选的是，蒸馏以确保 至少一些DAS和至少约20wt.%的水且甚至更优选地至少约30wt.%的水留在底 部残留物中的方式进行。

可以在大气压、亚大气压或超大气压下进行蒸馏。该蒸馏可以为单级闪蒸、 多级蒸馏（即，多级塔式蒸馏）等。单级闪蒸可以在任一类型的闪蒸器（例如， 刮膜蒸发器、薄膜蒸发器、热虹吸管闪蒸器和强制循环闪蒸器等）中进行。多 级蒸馏塔可以通过使用塔板和填料等来实现。所述填料可以为松散填料（例如， 拉西环、鲍尔环和贝尔鞍形填料等）或规整填料（例如，Koch-Sulzer填料、英 特洛克斯（Intalox）填料和麦勒派克（Mellapak）等）。所述塔板可以为任一设 计（例如，筛孔塔板、浮阀塔板、泡罩塔板等）。可以在任一数量的理论级下进 行所述蒸馏。

如果所述蒸馏装置为塔，则构造不是特别的关键，并且可以使用熟知的规 则来设计该塔。可以在气提模式、精馏模式或分馏模式下操作该塔。可以以分 批模式或连续模式进行蒸馏。在连续模式中，可将发酵液连续送入所述蒸馏装 置，且顶部镏出物和底部残留物可随着它们的形成而从所述装置连续地去除。 来自蒸馏的馏出物为氨/水溶液，并且蒸馏的底部残留物为MAS和DAS的液态 水溶液，所述蒸馏的底部残留物也可以含有其他发酵副产物盐类（即，乙酸铵、 甲酸铵、乳酸铵等）和有色体。

所述蒸馏的底部残留物可通过流28转移到冷却装置30并且通过常规的方 法冷却。冷却技术不是关键性的，但下文将描述优选的技术。可以使用热交换 器（利用热回收）。可以使用闪蒸冷却器将所述底部残留物冷却至约15℃。冷却 到0℃通常利用冷藏冷却剂，诸如，乙二醇溶液，或者，较不优选地盐水。在冷 却之前可以包括浓缩步骤以帮助增大产物产量。此外，可以采用已知方法将浓 缩和冷却组合，诸如真空蒸发和采用使用一体式冷却套管和/或外部热交换器的 除热法。

我们发现，液态底部残留物中的一些DAS的存在有助于通过降低含DAS 的液态水性底部残留物中的MAS的溶解度来以冷却方式引起将底部残留物分离 成为与固态部分接触的液态部分，所述固态部分至少“基本由”MAS组成（意 思是所述固态部分为至少基本上纯的结晶MAS）。图2示出在0℃到60℃的不同 温度下，30wt%的DAS水溶液中的MAS的减小的溶解度。上部的曲线示出， 即使在0℃下，MAS保持基本上可溶于水（即，在水溶液中占约20wt%）。下部 的曲线示出，在0℃时，MAS在30wt%的DAS水溶液中基本上不可溶。因此， 研究发现，如果一些DAS也存在于水溶液中，则MAS可更完全地从该水溶液 中结晶而出。在这样的溶液中的DAS的优选浓度为ppm（百万分之一）至约3wt% 的范围。这使得MAS固态部分在比不存在DAS时所需的温度高的温度下结晶 （即，蒸馏的底部残留物的固态部分的形成）。

当从水介质中包含的DAS除去氨的约50%时，根据操作温度和操作压力， 各种琥珀酸盐建立了在4.8到5.4的pH范围内的约为0.1:0.8:0.1的DAS:MAS:SA 的平衡摩尔分布。当将该组合物浓缩和冷却时，MAS超出其在水中的溶解极限 并结晶。当MAS经历到固相的相变时，液相平衡重新设立，从而产生更多的 MAS（DAS提供铵离子至SA）。这使得更多的MAS从溶液中结晶且持续进行 到相当数量的SA被消耗掉且pH值趋向于上升为止。pH值上升时，液相分布 有利于DAS。然而，由于DAS高度溶于水，MAS继续结晶，因为MAS的溶解 度低于DAS。实际上，各种琥珀酸盐的液相平衡和固-液平衡起到用于MAS结 晶的“泵”的作用，从而能够使MAS结晶有高产率。

除了上文描述的冷却、蒸发或蒸发式冷却外，还可通过添加反溶剂来实现 和/或促进MAS结晶。在本文中，反溶剂通常可以是这样的溶剂：可与水混溶、 但由于水溶性盐（例如MAS）在该溶剂中的溶解度较低而导致水溶性盐结晶。 对MAS具有反溶剂效应的溶剂可以为醇类（例如乙醇和丙醇）、酮类例如（甲 基乙基酮）、醚类（例如四氢呋喃）等。反溶剂的使用是已知的并且其可与冷却 和蒸发组合使用或者单独使用。

