公开/公告号CN103031327A
专利类型发明专利
公开/公告日2013-04-10
原文格式PDF
申请/专利权人 华东理工大学;
申请/专利号CN201210274040.6
申请日2012-08-02
分类号C12N15/70(20060101);C12N15/75(20060101);C12R1/19(20060101);C12R1/125(20060101);C12R1/07(20060101);
代理机构上海三和万国知识产权代理事务所;
代理人章鸣玉
地址 200237 上海市徐汇区梅陇路130号
入库时间 2024-02-19 17:23:11
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2015-11-25
授权
授权
2013-05-08
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/70 申请日:20120802
实质审查的生效
2013-04-10
公开
公开
技术领域
本发明涉及生物技术中的遗传工程或合成生物学领域，具体地涉及基因表达调控 领域更具体地涉及原核细菌细胞中基于光敏蛋白的光诱导基因表达系统，及采用该表 达系统调控原核细菌细胞中基因表达的方法。
背景技术
在遗传工程领域，准确控制基因的表达对于研究基因的功能以及生命体的生命活 动均具有非常重要的意义。相对于真核细胞复杂的基因表达系统，原核细菌的基因表 达系统则简单很多。以原核细菌中被使用最广泛的大肠杆菌为例，基因表达的第一步 是由RNA聚合酶完成的DNA转录为RNA。大肠杆菌的RNA聚合酶有五个亚基组成， 其分子量为约为480Kd，含有α，β，β’，σ等4种不同的多肽，其中α为两个分子， 所以全酶（holoenzyme）的组成是α2ββ’σ。α亚基与RNA聚合酶的四聚体核心（α2ββ’） 的形成有关；β亚基含有核苷三磷酸的结合位点；β’亚基含有与DNA模板的结合位点； 而σ因子只与RNA转录的起始有关，与链的延伸没有关系。一旦转录开始，σ因子就 被释放，链的延伸则由四聚体核心酶（core enzyme）催化。所以，σ因子的作用就是 识别转录的起始信号，并使RNA聚合酶结合在启动子部位。DNA分子上的起始信号， 即“启动序列”称为启动子。大肠杆菌的启动子序列主要由-10区和-35区组成，-10区 位于转录起点上游大约10bp处，含6个碱基的TATATA保守序列，它是RNA聚合 酶的紧密结合位点；位于转录起点上游大约35bp处还有6个碱基的TTGACA保守序 列，-35区提供了RNA聚合酶全酶识别的信号；大肠杆菌启动子的强弱主要取决于-10 区和-35区的剪辑碱基组成以及彼此的间隔长度。虽然单独的核心酶能与DNA结合， 但主要是由于碱性蛋白质与酸性核酸之间的非特异性静电引力造成的，DNA仍保持双 螺旋形式，而σ亚基能改变RNA聚合酶与DNA之间的亲和力，大大地增加酶与启动 子的结合常数和停留时间。因此开始时核心酶在σ亚基参与下与DNA分子接触，形 成非专一性复合物，这样的复合物是很不稳定的，酶分子可在DNA链上滑动。在σ 亚基作用下帮助全酶迅速找到启动子，并与之结合生成较松弛的封闭型启动子复合物。 这时酶与DNA外部结合，识别部位大约在启动子的-35位点处。接着是DNA构象改 变活化，得到开放型的启动子复合物，此时酶与启动子紧密结合，在-10位点处解开 DNA双链，识别其中的模板链。由于该部位富含A-T碱基对，故有利于DNA解链。 开放型复合物一旦形成，DNA就继续解链，酶移动到起始位点。使用比较广泛的另一 原核细菌是芽孢杆菌，它是一种革兰氏阳性细菌。与大肠杆菌不同的是，芽孢杆菌含 有多种RNA聚合酶和σ因子，它们分别识别不同的启动子序列。
原核细菌的基因表达系统主要分为两种，一种是组成型表达，即在不需要诱导的 条件下，使目的蛋白自主连续性的表达。另一种是诱导表达系统，在诱导表达系统中， 根据诱导物的不同又可分成化学小分子诱导表达系统和物理方法诱导表达系统两种。 化学小分子诱导表达系统中，IPTG是最常用的一种诱导剂。IPTG作为乳糖的类似物， 是一种极强的诱导剂，它不被细菌代谢且十分稳定。目前最常用的一些表达载体中， 多数含T7启动子、Lac启动子、Tac启动子、grac启动子的，其诱导剂均是IPTG。阿 拉伯糖和色氨酸诱导表达系统现在也越来越被更多的采用，小分子阿拉伯糖和色氨酸 具有对细胞没有毒性且能达到紧密调控等优点。Mn2+、Fe2+、Cu+等金属离子感受蛋白 的发现使得人们的视线也渐渐投入到金属离子结合相应的感受蛋白来诱导蛋白表达的 方向。物理方法诱导表达系统中常用的是利用温度变化来诱导蛋白表达，例如大肠杆 菌中的LacI的温度敏感突变体，在30℃时具有抑制启动子的活性，在42℃时失活从 而失去抑制启动子的活性。紫外线（UV）调控的“囚笼（caged）”技术是另一种常用 的物理诱导表达方法[Keyes,W.M.等,Trends Biotechnol,2003.21(2):53-55.][1]。
以上所述原核细菌诱导表达系统虽已获得较广泛应用，但是仍存在一些缺点： （1）诱导剂本身对细胞有较大的毒性、且价格偏贵(如IPTG)，在制备医疗目的的重 组蛋白时并不合适；（2）金属离子诱导表达系统中，金属离子感受蛋白识别金属离 子的特异性不强，同一家族或同一周期的不同金属离子可被同一感受蛋白结合而激活 转录，因此原核细菌细胞内部坏境中存在的多种金属离子会对转录产生一定的干扰， 而且原核细菌细胞本身的氧化环境会对低价金属离子产生氧化作用，从而干扰对氧化 环境要求较高的金属离子的激活转录；（3）温度诱导表达系统中，外界温度的升高 会导致大肠杆菌的热休克蛋白激活，一些蛋白酶会影响产物的稳定，很多目的蛋白质 在高温下也难以正确折叠，因而UV诱导的囚笼技术可能造成对细胞的不可逆性损 伤；（4）最重要的是，化学诱导物只能在时间上调节基因的表达，不能在空间上特 异性调控某些细胞及组织的基因表达。
然而，光是一种易于时间和空间操作的诱导物，一般对细胞无上述毒性，且易获取。 近些年来，人们也发现了一些生物体内调节生物钟系统中存在光可调节蛋白（也称为光 敏蛋白），光照对其功能存在重要的影响。我们设想通过分子设计的方法，改造天然存 在转录因子去合成具有光反应性的人工转录因子，进而在原核细菌细胞中构建光调控基 因表达系统。目前在原核细菌中这方面的报道很少，共涉及两个系统。Anselm Levskaya 等在2005年报道了一个基于光敏色素Cph1和大肠杆菌自身EnvZ/OmpR双组分信号通 路的光调控蛋白质表达系统[Levskaya,A.等,Nature,2005.438(7067):p.441-2.][2]。在 黑暗条件下，光敏转录因子发生自磷酸化后结合到OmpR依赖的ompC启动子上，从而 启动目的基因的转录与表达。在红光的照射下，光敏转录因子的自磷酸化作用被抑制， 不能结合到ompC启动子，因而不能激活目的基因的转录与表达。随后的几年里，同一 研究小组对这种光诱导表达系统进行了一些改变，得到可用多种颜色的光共同调节目的 蛋白的表达[Tabor,J.J.等,J Mol Biol,2011.405(2):p.315-24，Tabor,J.J.等,Cell,2009. 137(7):p.1272-81.][3,4]。Keith Moffat课题组开发了另一个新的重组光敏转录因子 YF1，它是基于来自枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的YtvA蓝光光敏蛋白和来自慢生 根瘤菌（Bradyrhizobium japonicum）的FixL蛋白[Moglich,A.等,J Mol Biol,2009.385(5): p.1433-44，Ohlendorf，R.等,J Mol Biol，2012.416,534-542.][5,6]。基于YF1的光诱导 基因表达系统在蓝光存在的情况下目的蛋白的表达受到抑制，没有蓝光存在时目的基因 则高水平表达。然而，这两种原核基因表达系统都有较大的局限性。前者的系统非常复 杂，它除了需要光敏转录因子和报告系统外，还需要引入ho1和pcyA两个基因才能将 血红素（haem）转化成系统正常工作所必需的藻蓝素（phycocyanobilin），大大增加了 构建系统时的工作量。后者的系统在蓝光照射下依旧有较多的泄漏表达，诱导倍数仅有 几十倍，这样就不能对目的基因的表达量进行非常精确的调控。以上所述缺点限制了这 两个光诱导表达系统在原核细菌中的使用。到目前为止，除了上述系统使用的Cph1和 YtvA光敏蛋白外，已知的其它光敏蛋白还有：以黄素类物质为生色团的光敏蛋白（亦 称为黄素蛋白家族蓝光受体），分为三类：一是含光-氧-电压（light-oxygen-voltage， LOV）结构域的光受体蛋白，如光敏色素；二是类似光裂解酶的隐花色素（photolyase-like cryptochromes）；第三类是近些年来才发现的利用FAD的蓝光蛋白（blue light using FAD, BLUF）。
光敏色素是含LOV结构域的光受体蛋白质最多的一类，研究较多的有phot1、WC-1、 WC-2、PYP（光敏黄色蛋白，photoactive yellow protein）、Phy3、VIVID等。光敏色 素通常是膜偶联激酶蛋白，在蓝光照射下发生自磷酸化改变激酶活性而调控相关的生 理过程。大多数光敏色素的C端为丝氨酸/苏氨酸激酶结构域N端为结合黄素分子的两 个LOV结构域，蓝光照射时LOV结构域与黄素分子共价结合生成黄色-半胱酰胺加成 产物引起黄素结合口袋空间构象变化，导致C端激酶结构域改变其激酶活性，但此过 程完全可逆。迄今，在真核生物细胞中已建立的最成功的光诱导表达系统正是基于 VIVID光敏蛋白。Yang课题组[Wang,X.等,Nat Methods,2012.p.266-269.][7]利用粗糙 链孢霉菌的VIVID蓝光光敏蛋白经蓝光照射后会形成同源二聚体的原理构建了一个真 核光调控基因表达系统。在这个系统中，光敏转录因子由三个或者四个多肽组成，蓝 光照射后重组光敏转录因子的二聚化能力发生变化，二聚化的转录因子可结合于靶转 录单元核苷酸序列中的反应元件，并通过该融合蛋白的第三多肽的转录激活/阻遏结构 域和募集的宿主细胞本身的其它转录辅因子，一起协同作用于该靶转录单元中的启动 子，从而调节（启动或阻遏）目的基因的转录和表达。该系统组分简单且具有诱导迅 速、诱导倍数高、可逆性好、时间和空间特异性高等优点而被认为是迄今最优秀的真 核生物细胞基因表达系统。但遗憾的是，由于原核细菌和真核生物细胞的转录翻译机 理的不同，因此该系统不能应用于原核细菌中。此外，Masayuki Yazawa等[Yazawa,M. 等，Nat Biotechnol,2009.27(10):p.941-5.][8]利用拟南芥的FKF1（flavin-binding,kelch repeat,fbox1）与GI（GIGANTEA）蛋白二者经蓝光激发后可发生相互作用的原理也 构建了一个真核光调控基因表达系统，但其低诱导倍数和稍显复杂的系统组分大大限 制了它的应用。
