具有抗炎作用的3α,11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有抗炎作用的羽扇豆烷型三萜3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸及其制备方法。本发明的化合物具有良好的抗炎作用。本发明的制备方法步骤简单，提取效率高，方案设计不影响产品结构，分离效果好，产品纯度高。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种具有抗炎作用的羽扇豆烷型三萜及其制备方法，更具体的，涉及具有下式I的羽扇豆烷型三萜3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸在制备用于炎症介质引起的疾病药物中的应用。 

式I 

背景技术

HMGB1是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白染色质蛋白，作为一种核DNA结合蛋白在稳定DNA的结构核功能以及基因转录等方面起着非常重要的调控作用。被刺激的免疫细胞可主动分泌HMGB1至细胞外，坏死、受损细胞和某些类型的凋亡细胞也可被动释放HMGB1。细胞外的HMGB1作为一种促炎症因子，能够与多种炎 症介质相互诱生，该介质炎症反应晚期出现，持续时间长。参与脓毒症、内毒素血症等炎症的病理发生过程。由于HMGB1是一种晚期炎症介质，其窗口期比其它细胞因子的靶向疗法的窗口期要长得多，针对HMGB1的抗炎措施在临床实际中的可操作性更强，HMGB1已经成为目前炎性和感染性疾病防治研究中一个重要靶标，与国家重大新药创制着重要解决的如恶性肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、自身免疫性疾病、耐药性病原菌感染、病毒感染性疾病等10类(种)严重危害人民健康的重大疾病直接相关，抗HMGB1药物的筛选具有重要的意义。 

TNF-α、IL-1β与HMGB1可相互诱生，对TNF-α、IL-1β分泌的抑制从理论上讲可以减少其对细胞的刺激，进而抑制HMGB1的分泌，从而起到很好的抗炎效果。 

传统中药和天然药物已成为创新药物研究开发的源泉，从中寻找活性高、副作用低的药物或先导物质进行创新药物研究有着合成药物无可比拟的优势。三萜及其苷类是最重要和研究最活跃的二次代谢产物，具有优良的生物活性及药理作用，尤其是在抗炎、免疫调节和抗肿瘤等方面显现出良好的前景。但关于羽扇豆烷型三萜抗HMGB1活性的系统研究除CN 100591334 C五加苷元的相关研究外未见其他报道。研究羽扇豆烷型三萜化合物的抗炎活性，特别是对HMGB 1分泌的抑制作用，对解决国家重大创新需要解决的创新药物问题，开发用于治疗重型肝炎和风湿病等的药物或药物前体，具有十分重要的意义。 

此外，由于活性单体在天然药物中存在的浓度极低，如何提高提取效率，提高产品纯度是本领域技术人员亟待解决的技术问题。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有抗炎作用的羽扇豆烷型三萜化合物3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸及其制备方法。 

本发明的化合物在重型肝炎、肝衰竭、风湿病、脓毒血症、内毒素血症、耐药性病原菌感染、病毒感染性疾病等病症中可以作为一种更有效、更安全的抗炎活性成分的应用。 

本发明一方面涉及一种具有抗炎作用的羽扇豆烷型三萜，其具有如式I的化学结构： 

式I 

本发明另一方面还涉及羽扇豆烷型三萜3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸在制备治疗炎症介质引起的疾病药物中的应用。 

上述所述的应用，其中所述的炎症介质包括但不限于高迁移率族蛋白-1(HMGB1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)或者白细胞介素-1 (IL-1)。 

上述所述的应用，其中所述的疾病包括但不限于脓毒血症、内毒素血症、肝衰竭、风湿病或重型肝炎。 

上述所述的应用，其中所述的疾病包括但不限于非感染性疾病的缺血、创伤或者烧伤。 

上述所述的应用，其中所述的疾病还包括其它并发症，例如肝性脑病、肝肾综合征或者出血症。 

上述所述的应用，其中，如果需要，所述的药物中包含或者不包含其它的抗炎活性组分，进一步的，可以作为主要活性(在所有活性成分中的质量百分比大于50％)成分或者唯一活性成分。 

本发明所述的式I的3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸，存在于五加科五加属植物、特别是细柱五加的叶子中。可通过提取分离制备得到。例如，本发明通过如下方法制备得到式I的3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸： 