在单元30中冷却之后，将所述蒸馏的底部残留物通过流32送到分离器34 以自液态部分分离固态部分。可以借助压滤（例如，使用Nutsche型的或者 Rosenmond型的压滤机）、离心分离等实现分离。得到的固态产物可以作为产物 36回收，并且，如果需要，通过标准方法干燥。

在分离之后，可能期望处理固态部分以确保没有液态部分残留在固态部分 的表面上。使残留在该固态部分的表面上的液态部分的量最小化的一种方式是， 用水洗涤所分离的固态部分并且将得到的经洗涤的固态部分干燥（未示出）。用 以洗涤所述固态部分的方便的方式是使用所谓的“篮式离心机”（未示出）。从The  Western States Machine Company（哈密尔顿,俄亥俄州,美国））可购买到合适的 篮式离心机。

分离器34的液态部分（即，母液）可含有剩余的溶解的MAS、任何未转化 的DAS、任何发酵副产物（诸如乙酸铵、乳酸铵或甲酸铵）和其他少量杂质。 该液态部分可借助流38被送到下游装置40。在一个例子中，该下游装置可以为 用于形成除冰剂的装置，例如，通过用适量的氢氧化钾处理混合物，以将铵盐 转化成钾盐。在该反应中产生的氨可以被回收，以在生物转化容器16（或者在 厌氧模式下工作的生长容器12）中再利用。得到的钾盐混合物作为除冰剂和防 冰剂是有价值的。

来自固体分离步骤34的母液可以借助流42再循环（或部分再循环）至蒸 馏装置24以进一步增强MAS的回收以及进一步将DAS转化为MAS。

以冷却方式引起的结晶的固态部分为基本上纯的MAS并且因此可用于 MAS的已知用途。

HPLC可以用来检测含氮杂质（诸如琥珀酰胺和琥珀酰亚胺）的存在。可以 通过元素碳和氮分析测定MAS的纯度。氨电极可以用来测定MAS纯度的粗近 似值。

根据环境和各种运营投入，存在发酵液可以为含有MAS的澄清的发酵液或 者含有SA的澄清的发酵液的情况。在这些情况下，可以有利地是，可选地将 MAS、DAS、SA、氨和/或氢氧化铵加入到这些发酵液中以便于制备基本纯的 MAS。例如，可以定发酵液的工作pH值使得该发酵液为含有MAS的发酵液或 者含有SA的发酵液。可以可选地将MAS、DAS、SA、氨和/或氢氧化铵加入到 这些发酵液以获得优选地小于约6的发酵液pH值以便于制备上述基本上纯的 MAS。而且，可以根据需要添加来自其他源的MAS、DAS和/或SA。在一个具 体的形式中，特别有利地是使来自从蒸馏步骤24产生的液态底部残留物和/或来 自分离器34的液态部分的MAS、DAS和水再循环进入所述发酵液。关于含有 MAS的发酵液，这样的发酵液通常是指，该发酵液包括通过生物转化或其他方 法添加的和/或产生的MAS和可能的任一数量的其他成分（诸如DAS和/或SA）。

通过去除氨，可将固态部分转化成SA。这可按照以下步骤进行。可将从上 文所描述的任何一个转化方法得到的固态部分（主要由MAS组成）溶解在水中， 以制备MAS的水溶液。然后，在足以形成包含水和氨的顶部馏出物和包含大部 分的SA、少部分的MAS和水的底部残留物的温度和压力下，蒸馏该溶液。可 将该底部残留物冷却以使其分离成与固态部分接触的液态部分，该固态部分主 要由SA组成且基本上不含有MAS。可将该固态部分从第二液态部分分离出并 且回收为基本上纯的SA（通过HPLC确定）。

参见图3，描述了本发明的特别优选的方法之一。在图3中，DAS流100 在蒸馏塔102中经受反应性蒸发/蒸馏，该流可为含有DAS（除了其他物质之外） 的澄清的发酵液的流。可在一温度范围（例如约110℃至约145℃，优选地约135 ℃）下进行蒸馏。蒸馏塔102中的压力可为约1.5巴至约4巴的宽范围，优选地 为约3.5巴。水和氨在蒸馏塔102中分离出且形成顶部馏出物104。液态的底部 残留物106包含MAS、至少一些DAS和至少约20wt%的水。通常，底部残留 物106含有约5wt%至约20wt%的MAS、约80wt%至约95wt%的水和约1wt%至 约3wt%的DAS。底部残留物的pH值可处于约4.6至约5.6的范围内。

使底部残留物106流入浓缩器108，该浓缩器通过顶部馏出物流110除去水。 浓缩器108可在一温度范围（例如约90℃至约110℃，优选地约100℃）和一压 力范围（例如约0.9巴至约1.2巴，优选地约1.103bar）下运作。