来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的隐花色素是第一个被分离得到的植物蓝光光 敏蛋白，研究比较多的有隐花色素1（Cryptochromes1，CRY1)、隐花色素2 （Cryptochromes2，CRY2)、光敏色素A（phytochrome A，phyA)和光敏色素B (phytochrome B，phyB)等，主要功能是接受昼夜节律光调节高等植物的生长和运动。 隐花色素的氨基酸序列和生色团组成与光裂解蛋白很相似，多数隐花色素的大小为 70kD-80kD，包含相对保守的N端PHR（光裂酶相关）结构域和长度差异较大的C端 未知结构域，其PHR结构域可非共价结合黄素。有研究利用拟南芥CRY2（隐花色素 2）与CIB1（隐花色素2相互作用的螺旋环螺旋）蛋白二者经蓝光激发后可发生相互 作用，构建了一个真核生物细胞内的光诱导表达系统[Kennedy,M.J.等,Nat Methods, 2010.7(12):p.973-5.][9]。
包含BLUF结构域的蓝光受体蛋白和包含LOV结构域的光受体蛋白与隐花色素 不同的是，前者光照激活后不会与黄素生色团反应生成共价产物，而是导致生色团构 象变化引起黄色吸收光发生10nm红移。包含BLUF结构域的光受体蛋白研究最多的 是AppA，它是球状红杆菌（Rhodobacter sphaeroides）的一种转录抗阻遏蛋白，黑暗 时AppA与细胞中的一种PpsR转录因子结合形成AppA-PpsR2复合物，使PpsR不能 结合DNA；强蓝光照射可使AppA从复复合物上解离而释放PpsR形成四聚体结合于 特定DNA序列导致抑制相关基因的转录[Pandey,R.等,FEBS J,2012.][10]。
Haifeng Ye等人[Ye,H.等,Science,2011.332(6037):p.1565-8.][11]利用黑视素 （melanopsin）及细胞内信号通路构建得到一个蓝光激发的真核生物细胞光诱导表达系 统。黑视素是一种在某些视网膜细胞表面的感光色素。在蓝光存在下，黑视素会触发 钙离子快速地涌入细胞内，经过细胞内一系列信号级联反应后，钙调蛋白（calmodulin） 激活具有丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性的钙调神经磷酸酶（calcineurin），后者将转录因子 NFAT去磷酸化，去磷酸化的NFAT转录因子进入细胞核内与NFAT特异性的启动子 结合后启动目的基因的转录与表达。该系统最大的缺点是系统复杂且参与了细胞内的 信号通路，因而系统本身稳定性差，并且有可能通过影响细胞的信号通路而影响细胞 的正常生命活动。
相对于真核生物细胞，原核细菌具有增殖快、培养成本低、能够高效表达外源蛋白 （甚至可以达到细菌总蛋白量的90%以上）等多种优点，这些优点使得原核细菌更适合 作为大量表达目的蛋白的宿主细胞。然而如上所述，目前已有的广泛用于原核细菌的基 因表达系统大多数采用化学诱导剂调控，虽然其诱导效果较好，背景低、表达强度高， 但许多系统具有多效性因而副作用广泛并有潜在的细胞毒性。更为重要的是，化学诱导 剂不能在空间上精确调控基因的表达；而物理方法（如温度）调节基因表达的系统目前 很少，且温度的升高带来的副作用很多。少数几种基于光敏蛋白的基因表达系统，由于 系统本身的复杂性或者诱导倍数低等原因限制了其应用。
综上所述，我们认为有可能综合这些系统的优点在原核细菌中创造出一种新的更优 秀的光诱导基因表达系统，以克服前人研究的缺陷而广泛用于生物医药研究中。经过潜 心研究，发明了一种新型的原核细菌光诱导基因表达系统，它具有良好的基因表达调控 能力，可以在时间和空间上共同调控基因的表达。
因此，本发明的第一个目的是提供一种新型原核细菌光诱导基因表达系统。
本发明的第二个目的是提供用所述光诱导基因表达系统调节原核细菌细胞中基因 表达的方法。
本发明的第三个目的是提供含有所述光诱导基因表达系统的原核细菌表达载体。
本发明的第四个目的是提供所述光诱导基因表达系统在调节原核细菌的生命活动 （如细菌的移动、裂解等）上的用途。
本发明的第五个目的是提供装有所述原核细菌光诱导基因表达系统的表达载体 或基因组上整合了所述表达系统中光敏转录因子表达框的原核细菌菌株的试剂盒。
发明概述
本发明涉及提供一种原核细菌光诱导基因表达系统，包括：a）重组光敏转录因子 编码基因，所述重组光敏转录因子包括作为DNA结合结构域的第一多肽和作为光敏 结构域的第二多肽；b）靶转录单元，包括被第一多肽识别/结合的包含至少一个反应 元件的启动子或启动子-反应元件或反应元件-启动子和待转录核酸序列。
本发明的原核细菌光诱导基因表达系统中，重组光敏转录因子是一种重组光敏 DNA结合蛋白，在光照前后这种光敏DNA结合蛋白与相应反应元件的结合能力发生 显著变化，从而直接抑制或者启动基因的转录与翻译。
重组光敏转录因子的第一多肽为DNA结合结构域，它能够特异性地识别反应元 件，单独不能够结合到反应元件上或者是结合能力很弱，需要第二多肽来辅助其结合 到反应元件。第一多肽与第二多肽之间可操作性连接。
第一多肽可选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA结合结 构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋-转角-螺 旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合结构域、 B3DNA结合结构域。第二多肽为光敏结构域，通常来自以黄素类为生色团的光敏蛋 白。第一多肽和第二多肽之间可以直接连接，也可操作性地通过接头肽连接。接头肽 的氨基酸个数是可变的（如0－10个或更多）。
第一多肽可进一步选自大肠杆菌LexA DNA结合结构域、λ噬菌体cI阻遏蛋白的 DNA结合结构域、Lac阻遏蛋白LacI的DNA结合结构域、酵母Gal4DNA结合结构 域、四环素组合蛋白TetR的DNA结合结构域，及其截短体或/和氨基酸序列同源性 80%-99%的突变体。
第二多肽选自含黄素类生色团的光敏蛋白的光敏结构域和含LOV结构域的光敏 蛋白的光敏结构域。进一步可选自粗糙链孢霉菌的VIVID的LOV结构域、燕麦光敏 色素1基因的LOV2结构域AsLOV2、无隔藻金色素蛋白1的LOV结构域AuLOV和 假单胞菌的LOV结构域PpSB1-LOV及其截短体或氨基酸序列15%-99%相同或氨基酸 序列36%-99%相似的突变体。
本发明的原核细菌光诱导基因表达系统中，靶转录单元中的启动子-待转录核酸序 列之间，或者启动子-反应元件-待转录核酸序列之间，或者反应元件-启动子与待转录 核酸序列之间均可直接或操作性连接。
所述反应元件为可被第一多肽特异性识别和结合的DNA基序。反应元件选自 LexA结合元件、cI结合元件、LacI结合元件、Gal4结合元件和TetR结合元件。
所述启动子选自大肠杆菌的colE启动子、sulA启动子、recA启动子、umuDC启 动子、lac最小启动子、T7噬菌体的T7启动子、λ噬菌体的O12启动子，枯草芽孢杆 菌的grac启动子。
按照本发明的原核细菌光诱导基因表达系统，重组光敏转录因子还可进一步包含 附加的多肽，如可以招募RNA聚合酶其他组分的第三多肽。第三多肽与第一、第二多 肽可直接连接或通过接头肽连接。第三肽可选自大肠杆菌的ω因子、α因子或氨基酸 序列36%-99%相似的突变体。
本发明还涉及含有本发明的光诱导基因表达系统的原核细菌表达载体。所述表达 载体可以是单独含有重组光敏转录因子编码基因的原核细菌表达载体，也可以是单独 含有靶转录单元的原核细菌表达载体，所述靶转录单元中含有启动子但待转录核酸序 列空缺或启动子-反应元件但待转录核酸序列空缺或反应元件-启动子但待转录核酸序 列空缺。或者，也可以是同时含有重组光敏转录因子编码基因和靶转录单元的原核细 菌表达载体。
所述表达载体中的所述重组光敏转录因子编码基因选自序列48、50、52、54、56、 58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、 96、98、100、102、104、106、109。
本发明还涉及基因组上整合了本发明的光诱导基因表达系统中光敏转录因子表 达框的原核细菌菌株。
本发明也涉及用本发明的光诱导基因表达系统在原核细菌细胞中调控基因表达的 方法，包括以下步骤：
a）将所述原核细菌光诱导基因表达系统构建在原核细菌表达载体中；
b）引入含被调控基因的原核细菌细胞；和
c）光照诱导所述原核细菌细胞，使原核细菌细胞中的被调控的核苷酸进行表达。
本发明的在原核细菌中调控基因表达的方法，涉及光源的选择和照射方法的选 择。光源非限制地包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光；照射方法包括光照量、光照 时间、光照强度及光照频率的选定。用扫描、投影、光模具等方法在空间上控制目的 基因的表达也包含在本发明范围中。
本发明还涉及用本发明的光诱导基因表达系统来调控原核细菌生命活动的方法， 如移动、裂解等。
本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒装有含本发明光诱导基因表达系统的原核细 菌（如大肠杆菌）表达载体或基因组上整合了本发明光诱导基因表达系统中光敏转录 因子表达框的原核细菌菌株，及相应的说明书。本发明试剂盒中的原核细菌表达载体 所包含的靶转录单元中待转录核酸序列可以是空缺的。
发明详述
本发明提供一种基于光敏多肽的、光诱导的原核细菌基因表达系统，用于在时间 和空间上调节目的基因在原核细菌细胞中基因的表达。本发明的光诱导基因表达系统 涉及至少两个部分：第一部分是能够在原核细菌细胞中表达的重组光敏转录因子融合 蛋白的编码核苷酸序列，该融合蛋白由两个多肽组成，其中第一多肽是其DNA识别/ 结合域，第二多肽为光敏多肽；第二部分是由含启动子-待转录核苷酸序列或者启动子 -反应元件-待转录核苷酸序列或者反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成的靶转录 单元核苷酸序列，其中反应元件是与上述重组光敏转录因子融合蛋白第一多肽所识别/ 结合的DNA核苷酸序列。第一部分的两个多肽优选采用有关蛋白的截短的功能活性 片段（即结构域）。可通过基因工程技术将本发明的光诱导基因表达系统的第一部分 和第二部分构建在一个原核细菌表达载体中或分别构建在二个原核细菌表达载体中。 在具体使用过程中，利用常规转化的方法将上述的两个组分转化到原核细菌细胞中去， 或者将第一部分利用常规的基因敲除的方法整合到原核细菌细胞的基因组上去，使之 表达本发明的重组光敏转录因子融合蛋白，用适当波长的光照射可导致其第二光敏多 肽二聚化能力改变，二聚化的光敏多肽可以结合到本发明第二部分靶转录单元核苷酸 序列中的反应元件上去，通过阻碍RNA聚合酶与启动子区域的结合来直接抑制下游目 的基因的转录和表达，或者通过招募RNA聚合酶的其他组分到启动子区域来启动下游 基因的转录与表达。
本发明提供的这种原核细菌光诱导基因表达系统，可利用不会损伤细胞的光照 射，在时间上和空间上调节目的蛋白基因在原核细菌细胞中的表达。
本发明的这种原核细菌光诱导基因表达系统，可利用不同的光照强度等光照条件 的差异来调节目的蛋白基因在原核细菌细胞中的表达。
本发明的这种原核细菌光诱导基因表达系统，可通过光来诱导一些蛋白的表达来 控制原核细菌的生命活动，如运动、裂解等。所用的光廉价、易于获得、对细胞没有 毒性。
本文所用术语的定义和解释
