舒洛地尔在制备抗血管生成类药物中的应用

摘要

本发明涉及到医药技术领域，具体涉及到舒洛地尔在制备抗血管生成类药物中的应用。本发明的舒洛地尔具有价格低廉、安全性高、原料来源广泛的特点，辅以药学上可接受的辅料，采用常规制剂技术即可制成各种口服、注射、外用制剂，具有良好的开发前景。

说明书

技术领域

本发明涉及到医药技术领域，具体涉及到舒洛地尔作为抗血管生成化合物的一种医药新用途。

背景技术

血管生成(angiogenesis)与人类多种重大疾病高度相关，如恶性肿瘤，老年视黄斑变性(Age-related macular degeneration，AMD)，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)，风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)，糖尿病视网膜变性(Diabetic retinopathy)以及肿瘤转移(Tumor metastasis)等^[1]。随着人口老龄化逐渐加剧，目前这些重大疾病已严重危害到了人民群众的生命健康。

1971年，哈佛大学Judah Folkman教授首次提出抗肿瘤血管疗法，他认为实体肿瘤的生长和扩散依赖于肿瘤内新血管的形成，并通过新生血管获取养分；新血管的形成和生长，促进了肿瘤细胞的转移^[2–4]。经过40年大量的基础理论研究，目前基于这一疗法，已有多个重磅专利新药上市，如罗氏的Bevacizumab (商品名Avastin，2010年全球销售额67亿美元) ，拜耳的Sorafenib (商品名Nexavar，2010年全球销售额9.94亿美元) ，辉瑞的Sunitinib (商品名Sutent，2010年全球销售额10.7亿美元)^[5–6]。但这些药物价格十分昂贵，均为外企医药巨头垄断。国内目前只有1支真正意义的抗肿瘤血管生成药物通过SFDA批准上市(恩度，先声药业，2005年上市)^[7]，但年销售额很少(2010年销售额仅2.5亿人民币)，尚无法参与全球竞争。其次，由于恩度(重组人血管内皮抑制素注射液，Recombinant Human Endostatin Injection)为大分子蛋白质类药物，生产这类高纯度安全制剂需要很高的技术门槛，而且此类型的药物在体内的半衰期较短，从而限制了这些活性蛋白的临床应用^[7]。

老年视黄斑变性(Age-related macular degeneration，简称AMD)是一种累及眼底视网膜黄斑区的变性眼疾。它因年龄增长而产生黄斑区变性，可引起中心视力急剧下降。据统计，全世界超过3000万人罹患此病。黄斑变性分为干性和湿性两种。湿性老年视黄斑变性主要因为脉络膜血管异常生成，新生的无效微血管出现渗漏，血管渗漏的液体进而破坏黄斑，导致中心视力显著下降，影响生活质量，甚至变盲。湿性老年视黄斑变性(AMD)已经成为65岁以上老年人失明的罪魁祸首^[8-9]。

治疗湿性AMD的方法主要有光动力疗法和抗血管药物疗法^[8-9]。光动力疗法主要通过静脉注入光敏药物，继而采用特定波长的非热能激光照射脉络膜新生血管病灶，将光敏药物活化。用光动力疗法治疗湿性AMD，只能稳定或降低湿性AMD视力下降的风险，并非对因治疗，不能阻止复发的可能。一般需要多次治疗。而且治疗后要避光48小时，以免发生光敏反应，造成皮肤灼伤，因此，给患者带来很多痛苦。目前治疗湿性AMD，已上市的药物主要有：辉瑞的哌加他尼钠(Pegaptanib，商品名Macugen)，诺华的兰尼单抗(Ranibizumab，商品名Lucentis)，拜耳的艾力亚(VEGF-Trap-eye，商品名Eylea)，这些药物的价格非常昂贵，一般需要每月经玻璃体内注射给药，这种冗长的给药过程很难被患者接受。因此，开发新型廉价的滴眼液来治疗老年黄斑变性是未来的发展趋势。