浓缩器108制备底部残留物流112，该底部残留物流通常含有约40wt%至约 70wt%的MAS，优选地约55wt%的MAS。因此，浓缩器通常将MAS的量浓缩 约2倍至约11倍，优选地约4倍到约6倍。

底部残留物流112流入第一结晶器114，该第一结晶器通常在约50℃至约 70℃、优选地约60℃的温度下进行操作。通过结晶器产生顶部馏出物的水流116。 底部残留物118流入离心机120，该离心机制备通常具有约95%的MAS产率的 固态流122。将剩余的液态流124送入第二结晶器126，该第二结晶器通过顶部 馏出物流128进一步除去水且通常在约30℃至约50℃、优选地约40℃的温度下 进行操作。底部残留物流130流入离心机132。离心机制备固态流134，利用水 流136，再溶解该固态流134，水流136引入通常在约70℃至约90℃的温度范 围中、优选地约90℃的水。该固态流流入第一混合器138并且产生返回至第一 结晶器114的第一回收流140。

来自离心机132的剩余液体通过流141流入第三结晶器142，该第三结晶器 产生水的顶部馏出物流144。第三结晶器132通常在约10℃至约30℃、通常约 20℃的温度下进行操作。剩余的底部残留物流146流入第三离心机148，且由第 三离心机148产生的固态物质通过流152流入第二混合器150。通过第二水流 154来溶解该固态流，第二水流154引入通常在约50℃至约70℃的温度范围中、 优选地约70℃的水。第二混合器150产生回收流156，其被回收至第二结晶器 126。剩余的物质通过清除流158而自第三离心机148流出系统，该剩余的物质 通常相当于包含在流112中的全部MAS的约5wt%。应该理解，可通过蒸发（如 所描述）、或通过间接接触外部冷却介质，或两者组合，得到结晶器114、126 和142中所需的结晶温度。

图4为示出在135℃下MAS、DAS和SA的摩尔分数随pH变化的曲线图， 135℃是图3的蒸馏塔102中的典型温度。除了温度在25℃下，图5与图4相同。 这些图示出了在特定的温度下根据pH值的三种组分的相对比例。根据本发明的 方法，反应性蒸发/蒸馏单元102和浓缩单元108的典型工作pH值可为约5.3， 这使MAS有最大产量。当从水介质中包含的DAS除去氨的约50%时，根据操 作温度和操作压力，琥珀酸盐建立了在4.8到5.4的pH范围内的约为0.1:0.8:0.1 的DAS:MAS:SA的平衡摩尔分布。不限于任何特定的理论，本发明认为，当浓 缩且冷却该组合物时，MAS超出其在水中的溶解极限并结晶。此外，当MAS 经历到固相的相变时，液相平衡被认为有意重新建立，从而制备更多的MAS （DAS提供铵离子给SA）。本发明认为，这使得更多的MAS从溶液中结晶且 持续进行到相当数量的SA被消耗掉且pH值趋向于上升为止。pH值上升时， 液相分布有利于DAS。然而，由于DAS高度溶于水，因此，MAS继续结晶， 因为MAS的溶解度低于DAS。实际上，琥珀酸盐的液相平衡和固-液平衡起到 MAS结晶的“泵”的作用，从而能够使MAS结晶有高产率。

图6为在三个不同的温度即20℃、35℃和60℃下的MAS、DAS和水的三 元图。该图示出在不同温度下使纯MAS或纯DAS结晶的固-液平衡。本发明利 用实验性的溶解度数据构建图6，图6示出了，如果使含有MAS、DAS和水的 液态组合物冷却以导致固态部分分离并且如果该液态组合物位于确定为“A”的 共晶点的左侧，则液固平衡原理表明固相部分将为纯的MAS。相反，如果使含 有MAS、DAS和水的液态组合物冷却以导致固态部分分离并且如果该液态组合 物位于确定为“A”的共晶点的右侧，则液固平衡原理表明，固相部分将为纯的 DAS。在图3中典型地描绘的本发明的方法被设计成在确定为“A”的共晶点的 左侧运行，因此预计产生纯的MAS。

关于图3和图6，下文中描述了代表性的方法。通常，流100代表点“P”， 其为含约5wt%的DAS的发酵液。在反应性蒸发/蒸馏步骤102中，蒸发/蒸馏出 水和氨以形成含有10wt%的MAS的溶液，通常，其用点“Q”表示。随后，在 浓缩单元108中，使含有MAS的溶液浓缩以形成含60wt%的MAS的溶液，通 常，其用点“R”表示。最后，使含有60wt%的MAS的溶液冷却（通过蒸发、 间接接触冷却或两者的组合）以产生与固态部分接触的含有大约37wt%的MAS 的液态部分，其表示为点“S”。根据液固平衡原理，由于通常在共晶点的左侧 进行本发明的方法，因此图6示出，固态部分将为基本上不含有DAS的基本上 纯的MAS。