“宿主细胞”在本专利中特指原核细菌细胞，可以是原始的未经改造的原核细菌细 胞，也可以是基因组经过改造的商业化原核细菌菌株，如实验常用的BL21、 JM109(DE3)、DH5α、枯草芽孢杆菌WB800等，也可以是在这些商业化菌株的基础上 再进行基因组改造的得到的原核细菌菌株，如本发明中敲除了基因组中sulA基因、 LexA基因得到的JM109(DE3,sulA-,LexA-)大肠杆菌菌株，或者基因组上整合有本发明 重组光敏转录因子的JM109(DE3,sulA-，LexA::Amp-LV-L0)大肠杆菌菌株；也可以是其 他和本发明的光诱导基因表达系统相容的宿主细胞均可以。
“目的蛋白”也可称为“感兴趣蛋白”，指任何有用的蛋白，例如可用于预防或治疗 目的或其他用途的、需要在大肠杆菌细胞中表达的有用生物蛋白质，包括天然的或人 工修饰或突变的有用蛋白质。
“报告蛋白”为目的蛋白的一种，指其表达容易被检测的有用蛋白质。为便于检测 本发明基于光敏多肽的、光可诱导的目的蛋白基因表达系统的效果，可以选择以下已 知的广泛应用的报告蛋白：红色荧光蛋白(mCherry)，β-半乳糖苷酶(LacZ)等。但本发 明的光可诱导目的蛋白基因表达系统不限于表达报告蛋白，而可用于表达任何有用的 目的蛋白。
“基因”、蛋白质的“编码核苷酸序列”、“待转录核苷酸序列”在本文中含义相同可 互换使用，指天然或重组的携带蛋白质氨基酸序列信息密码子的DNA序列。
“目的蛋白基因”、“目的蛋白的编码核苷酸序列”或简称为“目的基因”在本文中含 义相同，可互换使用，指编码目的蛋白的基因，通常为脱氧核糖核酸DNA双链序列。 这种基因可包含在宿主细胞的基因组DNA序列中或包含在人工构建的表达载体中， 如本发明的靶转录单元序列中。同样，“报告基因”指编码报告蛋白的基因。
“转录”在本文中专指原核细菌细胞中通过RNA聚合酶将目的基因转录产生携带该 基因信息的RNA。
“表达”、“目的蛋白基因表达”、“基因表达”在本文中含义相同可互换使用，指目 的基因的DNA序列转录产生携带该基因信息的RNA（mRNA或反义RNA）和该RNA 携带的信息在核糖体中被翻译产生目的蛋白二者，即转录产生信息RNA和翻译产生目 的蛋白都叫做表达。本文包括这二种含义，主要指产生目的蛋白。
“转录调节”本文专门指原核细菌细胞中基因转录的调节。
“转录因子”或“转录因子融合蛋白”在本文中含义相同可互换使用，指原核细菌的 转录因子，一般情况下是一个蛋白质，可以是天然的或人工改造的或人为融合的，包 括能识别/结合靶转录单元核苷酸序列中的反应元件的多肽，通过与靶转录单元中反应 元件的结合和相互作用，本身就能或者募集RNA聚合酶其他组分一起调节目的蛋白基 因的转录。转录因子视其组成的不同可分为“转录激活因子”或“转录抑制因子”，二者 简称“转录因子”。
“靶转录单元”指人造的由含反应元件的启动子和目的基因组成的DNA序列（不 是蛋白质），其中反应元件位于启动子序列内部或者位于启动子的-35区的上游或者位 于启动子-10区的下游，目的基因位于启动子下游，彼此可直接相连或操作性（即可隔 开若干个核苷酸）相连。
“反应元件”指转录因子特异性识别/结合的一个或多个顺式DNA基序，不同的转 录因子有与其相对应的不同的反应元件，转录因子包含能与这种DNA基序结合的结 合结构域。当转录因子与其相对应的反应元件特异性结合后，该反应元件即向启动子 传达反应性，转录因子本身就可以或者通过招募RNA聚合酶的其他组分一起抑制或者 激活启动子活性，阻碍或激活下游目的基因转录产生相应的RNA。在本发明中，反应 元件指能够与重组光敏转录因子的第一多肽特异性识别/结合的DNA基序，例如LexA 识别/结合的反应元件为长16bp的DNA基序（序列11）。
“启动子”指启动和指导其下游目的基因转录产生RNA的DNA序列，它是基因表达 不可缺少的重要调控序列。启动子可以是天然基因的启动子或人工修饰的启动子。原核细 菌的启动子是由两段彼此分开且又高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成极为重 要。在转录起始点上游5～10bp处，有一段由6～8个碱基组成，富含A和T的区域，称 为Pribnow盒，又名TATA盒或－10区。来源不同的启动子，Pribnow盒的碱基顺序稍有 变化。在距转录起始位点上游35bp处，有一段由10bp组成的区域，称为-35区。转录时 大肠杆菌RNA聚合酶识别并结合启动子。-35区与RNA聚合酶σ亚基结合，-10区与RNA 聚合酶的核心酶结合，在转录起始位点附近DNA被解旋形成单链，RNA聚合酶使第一和 第二核苷酸形成磷酸二酯键，以后在RNA聚合酶作用下向前推进，形成新生的RNA链。
“载体”、“表达载体”、“基因表达载体”、“重组基因表达载体”或“质粒”在本文中含 义相同可互换使用，指能在原核细菌细胞中表达重组目的蛋白的载体。
“转化”指利用化学方法或者物理方法使外源质粒DNA分子进入原核细菌细胞中。 具体的方法可参见Sambrooka等人(分子克隆实验手册，第二版，冷泉港出版社(1989))， 和其它有关教材。
本发明的光诱导原核细菌基因表达系统中，第一部分的重组光敏转录因子是由两 种或三种功能性多肽片段直接通过肽键串联连接或通过短肽接头串联连接形成的融合 蛋白。在适当波长的光照射下，该融合蛋白能结合于本发明第二部分靶转录单元核苷 酸序列的反应元件，并通过其自身或者募集宿主细胞中RNA聚合酶其他组分，一起协 同作用于启动子区域，从而阻遏或启动靶转录单元中目的蛋白基因的转录与表达。
本文中，“重组光敏转录因子融合蛋白”与“重组光敏转录因子”含义相同，可互换 使用。
本发明的重组光敏转录因子含有第一多肽，该多肽虽能特异性识别所述靶转录单 元核苷酸序列中的反应元件但不能与其结合或结合能力弱，只有在第二多肽的协助下 同质二聚化后方能结合反应元件；该多肽可衍生自任何已知的蛋白质DNA识别/结合 结构域，优选氨基酸序列更短的DNA识别/结合结构域，包括天然的和合成的这种DNA 识别/结合域或其类似物（如保留了甚至增强了结合能力的结合域突变体或截短体）。 可用作本发明的第一多肽选自螺旋-转角-螺旋DNA结合结构域、锌指基序或锌簇DNA 结合结构域、亮氨酸拉链DNA结合结构域、翼状螺旋DNA结合结构域、翼状螺旋- 转角-螺旋DNA结合结构域、螺旋-环-螺旋DNA结合结构域、高迁移率族DNA结合 结构域、B3DNA结合结构域。第一多肽优选包括但不限于：LexA蛋白的DNA识别/ 结合域(序列2)、λ噬菌体cI阻遏蛋白cI蛋白的DNA识别/结合域(序列4)、Lac阻遏 蛋白LacI的DNA识别/结合域(序列6)、酵母Gal4DNA识别/结合结构域(序列8)、四 环素组合蛋白TetR的DNA识别/结合域(序列10)等，及其截短体或/和氨基酸序列同 源性80%-99%的突变体。更优选LexA的DNA识别/结合域和cI的DNA识别/结合域。
LexA蛋白是存在于大肠杆菌细胞内的一种转录抑制因子，能调控细胞内20多种 基因的转录，同源二聚化后的LexA二聚体能够识别/结合启动子中的反应元件16个碱 基的CTGT(N)8ACAG回文结构，从而阻止RNA聚合酶对后面基因的转录。LexA含 有202个氨基酸，其中1-87位氨基酸是其DNA识别/结合结构域，88-202位氨基酸是 二聚化结构域，只有同源二聚化的LexA才能特异性结合相应的反应元件，LexA单体 蛋白则不能。正常情况下大肠杆菌细胞中的LexA是二聚体形式存在，当细胞受到内 部或外部SOS信号刺激时，二聚化的LexA被细胞内某些酶（如RecA）切断分开并从 反应元件上解离，使得原来被LexA抑制的基因激活，大肠杆菌启动针对SOS的修复 功能[12,13][Schnarr,M.等,Biochimie,1991.73(4):p.423-31，Little,J.W.等，Cell, 1982.29(1):p.11-22.]。基于LexA的双杂交系统也被用于研究基因表达与蛋白质相 互作用。例如，Clonetech公司生产的酵母双杂交系统（MATCHMAKER LexA Two-Hybrid System）就是基于此系统。
cI蛋白是λ噬菌体cI基因编码的一种转录抑制因子，它可以阻止λ左、λ右两个 早期起动子的转录导致不能产生复制及细胞裂解的蛋白。cI蛋白含有236个氨基酸， 其N端为DNA识别/结合域（1-102位氨基酸）和C端为二聚化域（132-236位氨基酸）。 cI蛋白同源二聚体识别/结合PL和PR两个操纵子序列上，每个操纵子各含有cI三个识 别结合位点，分为PL的OL1、OL2和OL3以及PR的OR1、OR2和OR3。cI与 OR1的结合能力相对强些，OR1的保守DNA序列为TACCTCTGGCGGTGATA，单体 cI蛋白几乎无这种结合能力[Burz,D.S.等,Biochemistry33(28),8399-8405(1994)，Hu, J.C.等,Science250(4986),1400-1403(1990)][14,15]。
Lac阻遏蛋白LacI能特异性识别/结合大肠杆菌乳糖操纵子系统，进而调节相关 基因的转录与表达。LacI蛋白包含N端的DNA识别/结合域（1-62位氨基酸）、核心 蛋白域（63-340位氨基酸）和C端四聚化域（341-357位氨基酸）。其特异性识别/结 合的DNA保守序列为GAATTGTGAGCGCTCACAATT，只有二聚化或者四聚化的LacI 才能与之结合，单体LacI蛋白几乎不能结合[Lewis,M.等,Science271(5253), 1247-1254(1996)，Friedman,A.M.等,Science,1995.268(5218):p.1721-7.][16,17]。
Gal4是酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌的转录激活蛋白（其编码基因写 成GAL4），能识别/结合基因启动子的上游反应元件-激活基序UASG[长17bp的一段 序列5′-CGGRNNRCYNYNYNCNCCG-3′（R表示嘌呤，Y表示嘧啶，N表示脱氧核苷 酸）]。它可介导半乳糖诱导的基因，如GAL1,GAL2,GAL7,GAL10和MEL1转录 和表达。Gal4的N末端为DNA识别/结合域，C末端为转录激活结构域（AD）。此 DNA识别/结合域含一个锌簇（Zinc cluster），即Zn(2)-Cys(6)双核簇，需形成同质二 聚体才能结合反应元件发挥其作用[Kraulis,P.J.等,Nature,1992.356(6368):p. 448-50.，Marmorstein,R.等,Nature,1992.356(6368):p.408-14.][18,19]。基于 GAL4/UAS的双杂交系统是用于研究基因表达的一种有效工具。例如，普洛麦格公司 （Promega）公司生产的哺乳动物双杂交系统（CheckMateTMMammalian Two-Hybrid System）就采用了此GAL4/UAS系统。
TetR阻遏蛋白是存在于很多革兰阴性菌中的一种转录因子，通过结合特定DNA 基序抑制相关基因的转录。TetR蛋白的N端为DNA识别/结合域和C端为二聚化域。 单体TetR蛋白可形成同质二聚体而识别/结合含有特定DNA序列的操纵子上，单体 TetR几乎无结合能力[Wissmann,A.等.,EMBO J10(13),4145-4152(1991)，Ramos,J.L. 等.,Microbiol Mol Biol Rev69(2),326-356(2005)][20,21]。