综上所述，在小分子化合物中寻求新的血管生成抑制剂来有效治疗上述疾病已成为研发热点，开发具有自主知识产权的靶向抗血管生成小分子药物迫在眉睫。

舒洛地尔，英文通用名：Suloctidil；中文名称：舒洛地尔；中文别名：索罗克替；分子量：337.56。舒洛地尔是一种强效的抗血小板药物，临床上主要用于治疗血栓。最新的研究表明，利用斑马鱼癫痫模型对2000个化合物进行高通量筛选发现舒洛地尔具有很强的抗癫痫效果^[10]。

舒洛地尔的化学结构式如下：

至今尚未见有关于舒洛地尔抗血管生成(anti-angiogenesis)活性的报道。

发明内容

本发明提供了舒洛地尔在制备抗血管生成类药物中的应用。

作为优选，本发明所述的抗血管生成类药物包括抗肿瘤和治疗湿性老年视黄斑变性药物。

研究表明，舒洛地尔通过抑制肿瘤内新血管的生成来预防或治疗肿瘤。舒洛地尔通过抑制脉络膜血管异常增生来预防或治疗湿性老年视黄斑变性。

作为更优选，本发明所述的抗血管生成类药物包括抗乳腺癌药物。

作为优选，本发明所述的抗血管生成类药物为药学上可接受的剂型，为口服给药剂型、注射给药剂型、粘膜给药剂型或经皮给药剂型。

作为更优选，本发明所述的抗血管生成类药物为药学上可接受的剂型，为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、注射液、贴剂或凝胶剂。

本发明利用斑马鱼血管生成模型进行舒洛地尔抗血管药效学实验。和传统的血管研究模型(啮齿类的老鼠和鸡胚尿囊模)相比，目前大量的研究证实，斑马鱼是最理想的血管生物学以及抗血管生成药物评价模型^[11–19]。啮齿类的老鼠和鸡胚尿囊模存在各自的缺点^[13–14]。通过利用斑马鱼血管生成模型进行药效学评价和药物新靶点验证，已有多支抗癌药物进入临床前实验(Pre-clinical Trial)或者临床试验 (Clinical Trial)阶段(包括已获得FDA批准上市的药物)，如Vatalanib (Novartis)^[15]、Compound 6 (TargeGen)^[16]、Rosuvastatin^[17]、Solenopsin(Eli Lilly)^[18]等；主要基于斑马鱼抗血管生成模型发现的一种治疗恶性肿瘤的老药新用药物——反应停（Thalidomide）已获FDA批准上市^[19]。

经斑马鱼血管生成模型证实，舒洛地尔对斑马鱼肠下静脉血管(subintestinal  vessel,SIV)有显著抑制的功能，并呈现一定的剂量依耐性，因此，舒洛地尔可用于制备抗血管生成抑制剂。

国内外在斑马鱼作为癌症移植模型和湿性视黄斑变性模型方面也有大量研究^[20-25]。经斑马鱼人类乳腺癌（MCF-7）移植模型证实，舒洛地尔能够显著抑制人类乳腺癌（MCF-7）的生长；经斑马鱼视黄斑变性模型证实，舒洛地尔对湿性老年视黄斑变性具有显著的治疗效果。因此，舒洛地尔可用于抗肿瘤及治疗湿性老年视黄斑变性。

斑马鱼相关缩略词：受精后小时数：hpf-hours postfertilization，肠下血管：SIV-subintestinal vessel，绿色荧光蛋白：GFP-green fluorescent protein。

本发明中出现的术语用于对本发明技术方案的阐述和理解，并不构成对本发明的限制。

本发明与现有技术相比，具有以下优点： 

本发明的舒洛地尔具有价格低廉、安全性高、原料来源广泛的特点，辅以药学上可接受的辅料，采用常规制剂技术即可制成各种口服、注射、外用制剂，具有良好的开发前景。

附图说明

图1为本发明受精后72小时(72hpf)血管转基因荧光斑马鱼肠下血管(SIV)模型。框定区域为肠下血管(SIV)网络局部放大观察的部位，箭头指示肠下血管(SIV, subintestinal vessel)。