图7为示出根据本发明的方法产生的代表性MAS晶体的显微相片。类似地， 图8为示出根据本发明的方法产生的代表性SA晶体的显微相片。这些显微相片 表明，MAS具有与SA的晶体形状不同的晶体形状。下文中，本发明示出，使 用本发明方法已产生了基本上不含有DAS和SA的基本上纯的MAS。

实施例

通过以下非限制的代表性实施例来说明所述方法。在多个实施例中，合成 的DAS水溶液替代实际的含有DAS的澄清的发酵液使用。其他实施例采用实 际的含有DAS的澄清的发酵液。

因本发明的方法中的实际发酵液中的典型发酵副产物的溶解度，认为合成 的DAS溶液的使用是用于该实际发酵液的特性的良好模型。发酵期间所产生的 主要副产物为乙酸铵、乳酸铵和甲酸铵。如果这些杂质在蒸馏步骤期间存在， 则在所有的DAS已经被转化为MAS之前，将不会期望它们大量地失去氨并形 成游离酸。这是因为醋酸、乳酸和甲酸比SA（(pKa=5.48）的二价酸根具有更 强的酸性。换句话说，醋酸盐、乳酸盐、甲酸盐以及甚至琥珀酸氢盐具有比二 价阴离子的琥珀酸盐弱的碱性。此外，乙酸铵、乳酸铵和甲酸铵在水中的溶解 度明显比MAS大，并且这三种物质均通常以比DAS浓度的10%小的浓度存在 于发酵液中。此外，即使当在蒸馏步骤期间形成酸（乙酸、甲酸和乳酸）时， 该酸与水混溶并且将不从水中结晶。这意味着MAS达到饱和并且从溶液中结晶 （即，形成固态部分），留下酸杂质溶解在母液（即，液态部分）中。

实施例1

该实施例阐明了通过蒸馏将DAS的一部分转化为MAS以及通过冷却方式 引发的结晶化从蒸馏的底部残留物液体回收MAS固体。

500毫升的三颈圆底烧瓶安装有温度计和顶部具有回流冷凝器的Dean Stark 分离器。回流冷凝器的出口通向含有100克1.4M的醋酸溶液的洗气瓶。烧瓶装 有400克10%的DAS水溶液（pH 8.5）。利用磁力搅拌器搅拌烧瓶的内容物，并 且通过加热套加热该烧瓶以蒸馏出320.6克的馏出物（氨水溶液），该馏出物通 过Dean Stark分离器移出。对该馏出物的分析表明，在蒸馏期间，已将所包含 的氨的约20%从所装入的DAS除去（即，在底部残留物液体中的盐为约40%的 MAS和约60%的DAS）。在洗气瓶中只存有痕量的氨。当最后一滴蒸馏出时， 该烧瓶的最终温度为110℃。将该烧瓶中的残留物（底部残留物液体）（73.4克， 约有53%水）放置在一烧瓶中，且使其冷却至室温过夜。当冷却至室温时，形 成了白色针状MAS。通过真空过滤分离该白色固体，产生14克湿晶体（固态部 分）和56克母液（液态部分）。在真空炉中干燥湿晶体的一部分（7克）整夜， 产生6克干燥固体，通过Karl-Fisher分析确定，该干燥固体含有0.4%的水。利 用HPLC分析固态部分表明，该固态部分不含有含氮的非MAS杂质（例如琥珀 酰亚胺和琥珀酰胺）。

实施例2

该实施例阐明母液回收。

使1L的圆底烧瓶装有800克合成的4.5%的DAS溶液，然后将蒸馏头附接 至该烧瓶。在大气压下蒸馏烧瓶的内容物，67克残留物（底部残留物液体）留 在烧瓶中。该底部残留物液体包含约45%的水。对馏出物的氨分析表明，第一 蒸馏循环去除氨的约29%，形成摩尔比为42/58的DAS和MAS的混合物。然 后，将残留物（底部残留物液体）从烧瓶移走，放置在配备有水浴的烧杯中。 伴随着搅拌使烧杯内容物冷却至20℃。一旦残留物达到20℃，利用少量的MAS 晶体作为晶种且搅拌30分钟。然后使水浴的温度降低至15℃，保持30分钟。 然后水浴的温度降低至10℃，保持30分钟。然后水浴的温度降低至5℃，保持 30分钟，最终水浴的温度降低至0℃，保持30分钟。接着，使用预冷却的烧结 玻璃过滤漏斗和真空瓶，快速过滤浆液（由固态部分和液态部分组成）。在真空 炉中干燥固体，产生13.9克干燥的MAS固体。然后将母液（液态部分，47.2 克）与800克合成的4.5%的DAS溶液混合，蒸馏，留下86.6克残留物（底部 残留物液体）。在第二次蒸馏（即，母液回收流程）中，从当前的全部量的DAS 除去氨的大约28%。然后，将残留物（底部残留物液体）以类似的方式进行冷 却（结晶）。然而，溶液在46℃时变得混浊，因此，其在46℃下加入晶种且边 搅拌边缓慢冷却至室温过夜。第二天，使温度以5℃的下降量缓慢斜降至0℃。 用与之前一样的方式将浆液（固态部分和液态部分）过滤，使固体干燥，产生 23.5克MAS固体。这相当于在被蒸馏的800克新鲜DAS溶液中回收约75%的 SA对应物。从第一循环中回收的固体为95%的MAS（约5%的水）。在第二循 环中，固体为97%的MAS（约3%的水）。来自第二循环的母液含有28.8%的SA 对应物（即作为SA盐）。