在本发明一优选实施方式中，第一多肽为LexA蛋白的1-87位氨基酸，即其DNA 识别/结合域(其核酸和蛋白质序列分别为序列1和序列2)，其单独不能结合反应元件 （序列11）。在另一优选实施方式中，第一多肽为cI蛋白的1-102位氨基酸，即其 DNA识别/结合域的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列3和序列4)，其单独不能 结合反应元件(序列12)。在另一优选实施方式中，第一多肽为LacI蛋白的1-62位氨基 酸，即其DNA识别/结合域的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列5和序列6)，其 单独也不能结合反应元件（序列13）。在另一优选实施方式中，第一多肽为Gal4蛋 白的1-65位氨基酸，即其DNA识别/结合域的截短体(其核酸和蛋白质序列分别为序列 7和序列8)，其单独也不能结合反应元件（序列14）。在另一优选实施方式中，第一 多肽为TetR蛋白的1-63位氨基酸，即其DNA识别/结合结的截短体(其核酸和蛋白质 序列分别为序列9和序列10)，其单独也不能结合反应元件（序列15）。
本发明的光诱导基因表达系统中，重组光敏转录因子中的第二多肽是光敏多肽， 来自以黄素类(FMN或FAD)为生色团的光敏结构域。如含有光-氧-电压（LOV）结构 域的光敏蛋白、类似光裂解酶的隐花色素（photolyase-like cryptochromes）、利用FAD 的蓝光蛋白（blue light using FAD,BLUF）。优选含LOV结构域的光敏蛋白，经适当 波长光照射后，第二多肽的二聚化能力发生改变，使转录因子的二聚化能力发生变化， 二聚化的转录因子结合于相对应的反应元件，从而直接调节目的基因的表达水平。本 发明包括但不限于以下几种优选光敏蛋白或其功能活性截短体。
一个优选的第二多肽是粗糙链孢霉菌的VIVID(VVD)蛋白的光敏结构域及其突变 体。VVD是存在于粗糙链孢霉菌（Neurospora crassa）细胞内参与蓝光调控细胞信号 传导通路的一种光敏蛋白质。在蓝光照射下它能与黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD，Flavin Adenine Dinucleotide）发生蛋白分子间反应形成二聚体。全长VVD蛋白含有186个氨 基酸，只含一个对光敏感的LOV结构域。研究表明VVD蛋白缺失了N端36个氨基 酸的截短体蛋白(VVD36)稳定性比全长蛋白更好，而蓝光照射后形成的VVD36二聚 体不光照恢复其单体形式的半衰期为18000s，含点突变C71V的VIVID36二聚化能力 更强[Zoltowski,B.D.等，Biochemistry,2008.47(27):p.7012-9，Schwerdtfeger,C. 等，EMBO J,2003.22(18):p.4846-55.][23,24]。在本发明一优选实施方式中，第二 多肽是含一个点突变的删除前1-36个氨基酸的VVD(C71V）、VVD(N56K)、VVD (Y50W)突变蛋白(核酸序列分别为16、18、20，氨基酸序列分别为17、19、21)。在本 发明一个更优选实施方式中，第二多肽是含二个点突变的删除前1-36个氨基酸VVD （N56K C71V）、VVD（I52A C71V）、VVD（I52S C71V）和VVD（N56R C71V） 突变蛋白(其核酸序列分别为22、24、26、28，氨基酸序列分别为23、25、27和29)。
第二个优选的第二多肽是燕麦（Avena sativa）光敏色素1基因的LOV2结构域(简 写为AsLOV2，其核苷酸和氨基酸序列分别为30、31)[Peter,E.,B.等,Nat Commun,2010. 1(8):122，Halavaty,A.S.等，Biochemistry,2007.46(49):p.14001-9.][25,26]。燕 麦细胞光敏色素1的N端为LOV1和LOV2光氧电压（LOV）结构域，在蓝光照射下 均能与黄素单核苷酸（flavin mononucleotide，FMN）结合生成一种加成产物。本发明 将燕麦光敏色素1的LOV2结构域连接于第一多肽，成功导致可用光照调控转录因子 的第一多肽与对相应的反应元件的结合能力。本发明含有AsLOV2第二多肽的转录因 子LA，在黑暗时可以结合其对应的反应元件导致目的基因表达，而在光照下这种结合 减弱导致目的基因表达水平上调。
第三个优选的第二多肽是无隔藻（Stramenopile algae Vaucheria frigida）金色素1 （aureochrome1）蛋白C端的LOV结构域(简写为AuLOV，其核酸和蛋白质序列分别 为序列32和序列33)[Takahashi,F.等,Proc Natl Acad Sci U S A,2007.104(49): 19625-19630][27]。本发明含有AuLOV第二多肽的重组转录因子LAu光照后二聚化能 力增强使目的基因的表达水平下调。
以上所述第二多肽中，VVD和AuLOV用适当波长光照射可使由其构成的重组光 敏转录因子二聚化增强，导致其结合到反应元件上，从而抑制下游基因的转录；而 AsLOV2构成的重组光敏转录因子，在黑暗时二聚化而结合反应元件，从而抑制下游 基因的转录。
对来自光敏蛋白的6种不同的LOV结构域用Accelry Discovery Studio2.1进行同 源性分析，这几种LOV结构域分别来自VIVID(Nc VVD)、白领-1（Nc Wc1）、 FKF1(At FKF1)、金色素1（Vf Aureo1LOV）、燕麦向光素1（As phot LOV1和 As phot LOV2）。结果显示，这几种蛋白完全相同的氨基酸约为15%，具有相似性的 序列约为36%（图36）。
本发明的光诱导基因表达系统中，重组光敏转录因子还可包括第三多肽，该多肽 可以招募RNA聚合酶其他组分。可用作本发明的第三多肽包括但不限于：来自大肠杆 菌的ω因子结构域和α因子结构域，这两种结构域在先前的大肠杆菌单杂交系统中已 广泛被人们采用[Dove,S.L.等，1998.12(5):p.745-54，Dove,S.L.等,Nature,1997. 386(6625):p.627-30.][28,29]。第三多肽可与第一、第二多肽直接或通过接头肽相连。
如上所述，重组光敏转录因子所含的两种或三种多肽之间可以有多种选择，将两 种或者三种多肽连接成融合蛋白又可以有多种组合选择，本发明优选具有良好活性的 两种或者三种多肽的功能结构域片段制备尽可能短的重组转录因子融合蛋白，通过在 原核细菌细胞中选择对目的基因的表达调控效果好的，即光照和黑暗时导致目的基因 表达量差异大的该光敏转录因子，以调节目的基因的表达，但不论何种选择与组合， 只要能实现本发明所设想的光调控基因表达性能的的重组光敏转录因子，各种组合都 包含在本发明的范围内。
本发明的原核细菌光诱导基因表达系统中，第二部分靶转录单元由转录因子特异 性识别/结合的启动子-待转录核苷酸序列组成，或由启动子-反应元件-待转录核苷酸序 列组成，或由反应元件-启动子-待转录核苷酸序列组成。其中启动子或启动子-反应元 件或反应元件-启动子的核苷酸序列视不同实施方式所选重组光敏转录因子的第一多 肽不同而不同。换言之，必须根据所选择的第一多肽来选择与其相对应的启动子或者 启动子-反应元件或者反应元件-启动子序列。例如，第一多肽为LexA蛋白的DNA识 别/结合域时，其对应的反应元件为“序列11”；第一多肽为cI蛋白的DNA识别/结合 域时，其对应的反应元件为“序列12”基序；第一多肽为LacI蛋白的DNA识别/结合域 时，其对应的反应元件为“序列13”基序；第一多肽为Gal4蛋白的DNA识别/结合结构 域时，其对应的反应元件为“序列14”基序；第一多肽为TetR蛋白的DNA识别/结合域 时，其对应的反应元件为“序列15”基序。
本发明中与光敏转录因子相对应的反应元件一般是包含在启动子核苷酸序列内 部，或者位于启动子的-10区下游，光敏转录因子与之结合后通过阻止RNA聚合酶与 启动子区域的结合而下调下游目的基因的转录。在本发明具体的实施方式中，启动子 是大肠杆菌colE启动子、sulA启动子、recA启动子、umuDC启动子、λ噬菌体O12 启动子、噬菌体T7启动子和枯草芽孢杆菌的grac启动子（核酸序列分别为34、35、 36、37、38、39、40）。另外，反应元件也可以位于启动子-35区的上游，通过光敏转 录因子的第三多肽招募RNA聚合酶的其他组分来启动下游基因的转录。分析相关文 献，这类启动子包括但不限于lac最小启动子（核酸序列为41），其中上游反应元件 的个数可以是1－5个或者更多。在本发明的实施方式中，启动子以选择大肠杆菌lac 最小启动子为佳。
本领域技术人员知道，所谓“操作性连接”指反应元件与启动子之间或多个反应元 件之间不是直接相连而可以隔开若干个核苷酸，只要仍能协同作用即可。
本发明靶转录单元启动子下游是待转录的核苷酸序列，指编码目的蛋白的核苷酸 序列。如上所述，目的蛋白可以是目前已知和将来发现的任何有用的蛋白。为了验证 本发明系统的效果和便于检测，在本发明的实施例中，采用了示范性的报告蛋白：红 色荧光蛋白mCherry（其核酸和氨基酸序列分别为序列42和序列43）、β-半乳糖苷酶 （LacZ，其核酸和氨基酸序列分别为序列44和序列45）、Ero1巯基氧化酶（其核酸 和氨基酸序列分别为序列46和序列47）作为目的蛋白，但本发明的目的蛋白不限于 这些报告蛋白。
可用标准重组DNA技术将本发明光诱导基因表达系统的第一部分和第二部分构 建在一个原核细菌表达载体中或分别构建在二个原核细菌表达载体中。可用标准技术 将这种表达载体引入各种原核细菌细胞中以表达所需目的蛋白。
本发明提供含有所述两种或者三种多肽各种组合的多种重组光敏转录因子基因 的原核细菌表达载体。在本发明一优选实施方式中，提供含不同LexA(1-87)与 VVD36(C71V)间接头肽的重组光敏转录因子LexA(1-87)-VVD36(C71V)基因原核细菌 表达载体pLV-L0、pLV-L1、pLV-L2、pLV-L3、pLV-L4、pLV-L5、pLV-L6、pLV-L7、 pALV-L0、pALV-L1、pALV-L2、pALV-L3、pALV-L4、pALV-L5、pALV-L6、ApLV-L7 （重组光敏转录因子简写为LV-L0、LV-L1、LV-L2、LV-L3、LV-L4、LV-L5、LV-L6、 LV-L7，核苷酸序列分别为48、50、52、54、56、58、60、62，氨基酸序列分别为49、 51、53、55、57、59、61、63）。在另一优选实施方式中，提供其中VVD含有单个 点突变的重组光敏转录因子LexA(1-87)-VVD基因的原核细菌表达载体pALV –L0(Y50W)、pALV-L0(N56K)，其中括弧中为VVD中的突变位点，这两种重组光敏 转录因子的编码核酸序列分别为64、66，氨基酸序列分别为65、67。在另一优选的实 施方式中，提供其中VVD含有双突变点的重组光敏转录因子LexA(1-87)-VVD基因的 原核细菌表达载体pALV-L0(N56K C71V)、pALV-L0(I52A C71V)、pALV-L0(IS2S C71V)和pALV-L0(N56R C71V)，这四种重组光敏转录因子的核苷酸序列为68、70、 72、74，氨基酸序列分别为69、71、73、75。在另一实施方式中，提供含重组光敏转 录因子LexA(1-87)-AsLOV2（简写为LA，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列76和 序列77）基因的原核细菌表达载体pALA。