图2为本发明定性观察舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)的抑制效果。图a-f，受精后48hpf的斑马鱼经过药物处理24h，观察时相为72hpf，其中：图a为阴性对照(0.1%DMSO)，图b为舒洛地尔处理组，图c为阳性对照(10μM洛伐他汀)，框定区域为肠下血管(SIV)局部放大观察的部位，箭头指示肠下血管(SIV)，虚线区域为肠下血管面积(SIV area)。与阴性对照相比，5μM舒洛地尔显著抑制斑马鱼肠下血管(SIV)的生成 ，表现为肠下血管面积减小(图d-f)。 

图3为本发明定量评价舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)模型的抑制效果。与阴性对照相比，舒洛地尔抑制斑马鱼肠下血管(SIV)生成呈现显著的剂量依耐性， ***P<0.001，差异极显著。

图4为本发明舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率和IC₅₀。舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，各浓度舒洛地尔组对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率分别为：1μM（5.30%），2.5μM（26.45%），5μM（54.35%），10μM（84.31%），25μM（100%）。利用GraphPad Prism软件计算IC₅₀≈4.68μM 。

图5为本发明斑马鱼人类乳腺癌（MCF-7）移植模型评价舒洛地尔的抗肿瘤药效。图a-f，移植人类乳腺癌（MCF-7）后2dpf的斑马鱼经过药物处理4d，观察时相为6dpf。图a为空白对照，图b为阴性对照(0.1%DMSO)，图d-f为不同浓度的舒洛地尔处理组，图c为阳性对照(1000μM5-FU)。

图6为本发明舒洛地尔对移植癌细胞的生长抑制率。舒洛地尔对人类移植癌细胞生长的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，三个浓度舒洛地尔组抑制率分别为：1μM（10.8%），2.5μM（23.2%），10μM（48.6%）。

图7为本发明定量评价舒洛地尔对视黄斑变性的治疗作用。图a-e，受精后1dpf的斑马鱼经过药物处理4d，观察时相为5dpf。虚线所示圆形区域内为脉络膜血管。图a为阴性对照(0.1%DMSO)，图b为模型组(1mg/ml氯化钴)，图c-e为不同剂量的舒洛地尔处理组。 

图8为本发明舒洛地尔对脉络膜血管异常增生的抑制率。舒洛地尔对脉络膜血管异常增生的抑制率随着注射剂量的上升而呈现梯度增加，三个舒洛地尔剂量组抑制率分别为：0.34μg（7.5%），1.13μg（26.7%），3.39μg（36.8%）。

具体实施方式

下面结合实施例和附图，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，优选实施例只是用于说明和解释本发明的内容，并不构成对本发明内容的限制。尽管发明人已经对本发明做了较为详细地列举，但是，本领域的技术人员根据发明内容部分和实施例所揭示的内容，能对所描述的具体实施例做各种各样的修改或/和补充或采用类似的方式来替代是显然的。

在本发明中，若非特指，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1定性观察舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)生成模型的抑制效果

    斑马鱼：

    本实施例使用的斑马鱼为血管转基因绿色荧光斑马鱼 (一种由斑马鱼内皮细胞特异表达的基因作为驱动子驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼血管内皮细胞特异表达)，饲养和使用标准严格参照美国实验动物管理和使用委员会(IACUC)的要求进行。

养鱼水的配制方法：1L反渗透水(reverse osmosis (RO) water)加入0.3g海盐(Instant Ocean salts)。 

    二甲基亚砜(DMSO，分析纯)：购买于阿拉丁(货号#1095515，批号#30573)。0.1% DMSO溶液(阴性对照)配制：使用时，用养鱼水配置成浓度为0.1%的工作液，现配现用。