实施例3

该实施例阐明冷却后的蒸馏的底部残留物的固态部分中不含酰胺和酰亚 胺。

1L的圆底烧瓶装有800克合成的4.5%的DAS溶液。该烧瓶配备有五塔板1” 奥尔德肖段（a five tray 1”Oldershaw section），该奥尔德肖段的顶部具有蒸馏头。 将馏出物收集在冰冷的接收器中。利用加热套加热烧瓶的内容物，且利用磁力 搅拌器搅拌。蒸馏烧瓶的内容物，得到721.1克的顶部馏出物和位于烧瓶中的 72.2克液体残留物（即蒸馏的底部残留物）。用滴定法测量氨水馏出物，得出 0.34%的氨含量（即，DAS的约55%转化成MAS）。接着，将热的蒸馏底部残留 物（约47%的DAS和MAS的盐溶液）放置在125毫升的爱伦美氏烧瓶中，边 搅拌边缓慢冷却至室温过夜。第二天早晨，伴随着搅拌，将混浊的溶液冷却至 15℃且保持60分钟，接着冷却至10℃且保持60分钟，最后冷却至5℃且保持 60分钟。过滤产生的白色浆液，得到12.9克湿晶体和55.3克母液。将该晶体溶 解在25.8克蒸馏水中。对晶体溶液的HPLC分析表明，没有检测到酰胺或酰亚 胺。然而，对母液的HPLC分析显示了痕量的琥珀酰胺酸，但未检测到琥珀酰 胺或琥珀酰亚胺。

实施例4

该实施例制备了冷却的蒸馏底部残留物的固态部分，该固态部分主要由 MAS组成且基本上不含DAS。

1L的三颈圆底烧瓶安装有加料漏斗和1”五塔板奥尔德肖柱（1”five tray  Oldershaw column），该奥尔德肖柱的顶部具有蒸馏头。冰冷式接收器用于收集 馏出物。使烧瓶装有800克合成的4.5%的DAS溶液。利用加热套加热烧瓶的内 容物，且利用磁力搅拌器进行搅拌。开始蒸馏。当蒸馏发生时，将额外的1600 克4.5%的DAS溶液以与馏出物移出相同的速率缓慢添加至烧瓶内。总计2135 克馏出物作为顶部馏出物。馏出物的滴定法测量表明顶部馏出物为0.33%的氨溶 液。将热的水性的蒸馏底部残留物（253.8g）从烧瓶中移出且放置在爱伦美氏烧 瓶中。边搅拌边将蒸馏底部残留物缓慢冷却至室温过夜。向烧瓶的内容物中加 入晶种，且搅拌30分钟。然后将浆液冷却至15℃且保持60分钟，然后将浆液 冷却至10℃且保持60分钟，最终将浆液冷却至5℃且保持60分钟，所有冷却 过程伴随有搅拌。将浆液冷过滤，且利用冷（约5℃）的20%的氯化钠溶液的约 20g的部分将固体（即固态部分）洗涤三次以移除母液（即液态部分）。向滤饼 抽吸几分钟空气以尽可能多地除去液体。然后在真空炉中在75℃下将固体干燥 1小时，产生7.2克的白色晶体。对固体的碳和氮的分析表明，碳与氮的原子比 为4.06（即，氨与SA的比率为1.01，或有约99%的MAS）。认为未得到比率 1.00是由于对固体的不彻底洗涤。