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录 因子LexA(1-87)-AuLOV（简写为LAu，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列78和序 列79）基因的原核细菌表达载体pALAu。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因 子cI(1-102)-VVD36(C71V)（简写为CV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列80和 序列81）基因的原核细菌表达载体pACV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录 因子LacI(1-62)-VVD36(C71V)（简写为LaV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列82 和序列83）基因的原核细菌表达载体pALaV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转 录因子Gal4(1-65)-VVD36(C71V)（简写为GV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列 84和序列85）基因的原核细菌表达载体pAGV。在另一实施方式中，提供含重组光敏 转录因子TetR(1-63)-VVD36(C71V)（简写为TV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序 列86和序列87）基因的原核细菌表达载体pATV。在另一实施方式中，提供含重组光 敏转录因子LexA(1-87)-VVD36(C71V)-α（简写为LVα，其编码核酸和氨基酸序列分别 为序列88和序列89）基因的原核细菌表达载体pALVα。在另一实施方式中，提供含 重组光敏转录因子ω-LexA(1-87)-VVD36(C71V)（简写为ωLV，其编码核酸和氨基酸 序列分别为序列90和序列91）基因的原核细菌表达载体pAωLV。在另一实施方式中， 提供含重组光敏转录因子cI(1-102)-VVD36(C71V)-α（简写为CVα，其编码核酸和氨基 酸序列分别为序列92和序列93）基因的原核细菌表达载体pALVα。在另一实施方式 中，提供含重组光敏转录因子ω-cI(1-102)-VVD36(C71V)（简写为ωCV，其编码核酸 和氨基酸序列分别为序列94和序列95）基因的原核细菌表达载体pAωCV。在另一实 施方式中，提供含重组光敏转录因子LacI(1-62)-VVD36(C71V)-α（简写为LaVα，其编 码核酸和氨基酸序列分别为序列96和序列97）基因的原核细菌表达载体pALaVα。在 另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子ω-LacI(1-62)-VVD36(C71V)（简写为ωLaV， 其编码核酸和氨基酸序列分别为序列98和序列99）基因的原核细菌表达载体 pAωLaV。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子Gal4(1-65)-VVD36(C71V)-α （简写为GVα，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列100和序列101）基因的原核细 菌表达载体pAGVα。在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子 ω-Gal4(1-65)-VVD36(C71V)（简写为ωGV，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列102 和序列103）基因的原核细菌表达载体pAωGV。在另一实施方式中，提供含重组光敏 转录因子TetR(1-63)-VVD36(C71V)-α（简写为TVα，其编码核酸和氨基酸序列分别为 序列104和序列105）基因的原核细菌表达载体pATVα。在另一实施方式中，提供含 重组光敏转录因子ω-TetR(1-63)-VVD36(C71V)（简写为ωTV，其编码核酸和氨基酸序 列分别为序列106和序列107）基因的原核细菌表达载体pAωTV。在另一实施方式中， 提供含重组光敏转录因子LV-L0基因以及靶转录单元colE-mCherry的原核细菌表达载 体pD-colE-mCherry-Amp-LV(其中ter-colE-mCherry-Amp-LV-ter核苷酸序列为108)。 在另一实施方式中，提供含重组光敏转录因子LacI(1-62,wt)-VVD36(C71V)基因（简写 为LaV(wt)，其编码核酸和氨基酸序列分别为序列109和序列110）以及靶转录单元 Pgrac-mCherry的原核细菌表达载pHT01-LaV(wt)-PgracmCherry（其中 LaV(wt)-Pgrac-mCherry核苷酸序列为111）。
本发明提供含待转录核苷酸序列空缺的靶转录单元的原核细菌表达载体，待转录 的核苷酸序列空缺是让用户可以自行选择所需的待转录的核苷酸序列，例如目的蛋白 的编码基因，用标准的重组DNA技术将其插入本发明的这种表达载体中，与上面所 述含重组光敏转录因子基因的表达载体共同转化原核细菌细胞，来调节待转录核苷酸 序列（基因）的表达。在本发明的一些实施方式中，原核细菌表达载体的靶转录单元 中空缺的待转录核苷酸序列分别是：LexA对应的colE-待转录核苷酸序列、LexA对应 的sulA-待转录核苷酸序列、LexA对应的RecA-待转录核苷酸序列、LexA对应的 umuDC-待转录核苷酸序列、LexA对应的LexA反应元件-lac最小启动子-待转录核苷 酸序列、cI对应的PλO12-待转录核苷酸序列、cI对应的cI反应元件O12-lac最小启动 子-待转录核苷酸序列、lacI对应的T7-lacI反应元件-待转录核苷酸序列、lacI对应的 lacI反应元件-lac最小启动子-待转录核苷酸序列、Gal4对应的T7-Gal4反应元件-待转 录核苷酸序列、Gal4对应的Gal4反应元件-lac最小启动子-待转录核苷酸序列、TetR 对应的T7-TetR反应元件-待转录核苷酸序列、TetR对应的TetR反应元件-lac最小启 动子-待转录核苷酸序列。
本发明也提供分别转化了各种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体或者 基因组上整合了各种重组光敏转录因子表达框的原核细菌菌株，同时提供含有启动子 或启动子-反应元件或反应元件-启动子而待转录核苷酸序列空缺的原核细菌表达载 体。用户可用标准重组DNA技术将自行选择的待转录核苷酸序列（目的蛋白基因） 插入该表达载体中，然后用该重新构建的载体转化已转化了各种重组光敏转录因子基 因的原核细菌表达载体或者基因组上已整合了各种重组光敏转录因子表达框的原核细 菌菌株，并培养这种原核细菌细胞表达他们所需的目的基因，或供他们研究如何调节 目的基因的表达。
本发明还提供装有各种表达载体或已转化了这种载体或者基因组上整合了各种 重组光转录因子表达框的原核细菌细胞的试剂盒。在一个实施方式中，该试剂盒中一 些容器分别装有含一种或多种重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体。在另一个 实施方式中，该试剂盒中的一些容器分别装有含一种或多种重组光敏转录因子基因的 原核细菌表达载体，另一些容器分别装有含靶转录单元（其中启动子-待转录核苷酸序 列空缺或启动子-反应元件-待转录核苷酸序列空缺或反应元件-启动子-待转录核苷酸 序列空缺）的原核细菌表达载体。在还有一个实施方式中，该试剂盒中一些容器装有 已转化了含重组光敏转录因子基因的原核细菌表达载体或者基因组上已整合了各种重 组光敏转录因子表达框的原核细菌细胞，另一些容器装有启动子-待转录核苷酸序列空 缺或者启动子-反应元件-待转录核苷酸序列空缺或者反应元件-启动子-待转录核苷酸 序列空缺的原核细菌表达载体。本发明的试剂盒还可以包含相应的光照控制设备，例 如LED灯及其调控装置。所有试剂盒都装有相应的说明书，以说明盒中的各成分、使 用目的和使用方法，并提供有关的参考文献目录。
本发明还包括光诱导基因表达系统在原核细菌细胞中调控基因表达的方法，包括 步骤：
a）将所述原核细菌光诱导基因表达系统构建在原核细菌表达载体中；
b）引入含被调控基因的原核细菌细胞；和
c）光照诱导所述原核细菌细胞，使所述原核细菌细胞中的被调控的核苷酸进行表 达。
光照诱导所述原核细菌细胞的方法包括光源的选择和光源的使用。光源非限制地 包括LED灯、白炽灯、荧光灯、激光。在本发明的一个实施方式中，光源选用蓝色 LED(460-470nm)。光照方法包括光照量、光照强度、光照时间、光照频率以及用扫描、 投影、光模具等方法在空间上控制目的基因的表达也包含在本发明范围中。在本发明 的一个实施方式中，光照强度为0-0.125mW/cm2不等；在另一个实施方式中，用打印 的投影片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因的表达水平；在另一 个实施方式中，用中性灰度片作为光模具，在空间上调节不同位置的细胞的目的基因 的表达水平。
附图简要说明
图1是重叠PCR的示意图。
图2是同源重组连接示意图。
图3为反向PCR的原理。
图4为以T7启动子进行表达的含不同接头肽的重组光敏转录因子原核细菌表达 载体构建示意图。上方为不同接头肽重组光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环 状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为pCDFDuet1。
图5为以Amp启动子进行表达的含不同接头肽的重组光敏转录因子原核细菌表 达载体构建示意图。上方为不同接头肽重组光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为 环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为pCDFDuet1。
图6为含以不同VVD突变体、AsLOV2和AuLOV为第二多肽的光敏转录因子原 核表达载体的构建示意图。上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的 表达载体的示意图。表达载体的骨架为pCDFDuet1。
图7为含以cI、LacI、Gal4、和TetR为第一多肽的光敏转录因子原核表达载体 的构建示意图。上方为光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示 意图。表达载体的骨架为pCDFDuet1。
图8为含以ω因子为第三多肽的重组光敏转录因子原核表达载体的构建示意图。 上方为光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体 的骨架为pCDFDuet1。
图9为含以α因子为第三多肽的重组光敏转录因子原核表达载体的构建示意图。 上方为各光敏转录因子融合蛋白的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载 体的骨架为pCDFDuet1。