    洛伐他汀(阳性对照)：购买于大连美仑，纯度大于98%(HPLC法)。使用时，用0.1% DMSO溶液配置成实验所需的浓度，本实验中阳性对照药的使用浓度为10μM。

舒洛地尔(Suloctidil)：购买于Sigma-Aldrich公司(货号#54767-75-8，批号#018F0289V)，使用时用0.1% DMSO溶液配置成不同浓度的舒洛地尔溶液，使用浓度分别为1μM，2.5μM  5μM，10μM，25μM。

斑马鱼肠下血管(SIV, subintestinal vessel)生长在卵黄囊两侧，其形状似一个篮子，肠下血管(SIV)由体节腹侧向下延伸的长度约为50～100μm^[15-16]，见图1(72hpf血管转基因荧光斑马鱼肠下血管模型)。

实验方法如下：

(1)实验分组及胚胎处理：取45只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后48hpf (hour-postfertilization，hpf) ，随机分为3组(阴性对照组，药物组，阳性对照组)，每组胚胎数量为15只。操作时将胚胎均匀分配至48孔细胞培养平板(Greiner，德国)中，每孔15只胚胎，每孔胚胎饲养用水1ml。

(2)药物处理：用移液器(量程100～1000μl，Eppendorf)迅速将预先配置好的药液加入48孔细胞培养平板对应的孔中，每孔1ml。加药液之前，用移液器(量程10～1000μl，Eppendorf)将48孔板中孵育胚胎的饲养用水尽力移出，此操作需在短时间内预先完成，以防止胚胎干燥。实验环境温度控制在28.5℃左右，相对湿度40～70%。然后用锡箔纸将48孔板包裹好，做好实验标记，迅速放置于斑马鱼培养箱中继续培养24h(培养箱温度控制在28.5±0.5℃)。

(3)表型观察及统计：在体式显微镜下观察各孔胚胎的表型，观察指标：观察药物对胚胎发育、血液循环，心脏跳动等方面的影响。然后，将血液循环受到影响的胚胎置于体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进一步观察拍照，拍照时相为72hpf，以确认血管生成抑制表型。

实验结果见图2：5μM舒洛地尔显著抑制斑马鱼肠下血管(SIV)的生成 ，表现为肠下血管面积减小。

实施例2定量评价舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)生成模型的抑制效果

实验方法：

(1)实验分组及胚胎处理：取210只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后48hpf (hour-postfertilization，hpf) ，随机分为7组，见下表：

每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至48孔细胞培养平板（Greiner，德国）中，每孔15只胚胎，每个药物浓度处理30只胚胎，每孔胚胎饲养用水1ml。  

(2)药物处理：见实施例1中的实验方法操作步骤(2)。

    (3)表型观察及定量统计：将各药物浓度处理后的胚胎在体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进行观察拍照，拍照时相为72hpf，以分析各药物浓度对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的影响。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计，统计指标如下：

①肠下血管面积(SIV area)：利用Nikon AZ100体式荧光显微镜配置的NIS-Elements 3.1软件进行计算

②肠下血管(SIV)生成抑制率（%）=（1-）× 100%

利用GraphPad Prism软件进行统计作图， 并计算舒洛地尔抑制斑马鱼肠下血管(SIV)生成的IC₅₀ ，实验结果见图3～图4：舒洛地尔对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，各浓度舒洛地尔组对斑马鱼肠下血管(SIV)生成的抑制率分别为：1μM（5.30%），2.5μM（26.45%），5μM（54.35%），10μM（84.31%），25μM（100%），IC₅₀为4.68μM 。

实施例 3斑马鱼人类乳腺癌（MCF-7）移植模型评价舒洛地尔的抗肿瘤药效

实体肿瘤的生长和扩散依赖于肿瘤内新血管的形成，并通过新生血管获取养分；新血管的形成和生长，促进了肿瘤细胞的转移。本实施例用于说明舒洛地尔能够抑制肿瘤的生长和迁移。实验方法如下：