实施例5

该实施例阐明了溶剂对氨从DAS水溶液排出的影响。第5个实验为对照实 验，其中不存在溶剂。

1L的三颈圆底烧瓶的外颈配备有温度计和塞子。中间的颈配备有五塔板1” 奥尔德肖段。该奥尔德肖段的顶部具有蒸馏头。冰冷的500mL圆底烧瓶用作蒸 馏头的接收器。1L圆底烧瓶被装有蒸馏水、测试的溶剂、SA和浓缩的氢氧化铵 溶液。用磁力搅拌器搅拌该内容物以溶解所有的固体。在所述固体溶解之后， 用加热套加热该内容物以蒸馏出350g的馏出物。将该馏出物收集在冰冷的 500mL圆底烧瓶中。随着最后一滴馏出物被收集，记录烧瓶温度。使该烧瓶的 内容物冷却到室温并且记录残留物的重量和馏出物的重量。接着，通过滴定法 测定馏出物的氨含量。结果被记录在表1中。

表1

实施例6

该实施例从冷却的蒸馏底部残留物制备固态部分，该固态部分主要由SA组 成且基本上不含有MAS。

使300毫升的Parr高压釜装有80克合成的MAS和120克水。密封该高压 釜且在约190psig的自生压力下，搅拌内容物并将内容物加热至约200℃。一旦 内容物达到该温度，以约2克/分钟的速率将水送入高压釜且利用背压调节器以 约2克/分钟的速率将蒸汽从高压釜移出。使离开高压釜的蒸汽冷凝且收集在接 收器中。高压釜在这些条件下运作，直到送入总计1020克的水和总计收集到1019 克的馏出物为止。用滴定法测量馏出物以得到氨含量（0.29%的氨，按重量计）。 这转化成：MAS的约29%转化为SA。将高压釜的内容物（194.6克）部分冷 却，且将其从反应器中移走。将浆液在爱伦美氏烧瓶中、在室温下进行搅拌过 夜。然后过滤该浆液，且用25克水冲洗固体。在真空炉中在75℃下干燥潮湿的 固体1小时，得到9.5克SA产物。通过铵离子电极的分析表明，每克固体含有 0.013mmol的铵离子。HPLC分析表明固体为具有0.8%的琥珀酰胺酸杂质的SA。

实施例7

该实施例使用了从含有大肠杆菌菌株ATCC PTA-5132的发酵液获取的含有 DAS的澄清的发酵液。该实施例制备了冷却的蒸馏底部残留物的固态部分，该 固态部分主要由MAS组成且基本上不含DAS。

1L的三颈圆底烧瓶安装有加料漏斗和1”五塔板奥尔德肖柱。该奥尔德肖柱 的顶部具有蒸馏头。冰冷式接收器用于收集馏出物。使烧瓶装有800克的含有 DAS的澄清的发酵液，该发酵液含有4.4%的DAS、1%的醋酸铵、0.05%的甲酸 铵和0.03%的乳酸铵。利用加热套加热烧瓶的内容物，且利用磁力搅拌器进行搅 拌。开始蒸馏。在蒸馏进行期间，将另外的2200克发酵液以与馏出物移出相同 的速率缓慢添加至烧瓶中。总计2703克馏出物作为顶部馏出物取出。馏出物的 滴定法测定表明顶部馏出物为0.28%的氨溶液。将热的蒸馏底部残留物的水溶液 （269.7克）从烧瓶移走且放置在爱伦美氏烧瓶中。使蒸馏底部残留物缓慢冷却 至室温，同时搅拌一整夜。第二天，向烧瓶的内容物中加入晶种，且进行搅拌 30分钟。然后将浆液冷却至15℃且保持30分钟，然后将浆液冷却至10℃且保 持30分钟，最后将浆液冷却至5℃且保持30分钟，所有冷却过程中伴随有搅拌。 将浆液冷过滤，向滤饼抽吸几分钟空气以尽可能多地除去液体。得到浅棕色固 体（72.5g）和深棕色母液（188.4克，pH值为6.4）。通过将固体溶解在50℃的 72克水中，使固体再结晶以除去母液。然后边搅拌边使溶液缓慢冷却至室温过 夜。第二天，向烧瓶的内容中加入晶种，且进行搅拌30分钟。然后将浆液冷却 至15℃且保持30分钟，然后将浆液冷却至10℃且保持30分钟，最后将浆液冷 却至5℃且保持30分钟，所有冷却过程中伴随有搅拌。将浆液冷过滤，向滤饼 抽吸几分钟空气以尽可能多地除去液体，得到110克棕色母液（pH 5.0）。然后 在真空炉中在75℃下将固体干燥1小时，得到24克的米白色晶体。对固体的碳 和氮分析表明碳与氮的摩尔比为4.04（即，氨与SA的比率为1.01或者约99% 的MAS）。HPLC分析表明，MAS含有0.07%的琥珀酰胺酸，但检测不到琥珀 酰胺、琥珀酰亚胺或醋酸盐。换句话说，MAS不含有DAS，基本上为纯的MAS。