图10为含有LexA、cI、LacI、Gal4和TetR相对应反应元件的靶转录单元的原核 细菌表达载体的构建示意图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体 的示意图。表达载体的骨架为pRSETb。
图11为以ω因子或α因子为第三多肽的重组光敏转录因子所对应的含有LexA、 cI、LacI、Gal4和TetR相对应反应元件的靶转录单元的原核细菌表达载体的构建示意 图。上方为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨 架为pRSETb。
图12为以cI阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载体的构建示意图。上方 为各靶转录单元的示意图，下方为环状的表达载体的示意图。表达载体的骨架为 pRSETb。
图13为以T7启动子表达不同接头肽的光敏转录因子的JM109(DE3,sulA-,LexA-) 细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry 相对表达水平。
图14为以Amp启动子表达不同接头肽的光敏转录因子的JM109(DE3,sulA-,LexA-) 细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry 相对表达水平。
图15为光敏转录因子LV-L0对LacZ表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称， 纵轴为LacZ相对表达水平。
图16为光敏转录因子LV-L0对其他三种含LexA相对应反应元件的原核表达载 体中mCherry表达水平的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达 水平。
图17为在表达以几种VVD突变体的第二多肽的转录因子的 JM109(DE3,sulA-,LexA-)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的 质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。
图18为在表达以cI、LacI、Gal4、和TetR为第一多肽的转录因子的 JM109(DE3,sulA-,LexA-)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的 质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。
图19为在表达以AsLOV2和AuLOV第二多肽的转录因子的 JM109(DE3,sulA-,LexA-)细胞中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的 质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。
图20为在表达以ω因子为第三多肽的转录因子的JM109(DE3,suM-,LexA-)细胞 中，光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry 相对表达水平。
图21为在表达以α因子为第三多肽的转录因子的JM109(DE3,sulA-,LexA-)细胞中， 光照对mCherry的表达水平的调节。横轴为共转染的质粒名称，纵轴为mCherry相对 表达水平。
图22为光敏转录因子LV-L0在不同温度条件下对mCherry表达水平的调节。横 轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。
图23为光敏转录因子LV-L0对以cI阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载 体中mCherry表达量的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水 平。
图24为含光敏转录因子LV-L0和靶转录单元的单表达载体在光照前后mCherry 表达量的差异。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表达水平。
图25为了检测含光敏转录因子LaV(wt)和靶转录单元的原核表达质粒在枯草芽孢 杆菌细胞中对mCherry表达量的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相 对表达水平。
图26为检测JM109(DE3,sulA-，LexA∷Amp-LV-L0)菌株自身表达光敏转录因子 LV-L0对mCherry表达量的调节。横轴为共转化的质粒名称，纵轴为mCherry相对表 达水平。
图27为表达重组光敏转录因子LV-L0的细胞中，光照诱导的目的基因表达的时 间动力学过程和可逆性过程。横轴为光照时间，表示样品在该时间点由光照转移到黑 暗条件，纵轴为mCherry的表达水平。
图28为表达重组光敏转录因子LV-L0的细胞中，光照诱导的目的基因表达的时 间动力学过程和可逆性过程。横轴为光照时间，表示样品在该时间点由黑暗转移到光 照条件，纵轴为mCherry的表达水平。
图29为在表达重组光敏转录因子LV-L0的细胞中，不同的光照强度对目的基因 表达水平的调节。横轴为光照强度，纵轴为mCherry的相对表达水平。
图30为用打印图案投影片给表达重组光敏转录因子LV-L0细胞“拍照”得到的 “Stop”图案。左图为贴有培养板底部的投影片的照片，右图为克隆长出来后对平板进 行成像的荧光图像。
图31为表达了重组光敏转录因子LV-L0对细菌移动的调节的白光成像结果，左 边为黑暗条件下，右边是光照条件下的，1、2、3代表不同的共转化质粒。
图32为表达了重组光敏转录因子LV-L0对细菌细胞裂解的调节结果。 横轴为共转化质粒名称，纵轴为细胞的裂解效率。
图33为AKTA purifier的离子交换柱洗脱峰图。横轴为洗脱管号，纵轴为紫外吸 收值。
图34为离子交换柱洗脱后部分管蛋白的12%SDS-PAGE蛋白电泳图。
图35为合并后最终蛋白溶液的12%SDS-PAGE蛋白电泳图。
图36为6种来自光敏蛋白的不同LOV结构域的同源性分析，其中黑色表示100% 相同的氨基酸序列，深灰色表相似性较高的序列，浅灰色表示相似性中等的序列。
具体实施方式
以下用实施例对本发明作进一步阐述。这些实施例仅仅用于举例说明，而不对 本发明的范围构成任何限制。实施例中主要采用常规的基因工程分子生物学克隆方 法，这些方法是本领域普通技术人员所熟知的，例如：简·罗斯凯姆斯等的《分子生 物学实验参考手册》和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著,黄培堂等译：《分子克隆实 验指南》（第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京）中的有关章节。本领域 普通技术人员按照以下实施例，不难根据具体情况略作修改和变换而成功实施本发 明，这些修改和变换均落在本申请权利要求的范围内。
实施例中所用的pCDFDuet1质粒载体购自Novagen公司，pRSETb、pBAD/His A 质粒载体购自Invitrogen公司，pKD3、pKD4、pCP20、pKD46由华东理工大学鲍杰老 师实验室慷慨馈赠。所有用于PCR的引物均由上海杰瑞生物工程技术有限公司合成、 纯化和经质谱法鉴定正确。实施例中构建的表达质粒都经过序列测定，序列测定由华 大基因公司和杰李测序公司完成。各实施例所用的Taq DNA聚合酶购自东盛生物，pfu DNA聚合酶购自天根生化科技(北京)有限公司，PrimeSTAR DNA聚合酶购自TaKaRa 公司，三种聚合酶购买时都附带赠送对应聚合酶缓冲液和dNTP。BamHI、BglII、HindIII、 NdeI、XhoI、SacI、EcoRI、SpeI等限制性内切酶、T4连接酶、T4磷酸化酶（T4PNK） 购自Fermentas公司，购买时附带有相对应的缓冲液等。实施例中所用的CloneEZ PCR 克隆试剂盒（含同源重组酶）购自南京金斯瑞生物科技有限公司（原金思特科技（南 京）有限公司）。除非特别声明，无机盐类化学试剂均购自国药集团上海化学试剂公 司。卡那霉素（Kanamycin）购自Ameresco公司；氨苄青霉素（Amp）购自Ameresco 公司；链霉素购自Ameresco公司；ONPG购自Ameresco公司；384孔发光检测白板、 384孔荧光检测黑板购自Grenier公司。
实施例中所用的DNA纯化试剂盒购自BBI公司（加拿大），普通质粒小抽试剂 盒购自天根生化科技(北京)有限公司。克隆菌株Mach1购自Invitrogen公司。JM109(DE3) 表达菌株购自Promega公司，BL21(DE3)菌株购自Novagen公司。
实施例中用到的主要仪器：Biotek Synergy2多功能酶标仪（美国Bio-Tek公司）， X-15R高速冷冻离心机（美国Beckman公司），Microfuge22R台式高速冷冻离心机（美 国Beckman公司），PCR扩增仪（德国Biometra公司），活体成像系统（美国Kodak 公司），光度计（日本和光公司），核酸电泳仪（申能博彩公司）。
缩写词意义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“s”指秒，“d”指天,“μL”指微升，“ml” 指毫升，“L“指升,“bp”指碱基对，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔。
20种氨基酸及简称
实施例中用到的常规分子生物学方法
（一）聚合酶链式反应（PCR）：
1.目的片段扩增PCR：
扩增步骤（bp表示扩增片段的核苷酸数量）：
2.长片段（＞2500bp）扩增PCR：
扩增步骤（bp表示扩增片段的核苷酸数量）：
或者
（二）核酸内切酶酶切反应：
1.对质粒载体进行双酶切的体系（n代表使体系达到总体积所需要加入的灭 菌超纯水μL量）：
2.对PCR产物片段进行双酶切的体系（n含义同上）：
3.将双酶切后PCR产物片段连接入双酶切后的质粒载体成环的体系：
注：PCR产物片段与载体双酶切产物的质量比大致在2:1—6:1之间。
（三）DNA片段5’端磷酸化反应然后自身环化反应：
从微生物中抽提出的质粒或者基因组末端都含有磷酸基团，而PCR产物没有，故 需对PCR产物的5’端碱基进行磷酸基团加成反应，只有末端含有磷酸基团DNA分子 才能发生连接反应。自身环化连接反应指线性化载体的3’端和5’端连接反应。
T4PNK为T4多聚核苷酸激酶的简写，用于对DNA分子的5’端磷酸基团的加成 反应。使5’端磷酸化的DNA片段产物自身环化的反应体系：
(四)重叠PCR
重叠PCR是常用的将两段不同或相同的基因连接起来的方法。例如图1，将基因 AD和基因BC连接起来，首先设计两对引物A、D和C、B，分别用来扩增基因AD 和BC，在引物D和引物C的5’端含有一定长度的互补序列。第一轮PCR得到的扩增 产物AD和BC经过回收后作为第二轮PCR的模板。
第二轮按常规PCR流程扩增10轮，PCR体系为：
第二轮PCR后加入引物A和引物B，再继续扩增30轮即可得到AD和BC连接了的 序列。
（五）反向PCR