 (1)实验分组及胚胎处理：取150只移植有人类乳腺癌（MCF-7）细胞的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后2dpf (day-postfertilization，dpf) ，随机分为5组，见下表：

每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至6孔细胞培养平板(Greiner，德国)中，每孔30只胚胎，每个药物浓度处理30只胚胎，每孔胚胎饲养用水3ml。  

(2)药物处理：用移液器迅速将预先配置好的药液加入6孔细胞培养平板对应的孔中，每孔3ml。然后用锡箔纸将6孔板包裹好，做好实验标记，放置于斑马鱼培养箱中继续培养4d(培养箱温度控制在35.5±0.5℃)。

(3)表型观察及定量统计：将各浓度药物处理后的胚胎在体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进行观察拍照，拍照时相为6dpf，以分析各药物浓度对斑马鱼人类乳腺癌（MCF-7）移植模型的抑制作用。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计，统计指标如下：

① 定性评价舒洛地尔对肿瘤转移的抑制作用；

② 定量评价舒洛地尔对肿瘤生长的抑制作用：利用尼康NIS-Elements 3.1软件计算肿瘤细胞荧光强度（S），统计学处理结果以mean±SE表示；舒洛地尔对肿瘤生长的抑制效果计算公式如下：

肿瘤生长抑制率（%）=（1-）× 100%

利用GraphPad Prism软件进行统计作图，实验结果见图5～图6：舒洛地尔对人类移植癌细胞生长的抑制率随着浓度的上升而呈现梯度增加，三个浓度舒洛地尔组抑制率分别为：1μM（10.8%），2.5μM（23.2%），10μM（48.6%）。

实施例4定量评价舒洛地尔对湿性老年视黄斑变性的治疗作用

湿性老年视黄斑变性主要因为脉络膜血管异常生成，新生的无效微血管出现渗漏，血管渗漏的液体进而破坏黄斑。氯化钴能够诱导斑马鱼视网膜脉络丛血管增生、视细胞变性，类似于人类湿性老年视黄斑变性的改变^[26]。本实施例用于说明舒洛地尔对湿性老年视黄斑变性具有治疗效果。实验方法如下：

 (1)实验分组及胚胎处理：取150只发育良好的斑马鱼胚胎，胚胎发育时相为受精后1dpf (day-postfertilization，dpf) ，随机分为5组，见下表：

每组斑马鱼胚胎数量30只。操作时将胚胎均匀分配至6孔细胞培养平板(Greiner，德国)中，每孔30只胚胎，每孔胚胎饲养用水3ml。  

(2)药物处理：阴性对照组中加入DMSO，使其终浓度为0.1%；模型组中加入氯化钴，使其终浓度为1 mg/ml；舒洛地尔通过显微注射方式给药，每组均注射30只胚胎，注射后将胚胎按组分别放入3ml含有1 mg/ml氯化钴的饲养用水中。

(3)表型观察及定量统计：将各剂量药物处理后的胚胎在体式荧光显微镜(Nikon AZ100体式荧光显微镜)下进行观察拍照，拍照时相为5dpf，以分析各药物剂量对斑马鱼眼部脉络膜异常增生血管的抑制作用。从各实验组随机取10只胚胎进行定量统计，统计指标如下：

①定性评价舒洛地尔对眼部脉络膜异常增生血管的抑制作用；

②定量评价舒洛地尔对脉络膜异常增生血管的抑制作用：利用NIS-Elements 3.1软件计算脉络膜异常增生血管荧光强度（S），统计学处理结果以mean±SE表示；舒洛地尔对脉络膜异常增生血管的抑制效果计算公式如下：

脉络膜血管异常增生抑制率（%）=（1-）× 100%

利用GraphPad Prism软件进行统计作图，实验结果见图7～图8：舒洛地尔对脉络膜血管异常增生的抑制率随着剂量的上升而呈现梯度增加，三个舒洛地尔剂量组抑制率分别为：0.34μg（7.5%），1.13μg（26.7%），3.39μg（36.8%）。

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