实施例8

该实施例使用了从含有大肠杆菌菌株ATCC PTA-5132的发酵液发酵获取的 MAS。该实施例从冷却的蒸馏底部残留物制备固态部分，该固态部分主要由SA 组成且基本上不含MAS。

使300毫升的Parr高压釜装有80克的经发酵液获取的MAS和120克水。 密封高压釜，且在自生压力约205psig下，搅拌内容物并将其加热至约202℃。 一旦内容物达到该温度，以约2克/分钟的速率将水送入高压釜且利用背压调节 器以约2克/分钟的速率将蒸汽从高压釜移出。使离开高压釜的蒸汽冷凝且收集 在接收器中。高压釜在这些条件下运作，直到送入总计905克的水和总计收集 到908克的馏出物为止。对馏出物进行滴定法测量，以得到氨含量（0.38%的氨， 按重量计）。这转化成：MAS的约34%转化为SA。将高压釜的内容物（178.2 克）部分冷却，且将其从反应器移走。将浆液在爱伦美式烧瓶中、在室温下进 行搅拌过夜。然后将浆液过滤，且用25克水冲洗固体。在真空炉中在75℃下干 燥潮湿的固体1小时，得到8.5克SA产物。通过铵离子电极的分析表明每克固 体含有0.027mmol的铵离子。HPLC分析表明固体为具有1.4%的琥珀酰胺酸和 0.1%的琥珀酰胺杂质的SA。

实施例9

该实施例使用氨释放溶剂以有助于脱氨。该实施例从冷却的蒸馏底部残留 物制备固态部分，该固态部分主要由SA组成且基本上不含MAS。

使500毫升的圆底烧瓶装有29克MAS固体、51克水和80克三乙二醇二甲 醚。该烧瓶安装有顶部具有蒸馏头的五塔板1”玻璃奥尔德肖柱段。含有2500克 水的加料漏斗也与烧瓶连接。利用磁力搅拌器搅拌烧瓶，且利用加热套加热烧 瓶。将馏出物收集在冰冷的接收器中。当馏出物开始出现时，将加料漏斗中的 水以与馏出物的移出相同的速率添加到烧瓶中。总共取走2491克馏出物。通过 滴定法测量确定，馏出物含有2.3克氨。这意味着MAS的约63%转化成SA。 然后，将烧瓶中的残留物放置在爱伦美式烧瓶中，边搅拌边冷却至-5℃。在搅拌 30分钟后，边冷却边过滤浆液，得到15.3克固体。将固体溶解在15.3克热水中， 然后冰浴中冷却且同时搅拌。将冷浆液过滤，且在真空炉中在100℃下干燥固体 2小时，得到6.5克琥珀酸。HPLC分析表明固体为具有0.18%的琥珀酰胺酸的 SA。

实施例10

该实施例使用氨释放溶剂以有助于脱氨。该实施例制备冷却的蒸馏底部残 留物的固态部分，该固态部分主要由MAS组成且基本上不含DAS。

使500毫升的圆底烧瓶装有80克的36%的DAS水溶液和80克三乙二醇二 甲醚。该烧瓶安装有顶部具有蒸馏头的五塔板1”玻璃奥尔德肖柱段。含有700 克水的加料漏斗也与烧瓶连接。利用磁力搅拌器搅拌烧瓶，且利用加热套加热 烧瓶。将馏出物收集在冰冷的接收器中。当馏出物开始出现时，将加料漏斗中 的水以与馏出物的移出相同的速率添加到烧瓶中。总共移走747克馏出物。通 过滴定法测量确定，馏出物含有3.7克氨。这意味着氨的约57%被移除。换句话 说，所有的DAS转化成MAS，且MAS的约14%进一步转化成SA。然后，将 烧瓶中的残留物放置在爱伦美式烧瓶中，边搅拌边冷却至5℃。在搅拌30分钟 后，过滤浆液且同时冷却，且在真空炉中在100℃下干燥固体2小时，得到10.3 克MAS。分析表明固体为具有0.77%琥珀酰胺酸和0.14%琥珀酰亚胺的MAS。

实施例11

该实施例阐明共沸溶剂的用途，尤其是将MAS与发酵液中的其他副产物分 离。

500mL的三颈圆底烧瓶安装有温度计、250mL加料漏斗和顶部具有回流冷 凝器的Dean Stark分离器。使该烧瓶装有100克甲苯和100克约9%的DAS发 酵液（其也含有约1%的组合的醋酸铵和甲酸铵）。使加料漏斗装有250克9%的 琥珀酸二铵发酵液。利用磁力搅拌器搅拌烧瓶的内容物，且利用加热套加热烧 瓶的内容物使其沸腾。将加料漏斗中的内容物缓慢添加到烧瓶中，使甲苯-水共 沸混合物以通过蒸馏而进入Dean Stark分离器，且甲苯返回至烧瓶中。在已经 添加加料漏斗的全部内容物（以基本上与馏出物相同的速率）后，使内容物进 一步回流，直到从Dean Stark分离器收集到总计277.5克的水相为止。在烧瓶热 的期间移出烧瓶的内容物，且在温的分液漏斗中分离两相。在冰浴中使水相冷 却，同时搅拌。使用烧结玻璃漏斗通过过滤回收产生的固体。母液为深棕色且 过滤出的固体为米白色。在真空炉干燥固体且利用HPLC分析。干燥的固体（5.7 克）为约96%的琥珀酸一铵和约1%的醋酸铵以及余量的水。