反向PCR是下述实施例中用于定点突变、截短突变、插入突变所用到的一种技术。 其基本原理参考Takara公司的MutaBEST试剂盒的实验流程。如图2所示，在对应的 变异部位设计反向PCR引物，其中一条引物的5’端包含变异的核苷酸序列。扩增后的 产物经过胶回收纯化后，进行5’端磷酸化反应然后自身环化反应，转化入感受态细胞。
（六）感受态细胞的制备与转化
感受态细胞的制备：
1.挑取单菌落(如Mach1)接种于5mL LB培养基中，37℃摇床过夜。
2.取0.5-1ml过夜培养的菌液转种到50mL LB培养基中，37℃，220rpm/min培养 3至5h，直到OD600达到0.5。
3.冰浴预冷细胞2h。
4.4℃4000rpm/min离心10min。
5.弃上清，用5ml预冷的重悬缓冲液悬浮细胞，待均匀后再加入重悬缓冲液至终 体积为50mL。
6.冰浴45min。
7.4℃4000rpm/min离心10min，用5mL冰预冷的储存缓冲液重悬细菌。
8.每个EP管中放100μL菌液，-80℃或液氮冻存。
重悬缓冲液:CaCl2(100mM)、MgCl2(70mM)、NaAc(40mM)
储存缓冲液:0.5mL DMSO、1.9mL80%甘油、1mL10×CaCl2(1M)、1mL10×MgCl2(700mM)、1mL10×NaAc(400mM)、4.6mL ddH2O
转化：
1.取100μl感受态细胞于冰浴上融化。
2.加入适当体积的连接产物，轻轻吹打混匀，冰浴30min。通常加入的连接产物 的体积少于感受态细胞体积的1/10。
3.将菌液放入42℃水浴中热激90秒，迅速转移至冰浴中放置5min。
4.加入500μl LB，于37℃恒温摇床上200转培养1h。
5.将菌液4000rpm/min离心3min，留200μl上清将菌体吹匀，均匀涂布于含适当 抗生素的琼脂平板表面，平板于37℃恒温培养箱内倒置过夜。
（七）大肠杆菌表达的mCherry荧光蛋白的检测
从转化大肠杆菌板上分别挑取相应的单克隆接种48孔板中培养，每孔的LB为 700μl，每个样品重复6个，30度培养过夜。按照1:200稀释到另一块每孔含700μl 新鲜LB的48孔板中。如无特殊指明，培养的条件都是30℃，摇床的转速为280rpm， 光照强度为0.125mW/cm2。培养18h后，4000rpm20min离心收菌。弃去上清培养基， 每孔加入200μl PBS溶液，利用振荡器将菌完全重悬。然后每孔吸取5μl到96孔酶标 板中，加入115μl PBS充分混匀，利用Bio-tek公司的多功能酶标仪中读取OD600的 值。然后根据读取的OD600值将每孔的OD600调成一致，为0.5。调整好之后从每孔 中吸取100μl到96孔荧光测定板中，利用Bio-tek公司的多功能酶标仪中读取 Ex590/20，Em645/40的荧光值。黑暗的样品则使用铝箔纸包起来培养，其他处理方法 一致。
（八）β-半乳糖苷酶（LacZ）活性的检测
从转化大肠杆菌板上分别挑取相应的单克隆接种48孔板中培养，每孔的LB为 700μl，每个样品重复6个，30℃培养过夜。按照1:200稀释到两块每孔含700μl新鲜 LB的48孔板中，分别于30℃光照和黑暗培养，蓝光照射的光强为0.125mW/cm2。培 养18h后，每孔取5μl菌液于96孔白板，并加入20μl透膜溶液使得细胞裂解，微孔 板震荡器上震荡1min后放入37℃培养箱恒温静置10min。每孔加入150μl底物溶液进 行反应，震荡30s后开始酶标仪测定OD420动力学曲线。最终得到的曲线的斜率和 LacZ的酶活是成正比的。
LacZ酶活检测溶液配方：
底物溶液：Na2HPO460mM，NaH2PO440mM，ONPG1mg/ml，β-巯基乙醇 2.7μl/ml
透膜溶液：Na2HPO4 100mM，KCl 20nM，MgSO4 2mM，CTAB 0.8mg/ml， 脱氧胆酸钠0.4mg/ml，β-巯基乙醇5.4μl/ml
(九)大肠杆菌基因组敲除
1.将pKD46质粒转化将要进行基因敲出的目标菌株中，在含氨苄抗性的培养皿上 30℃培养过夜。
2.从平板上挑取单克隆到含5ml新鲜LB和氨苄抗性的LB培养基中培养过夜。
3.将过夜培养的试管菌以1:100的量加入事先配置好的50ml2xYT培养基中，30℃培 养至OD为0.2-0.3左右时开始加入L-阿拉伯糖诱导（终浓度为30mM），30℃诱导培养90 min。
4.将诱导后的培养基在冰上放置1h，然后于4℃4000rpm离心10min后弃上清， 用20ml预冷的ddH2O重悬菌体，再次于4℃4000rpm离心10min，如此反复4次。最 后一次弃上清后加入1.5ml ddH2O重悬菌体，然后每个1.5ml的EP管分装80-100μl。
5.吸取10μl用于基因敲出的线性化基因片段到感受态溶液中，混匀后迅速加入到电 转杯中，放于电转仪中进行电转，电转结束后立即加入500μl新鲜LB培养基，于37℃复 苏培养1-2h。
6.4000rpm离心涂含相应抗性的培养板，37℃培养过夜，第二天进行鉴定。
(十)大肠杆菌基因组中抗性消除
1.将pCP20转化待消除抗性基因的菌株中，30℃培养过夜。
2.从转化板上挑取单克隆到含新鲜LB（无抗性）的EP管中，37℃培养热诱导培养 8h。
3.将EP管转移到42℃条件中培养过夜，去除pCP20质粒，取EP管中少量的菌液 涂无抗性板，37℃培养过夜。
4.利用相应的引物对平板上长出的克隆进行鉴定。
(十一)枯草芽孢杆菌WB800转化
1.接种枯草芽孢杆菌WB800于3mlLB培养基中，过夜培养。
2.取2.6ml过夜培养物接入40ml（LB+0.5M山梨醇）中，37℃，200rpm培养至 OD600＝0.85~0.95。
3.将菌液冰水浴10min，然后5000g，5min，4℃离心收集菌体。
4.用50ml预冷的电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖），重新吹悬 菌体，5000g，5min，4℃离心去上清，如此漂洗4次。
5.将洗涤后的菌体吹悬于1ml电转培养基中，每EP管分装120μl。
6.将60μl感受态细胞中加入50ngDNA（1~8μl），冰上孵育2min，加入预冷的电转 杯中，电击一次。
7.电击完毕取出杯子并立即加入1ml RM（LB+0.5M山梨醇+0.38甘露醇），37℃， 200rpm，复苏3h后，涂板。37℃，过夜培养。
溶液配方：
40ml（LB+0.5M山梨醇）：蛋白胨10g/l,酵母粉5g/l,NaCl10g/l,3.6g山梨醇pH＝7.2
200ml电转培养基（0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10%葡萄糖）：18g山梨醇，18.5g 甘露醇，20g葡萄糖。
10ml RM（0.5M山梨醇，0.38M甘露醇）：0.9g山梨醇，0.7g甘露醇。
2个50ml离心管，0.22μM滤膜除菌。
实施例1JM109(DE3,sulA-,LexA-)、JM109(DE3,sulA-,LexA-,CheZ-)、 JM109(DE3,sulA-,LexA-,ω-)、JM109(DE3,sulA-,LexA::Amp-LV-L0)大肠杆菌菌株的构建
以pKD3质粒为模板，采用以下引物P1、P3、P3和P4扩增得到两端含sulA基因 同源臂的用于sulA基因敲除的线性化片段，其核酸序列为112。在JM109(DE3)菌株 上进行sulA基因的敲除，得到JM109(DE3，sulA::Cam)中间菌株。采用以下引物P5、 P6、P7和P8，以pKD4为模板进行PCR扩增，扩增得到两端含LexA基因同源臂的 用于LexA基因敲除的线性化片段，其核酸序列为113。采用以下引物，在JM109(DE3， sulA∷Cam)中间菌株上进行LexA基因的敲除，得到JM109(DE3，sulA::Cam,LexA::kan) 菌株。然后将JM109(DE3,sulA::Cam,LexA::kan)菌株上的Cam抗性与Kan抗性基因去 除，得到JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株。
采用以下引物P9、P10、P11和P12，以pKD4为模板进行PCR扩增，扩增得到 两端含CheZ基因同源臂的用于CheZ基因敲除的线性化片段，其核酸序列为114。采 用以下引物P13、P14、P15和P16，以pKD4为模板进行PCR扩增，扩增得到两端含 ω因子基因同源臂的用于ω因子基因敲除的线性化片段，其核酸序列为115。在 JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株的基础上分别进行CheZ和ω因子基因的敲除，得到 JM109(DE3,sulA-,LexA-,CheZ::kan)和JM109(DE3,sulA-,LexA-,ω::kan)菌株。将这两个菌 株基因组上的kan抗性基因去除，得到JM109(DE3,sulA-,LexA-,CheZ-和 JM109(DE3,sulA-,LexA-,ω-)菌株。
用于sulA基因敲除的线性化片段的引物为：
上游引物1（P1）：5’-TAACTCACAGGGGCTGGATTGATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTT-3’
上游引物1（P2）：5’-GATGTACTGTACATCCATACAGTAACTCACAGGGGCTGGATT-3’
下游引物1（P3）：5’-TTCCAGGATTAATCCTAAATTTACATGGGAATTAGCCATGGTC-3’
下游引物1（P4）：5’-CATTGGCTGGGCGACAAAAAAAGTTCCAGGATTAATCCTAAATT-3’
用于LexA基因敲除的线性化片段的引物为：
上游引物1（P5）：5’-CAACAAGAGGTGTTTGATCTCATCCTGAGCGATTGTGTAGGCTG-3’
上游引物2（P6）：5’-GAAAGCGTTAACGGCCAGGCAACAAGAGGTGTTTGAT-3’
下游引物1（P7）：5’-ACGACAATTGGTTTAAACTCGCCATATGAATATCCTCCTTAG-3’
下游引物2（P8）：5’-GAAGCTCTGCTGACGAAGGTCAACGACAATTGGTTTAAACTC-3’
用于CheZ基因敲除的线性化片段的引物为：
上游引物1（P9）：5’-GGTCACGCCACATCAGGCAATACAAATGAGCGATTGTGTAGGCTG-3’
上游引物2（P10）：5’-CTTATCAGACCGCCTGATATGACGTGGTCACGCCACATCAGGCAA-3’
下游引物1（P11）：5’-AACTGGGCATGTGAGGATGCGACTCATATGAATATCCTCCTTAG-3’
下游引物2（P12）：5’-AGGAAAAACTCAACAAAATCTTTGAGAAACTGGGCATGTGAGGATG-3’
用于ω因子基因敲除的线性化片段引物为：
上游引物1（P13）：5’-GTAACCGTTTTGACCTGGTACTGTGAGCGATTGTGTAGGCTG-3’
上游引物2（P14）：5’-AGGACGCTGTAGAGAAAATTGGTAACCGTTTTGACCTGGT-3’
下游引物1（P15）：5’-AATTCAGCGGCTTCCTGCTCTTGCATATGAATATCCTCCTTAG-3’
下游引物2（P16）：5’-GCAATAGCGGTAACGGCTTGTAATTCAGCGGCTTCCTGCTC-3’