将细柱五加叶用闪式提取器提取，甲醇(或者乙醇)为溶剂，在30～80℃提取1～3次；合并后减压回收醇后，用石油醚加热回流进行脱脂处理；脱脂后的提取液回收甲醇得到提取物；得到的提取物经大孔树脂，用30％-100％的乙醇梯度洗脱，收集60％～100％乙醇部分，合并后回收乙醇，干燥至干膏；将干膏用硅胶拌匀，通过硅胶柱层析，用按体积比氯仿∶甲醇∶水为22-28∶1∶0、18-22∶1∶0、9-11∶1∶0、8-10∶1∶0.1梯度洗脱，其中，18-22∶1∶0部分再分别用按体积比氯仿∶甲醇∶水为18-22∶1∶0、8-12∶1∶0.1的洗脱液，进行硅胶柱层析梯度 洗脱，收集18-22∶1∶0部分，除去溶媒，经ODS反相柱层析，以7-9∶2的甲醇∶水混合溶液洗脱，浓缩结晶后得到式I化合物。 

本发明发现，式I的3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸在浓度低于50μmol/L时对细胞生长基本没有影响，不具细胞毒性，在该安全浓度范围内，不同浓度的式I均可以显著降低LPS刺激下的RAW264.7巨噬细胞株TNF-α和IL-1β、HMGB1的分泌，作用显著，且呈现出剂量依赖关系。对它抑制HMGB1的机制初步探讨发现，可减少HMGB1释放，但不影响HMGB1总量，没有改变RAW 264.7细胞核内HMGB1的稳态水平。 

在本发明中，如果无特殊说明，当化合物名称与结构式存在矛盾时，以结构式为准 

附图说明

图1：EZ4U细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒测定式I细胞毒结果 

(各图柱为不同浓度式I干预后，460nm检测得出的各组OD值平均值(n＝3)，^*P＜0.05分别vs空白对照组，表明目标药物在该浓度对细胞生长有显著影响) 

图2：ELISA检测不同浓度式I干预组RAW 264.7培基上清中TNF-α水平 

(图柱为式I干预后，由标准曲线计算得出的浓度平均值(n＝3)，^*P＜0.05分别vs LPS空白对照组，表明目标药物对抑制TNF-α分泌有显著影响) 

图3：ELISA检测不同浓度式I干预组RAW 264.7培基上清IL-1β 水平 

(图柱为式I干预6h后，由标准曲线计算得出的浓度平均值(n＝3)，^*P＜0.05分别vs LPS空白对照组，表明目标药物对抑制IL-1β分泌有显著影响) 

图4：式I对LPS刺激RAW264.7 HMGB1分泌的影响 

(图中各数据是各组HMGB1灰度与LPS组比较的百分数，^*P＜0.05vs LPS+，I-组，表明该浓度对HMGB1分泌有显著影响) 

图5：RAW 264.7细胞总蛋白Western-blotting检测HMGB1 

具体实施方式

实施例1：制备羽扇豆烷型三萜3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸 

将细柱五加叶1000g，用闪式提取器提取，甲醇(或者乙醇)为溶剂，在30～80℃提取1～3次.合并后减压回收醇后，用石油醚加热回流进行脱脂处理；脱脂后的提取液回收甲醇得到提取物；得到的提取物经大孔树脂，用30％-100％的乙醇梯度洗脱，收集60％～100％乙醇部分，合并后回收乙醇，干燥至干膏。将干膏用硅胶拌匀，通过硅胶柱层析，用按体积比氯仿∶甲醇∶水为25∶1∶0、20∶1∶0、10∶1∶0、9∶1∶0.1梯度洗脱，其中，20∶1∶0部分再用按体积比氯仿∶甲醇∶水为20∶1、10∶1(比例关系不是很清楚)进行硅胶柱层析梯度洗脱，收集20∶1部分，除去溶媒，经ODS反相柱层析，以甲醇∶水(8∶2)洗脱，浓缩液使用乙醇结晶后得到式I化合物，得率0.13％，纯度HPLC检测99％以上。 

经检测，式I化合物：M.F.：C₃₀H₄₆O₅；Mp：189～191℃。 

表1式I化合物的¹H-NMR和^13C-NMR数据(pyridine-d₅，δppm) 