实施例12

使用填有316 SS Propak填料的8英寸长的1.5”316 SS Schedule 40的管制作 加压蒸馏塔。该塔的底部配备有浸没式加热器以充当再沸器。通过针阀将氮气 注入再沸器中以加压。该塔的顶部具有总的取出管线（take-off line），该取出管 线通往具有接收器的316 SS管壳式冷凝器。该接收器配备有压力计和背压调节 器。通过针阀借助吹气自顶部的接收器移除物质。借助泵将预热的进料在填料 顶部注入到塔中。将预热的水也通过泵注入再沸器中。该塔在30psig的压力下 工作，这提供137℃的塔温度。向塔的顶部以5mL/min的速率送入合成的10% 的DAS的溶液以及以5mL/min的速率将水送入再沸器。顶部馏出物的速率为 8mL/min并且残留物的速率为2mL/min。针对氨的对馏出物的滴定法表明，在 馏出物中氨的约47%被移除（即至MAS的转化为约94%）。残留物液体为约20% 的MAS，且残留物的HPLC分析表明，约3%的无效的琥珀酰胺酸。

实施例13

通过分批蒸馏将来自实施例12的残留物的一部分（800克）浓缩至约59% 的MAS溶液（即蒸馏出530克水）。然后将残留物边搅拌边冷却至5℃。将产生 的浆液过滤，且在真空炉中在75℃下干燥固体1小时，得到52.5克MAS固体 （即约32%的回收率）。HPLC分析指出该固体含有0.49%的琥珀酰胺酸，不含 有琥珀酰亚胺。

实施例14

将来自实施例12的压力塔残留物的第二部分（3200克）放置在蒸发式结晶 器中且通过在真空下且在60℃下蒸馏出2312克水而浓缩至约72%的MAS。离 心分离产生的热浆液，且在真空炉中在75℃下干燥回收的固体1小时，得到130.7 克MAS固体。将来自离心分离步骤的母液进行冷却至室温，形成第二批晶体。 过滤该浆液，且在75℃下真空干燥回收的固体，得到114.8克MAS固体。基于 提供至结晶器的琥珀酸盐的浓度，对于第一批晶体和第二批晶体分别实现20% 的回收率和18%的回收率（即38%的总回收率）。对两批固体的HPLC分析指出， 第一批晶体检测不到琥珀酰胺酸和琥珀酰亚胺，而第二批晶体具有0.96%的琥珀 酰胺酸和0.28%的琥珀酰亚胺。

对比实施例1

该实施例阐明了当三乙二醇二甲醚不存在时，MAS水溶液的常压蒸馏去除 了非常少的氨。

使500毫升的圆底烧瓶装有30克MAS固体和120克水。该烧瓶安装有顶 部具有蒸馏头的五塔板1”奥尔德肖柱段。含有600克水的加料漏斗也与烧瓶连 接。利用磁力搅拌器搅拌烧瓶，且利用加热套加热烧瓶。将馏出物收集在冰冷 的接收器中。当馏出物开始出现时，将加料漏斗中的水以与馏出物的移出相同 的速率添加到烧瓶中。总共移走606克馏出物。通过滴定法测量确定，馏出物 含有0.15克氨。这意味着MAS的~4%转化成SA。

对比实施例2

该实施例阐明当三乙二醇二甲醚不存在时，对于DAS的氨去除减少。

使500毫升的圆底烧瓶装有80克36%的DAS水溶液和80克水。该烧瓶安 装有顶部具有蒸馏头的五塔板1”奥尔德肖柱段。含有1200克水的加料漏斗也与 烧瓶连接。利用磁力搅拌器搅拌烧瓶，且利用加热套加热烧瓶。将馏出物收集 在冰冷的接收器中。当馏出物开始出现时，将加料漏斗中的水以与馏出物的移 出相同的速率添加到烧瓶中。总共取走1290克馏出物。通过滴定法测量确定， 馏出物含有2.2克氨。这意味着DAS的约44%转化成MAS。

尽管已经结合具体步骤和其形式描述了本发明的方法，然而，应当理解， 大量的等同物可以替代本文描述的指定的元件和步骤，而不脱离所附权利要求 书中描述的本发明的精神和范围。