注(s：单峰；brs：宽单峰；m：多重峰；*：信号交叠，其峰型和J值较难分辨) 

其波谱数据分别如表1，因此确认其结构式如式I所示，可命名 为3α，11α-dihydroxy-23-oxo-lup-20(29)-en-28-oic acid(3α，11α-二羟基-23-醛基-羽扇豆-20(29)-烯-28-酸)。 

实施例2：目标药物的细胞毒性 

式I化合物终浓度为10、20、30、40、50、60、70、80、100、120μmol/L范围内进行EZ4U细胞毒性分析。培养好的RAW 264.7细胞用胰酶消化后，加入含10％FCS的DMEM配成1×10⁴个/mL单细胞悬液，接种于96孔板中，每孔约1000个细胞。5％CO₂饱和湿度的37℃条件下恒温培养箱培养8h，然后，换上新鲜的培基200μL，按梯度浓度将目标药物分别加入96孔板中(复孔，n＝3)，并设立空白对照。48h后，每孔加底物溶液20μL，继续孵育4h，终止培养，震荡10mins。选择460nm波长比色，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值。 

EZ4U细胞增殖与细胞毒性分析试剂盒检测发现，浓度较高时对细胞具有一定毒性作用，在大于50μM时就对RAW 264.7细胞的生长有影响，结果见图1所示。 

实施例3：对RAW 264.7TNF-α的影响 

药物干预：培养好RAW 264.7细胞后，用胰酶消化，加入含10％FCS的DMEM培养液配成4×10⁶个/mL单细胞悬液，接种于12孔板中，每孔约1×10⁶个细胞，贴壁后，马上换上无血清培基OPTI-MEM I，每孔1mL，根据EZ4U结果，选择不同浓度的式I化合物进行干预，一小时后加入终浓度为100ng/mL的LPS，5％CO₂饱和湿度的37℃条件下恒温培养箱培养，同时设立空白对照组、阳性对照组。 

干预6h后，采用ELISA法检测细胞培养液中TNF-α水平，按鼠TNF-αELISA试剂盒操作说明进行。于TNF-α单克隆抗体包被的酶标板中，标准孔加入100μL按试剂盒稀释的标准品溶液，样品孔、控制孔分别加入50μL药物干预后的各组细胞培养液和按使用说明稀释的控制样溶液并均加入50μL标准品稀释液，除光谱空白孔外其余各孔均加入50μL biotinylated Ms TNF-αBiotin Conjugate solution，混匀，封板，室温孵育90mins，洗板5次，除空白孔外，每孔加入100μL辣0根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液，封板，室温孵育30mins，洗板4次，加入显色剂100μL/孔，避光室温孵育30mins。加入终止液100μL/孔，混匀后立刻于酶标仪上450nm测定吸光度，浓度过高的加入标准品稀释缓冲液稀释，绘制标准曲线，由标准曲线方程读出各样品含量。 

ELISA检测RAW 264.7培基上清发现，式I化合物能减少TNF-α的分泌，并且在试验浓度范围内，呈剂量依赖型。具体结果见图2。 

实施例4：对RAW 264.7IL-1β的影响 

药物干预同实施例2。 

化合物干预6h后，采用ELISA法检测细胞培养液中IL-1β水平，按鼠IL-1βELISA试剂盒操作说明进行。于IL-1β单克隆抗体包被的酶标板中，除光谱空白孔外，其余各孔均加入50μL孵育缓冲液和50μL标准稀释液，标准孔加入50μL按试剂盒稀释的标准品溶液，样品孔、控制孔分别加入50μL药物干预后的各组细胞培养液和按使用说明稀释的控制样溶液，除光谱空白孔外其余各孔均加入50μL biotinylated Ms IL-1βBiotin Conjugate solution，轻拍板边缘混匀，封板，37℃孵育90mins，小心吸去溶液，洗板5次，除空白孔外，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液，封板，室温孵育30mins，洗板4次，加入显色剂100μL/孔，颜色变蓝，避光室温孵育30mins。加入终止液100μL/孔，混匀后立刻于酶标仪上450nm测定吸光度，浓度过高的加入标准品稀释缓冲液稀释，绘制标准曲线，由标准曲线方程读出各样品含量。 

ELISA检测RAW 264.7培基上清发现，式I化合物能减少IL-1β的分泌，在50μmol/L抑制率达66.7％，试验浓度范围内呈剂量依赖关系。具体结果见图3。 

实施例5：对RAW 264.7HMGB1分泌的影响 

药物干预同实施例2。 

药物干预8h后，吸取细胞培养液上清400μL加入Millipore公司生产的Centricon YM-10超滤器中(用蒸馏水预湿)，4℃，12000×g离心10mins，然后再次吸取400μL加入到该超滤器中，4℃，12000×g离心15mins。最后，倒置超滤器，1000×g离心2mins，用0.1M冰浴的PBS细心地从超滤器中洗下浓缩下来的蛋白，确保其终体积为40μL，浓缩后的样品置-70℃保存待用。 

吸取冰上缓慢解冻的浓缩样品25μL、总蛋白样品15μg并加水至25μL，分别加入5μL上样缓冲液。100℃加热10mins，使蛋白质变性。12％SDS-PAGE100V恒压电泳1.5h。电泳结束后，常规方法转膜1h。转膜后，封闭液37℃封闭1h；4℃孵育一抗(BD公司生产的兔抗人(鼠) HMGB1多克隆抗体1∶1000)，过夜；PBST洗涤PVDF膜10mins×4次；常温二抗(1∶5000)孵育1h，PBST洗涤10mins×4次；最后按Ecl Western Blot检测试剂盒说明进行特异性带显示，显影、定影、洗片。 

扫描底片后，用Quantity One软件进行光密度分析，观察各药物对HMGB1分泌的影响。 

式I在浓度达到50μmol/L时，上清中HMGB1的浓度仅有无药物干预时的8.2％，在小于50μmol/L浓度的范围内，呈剂量依赖型。具体结果见图4。 

实施例6：抗HMGB1化合物作用机制研究 

药物干预同实施例2。 

药物干预8h后，用冷PBS洗涤3-4次后，加100μL细胞裂解液(50mmol/L Tris、150mmol/L NaCl、0.1％SDS，0.02％叠氮钠，1％NonidetP-40，临用时加入终浓度为1mmol/L PMSF)置冰上裂解细胞30mins，收集细胞。最大功率脉冲超声粉碎30s，12000g、4℃离心30mins去除细胞碎片，取上清液，按BCA试剂盒说明测定蛋白浓度，样品置-70℃保存待用。 

蛋白浓度的测定按BCA蛋白含量检测试剂盒操作说明进行。简言之，准备一块96孔酶标板，按试剂盒要求加入标准品溶液，样品孔每孔加入4μL提取的蛋白上清液和16μL去离子水，各孔加入200μLBCA工作液，振荡30s，37℃下放置30mins，于562nm下比色测定。由标准品孔得出标准曲线，样品以0含量孔为参比，从标准曲 线上得出蛋白浓度。 

吸取冰上缓慢解冻的总蛋白样品15μg并加水至25μL，分别加入5μL上样缓冲液。100℃加热10mins，使蛋白质变性。12％SDS-PAGE100V恒压电泳1.5h。电泳结束后，常规方法转膜1h。转膜后，封闭液37℃封闭1h；4℃孵育一抗(BD公司生产的兔抗人(鼠)HMGB1多克隆抗体1∶1000)，过夜；PBST洗涤PVDF膜10mins×4次；常温二抗(1∶5000)孵育1h，PBST洗涤10mins×4次；最后按Ecl WesternBlot检测试剂盒说明进行特异性带显示，显影、定影、洗片。 

PVDF膜HMGB1显带后，用抗体剥离缓冲液15mins×2次后，再用TBST洗涤15mins×3次，再用Western-blotting方法将内参β-actin的特异带显示出来，然后与HMGB1带比对，观察胞内HMGB1蛋白含量是否变化。 

干预8h后总蛋白中的HMGB1含量没有明显的改变，这说明式I化合物可减少HMGB1释放，但不影响HMGB1总量，没有改变RAW264.7细胞核内HMGB1的稳态水平，结果见图5。它的作用与已报道的尼古丁、五加苷元等的作用是一致的。 

以上实施例显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，而不是以任何方式限制本发明的范围，在不脱离本发明范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。