为了获得含本发明光敏转录因子表达框LV-L0的JM109(DE3,sulA-，LexA:: Amp-LV-L0)菌株，利用引物P17、P18PCR扩增pALV-L0，利用引物P19、P20、P21 和P22以pKD4质粒为模板扩增含kan抗性基因表达框的kan基因片段，经双酶切后 与经同样双酶切的pALV-L0扩增线性化片段相连接，得到的质粒命名为pALV-L0-kan。 利用以下引物P23、P24、P25、P26扩增pALV-L0-kan质粒上的Amp-LV-L0-kan片段， 其核酸片段为116。在JM109（DE3,sulA-）菌株的基础上进行基因敲除，得到菌株 JM109(DE3,sulA-,LexA::AmLV-L0-kan)，然后消除基因组上的kan抗性，得到菌株 JM109(DE3,sulA-,LexA::Amp-LV-L0)。
用于扩增扩增pALV-L0载体的引物为：
上游引物(P17)：CCCCTCGAGCTGCCACCGCTGAGCAATAACT
下游引物(P18)：CCCGAATTCTCATTCCGTTTCGCACTGGAA
用于扩增kan抗性基因的引物为：
上游引物(P19)：CCCGAATTCGCGATTGTGTAGGCTGGAGCTGC
下游引物1(P20)：5’-CTTTTGCTGTATATACTCATGAATATCCTCCTTAGTTC
下游引物2(P21)：5’-GTTTATGGTTCCAAAATCGCCTTTTGCTGTATATACTCAT-3’
下游引物3(P22)：5’-GGGCTCGAGGTTTATTGTGCAGTTTATGGTTCCAAAATCG-3’
用于扩增pALV-L0-kan质粒的引物为：
上游引物1(P23)：ATTGGTTTAAACTCGCTATTTTCGTGCGCGGAACCCCTATTTG
上游引物2(P24)：CTGCTGACGAAGGTCAACGACAATTGGTTTAAACTCGCTA
上游引物3(P25)：GAAGCTCTGCTGACGAAGGTCAACG
下游引物(P26)：GTTTATTGTGCAGTTTATGGTTCCAAAATC
实施例2以T7启动子进行表达的含不同接头肽的LexA(1-87)-VVD36(C71V)原核 细菌表达载体的构建
采用引物P27、P28从JM109(DE3)基因组中扩增LexA的1-87位氨基酸基因片 段。采用引物P29、P30从pGAVP(C71V)质粒（本实验室收藏，相关文章：Wang,X. 等,Nat Methods,2012.）上扩增VVD36（C71V）基因片段，然后利用重叠PCR将 LexA（1-87）与VVD36（C71V）连在一起得到LexA(1-87)-VVD36（C71V）基因片 段。采用引物P31、P32扩增pCDFDuet1载体，得到的线性化载体经XhoI与EcoRI 双酶切后与经同样双酶切的LexA(1-87)-VVD36(C71V)基因片段相连接，构建得到的质 粒命名为pLV-L0，其包含重组光敏转录因子LexA(1-87)-VVD36(C71V)融合蛋白基因 （融合蛋白简写为LV-L0，其核苷酸和氨基酸序列分别为48和49）。在pLV-L0质粒 的基础上，利用引物P33、P34、P35、P36、P37、P38、P39、P40对LexA(1-87)与 VVD36(C71V)间的接头肽进行更换，分别得到含七种不同接头肽（L1、L2、L3、L4、 L5、L6和L7）的重组LexA(1-87)-VVD36(C71V)融合蛋白基因的载体质粒，分别命名 为pLV-L1、pLV-L2、pLV-L3、pLV-L4、pLV-L5、pLV-L6和pLV-L7，如图4所示。 各融合蛋白的编码核苷酸序列分别为序列50、52、54、56、58、60和62；氨基酸序 列分别为序列51、53、55、57、59、61和63。
用于扩增LexA(1-87)基因片段的引物为：
上游引物（P27）：5’-CCCCTCGAGCATGAAAGCGTTAAC-3’
下游引物（P28）：5’-CGGTTCACCGGCAGCCACACGACCTACCAG-3’
用于扩增VVD36(C71V)基因片段的引物为：
上游引物（P29）：5’-CTGCCGGTGAACCGCATACGCTCTACGCTCCCGGCG-3’
下游引物（P30）：5’-CCCGAATTCTCATTCCGTTTCGCACTGGAA-3’
用于扩增pCDFDuet1质粒的引物为：
上游引物（P31）：5’-CCCGAATTCCTGCCACCGCTGAGCAATAACT-3’
下游引物（P32）：5’-GGGCTCGAGCCCTGGCTGTGGTGATGATGGTG-3’
更换LexA(1-87)-VVD36(C71V)间的接头肽的引物为：
通用下游引物（P33）：5’-CGGTTCACCGGCAGCCACACGACCTACCAG-3’
接头肽1上游引物（P34）：5’-TGTCGTGGGCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
接头肽2上游引物（P35）：5’-GTGTTTCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
接头肽3上游引物（P36）：5’-TATAAGCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
接头肽4上游引物（P37）：5’-GGATCCCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
接头肽5上游引物（P38）：5’-GAACCTCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
接头肽6上游引物（P39）：5’-CTGGCCGAGGCCGCTGCCCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
接头肽7上游引物（P40）：5’-ACCGAGTTCCCCGGCGTGGACCAGCATACGCTCTACGCTCCCGGC-3’
实施例3以Amp启动子进行表达的含不同接头肽的LexA(1-87)-VVD36(C71V)原 核细菌表达载体的构建
采用引物P41、P42从pRSETb质粒上PCR扩增得到Amp启动子核苷酸片段， 其核苷酸序列为序列138，再利用引物P43、P44PCR扩增pCDFduet1质粒，得到的 线性化片段经NdeI和XhoI双酶切后与经同样双酶切的Amp启动子片段相连接，得到 pAmp质粒载体。将实施例2中构建的含不同接头肽的LexA(1-87)-VVD36（C71V）经 引物P45、P46扩增后，得到的含不同接头肽的LexA(1-87)-VVD36（C71V）片段经NdeI 和XhoI双酶切后与经同样双酶切的pAmp质粒相连接，分别得到含八种不同接头肽 （L0、L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7）的重组LexA(1-87)-VVD36（C71V）融合蛋 白基因的载体质粒，分别命名为pALV-L0、pALV-L1、pALV-L2、pALV-L3、pALV-L4、 pALV-L5、pALV-L6和pALV-L7，如图5所示。各融合蛋白的编码核苷酸序列分别为 序列48、50、52、54、56、58、60和62；氨基酸序列分别为序列49、51、53、55、 57、59、61和63。
用于扩增得到Amp启动子的引物为：
上游引物（P41）：5’-GGCTGCAGGTGCGCGGAACCCCTATTTG-3’
下游引物（P42）：5’-GGCTCGAGTACTCATATGCTTCCTTTTTCAA-3’
用于扩增pCDFduet1质粒的引物为：
上游引物（P43）：5’-CCCCTCGAGCTGCCACCGCTGAGCAATAACT-3’
下游引物（P44）：5’-GCCCTGCAGGAGCGTCGAGATCCCGGACAC-3’
用于扩增含不同linker的LexA(87)-VVD36（C71V）片段的引物为:
上游引物（P45）：5’-GATTCCATATGAAAGCGTTAACGGCC-3’
下游引物（P46）：5’-CCCCTCGAGTCATTCCGTTTCGCACTGGAA-3’
实施例4含以不同VVD突变体，phot1-LOV2、aurochrome为第二多肽的光敏转 录子的原核细菌表达载体的构建
先采用引物P47、P48对pALV-L0质粒进行突变PCR，得到的中间质粒命名为 pALV-L0(wt)。分别采用引物P49和P50、P51和P52对pALV-L0(wt)质粒进行突变PCR， 利用引物P53和P54、P55和P56、P57和P58、P59和P60对pALV-L0质粒进行突变 PCR构建分别含有VVD中Y50W或N56K或N56K C71V或I52A C71V或I52S C71V 或N56R C71V点突变的LexA(1-87)-VVD36融合蛋白基因的原核细菌表达载体，分别 命名为pALV-L0(Y50W)、pALV-L0(N56K)、pALV-L0(N56K C71V)、pALV-L0(I52A C71V)、pALV-L0(I52S C71V)、和pALV-L0(N56R C71V)，如图6所示，各融合蛋 白的核苷酸序列分别为序列66、64、68、70、72和74，氨基酸序列分别为67、65、 69、71、73和75。
构建pALV-L0(wt)的引物为：
上游引物（P47）：5’-GCTCTGATTCTGTGCGACCTGAAGC-3’
下游引物（P48）：5’-GCATGACGTGTCAACAGGTCCCAGTTC-3’
构建VVD36(Y50W)突变体的引物为：
上游引物（P49）：5’-GCTGATTCAGATTATGAACAGGCC-3’
下游引物（P50）：5’-CAGCCCATAATGTCATAACCGCCGGG-3’
构建VVD36(N56K)突变体的引物为：
上游引物（P51）：5’-GAGGCCAAACCCCCAAGTAGAACTG-3’
下游引物（P52）：5’-TTCATAATCTGAATCAGATAGCCCAT-3’
构建VVD36(N56K C71V)突变体的引物为：
上游引物（P53）：5’-GCTGATTCAGATTATGAAGAGGCCAAACC-3’
下游引物（P54）：5’-CAGCCCATAATGTCATAACCGCCGGGAG-3’
构建VVD36(I52S C71V)突变体的引物为：
上游引物（P55）：5’-TCCCAGATTATGAACAGGCCAAACCC-3’
下游引物（P56）：5’-CAGATAGCCCATAATGTCATAACCG-3’
构建VVD36(I52A C71V)突变体的引物为：
上游引物（P57）：5’-GCGCAGATTATGAACAGGCCAAACCC-3’
下游引物（P58）：5’-CAGATAGCCCATAATGTCATAACCG-3’
构建VVD36(N56R C71V)突变体的引物为：
上游引物（P59）：5’-GCCAAACCCCCAAGTAGAACTGGGAC-3’
下游引物（P60）：5’-CTGCGCATAATCTGAATCAGATAGC-3’
为了构建以向光素1(phototropin1)的LOV2结构域(简写为AsLOV2，其cDNA由 美国德克萨斯大学西南医学中心达拉斯校区Gardner实验室慷慨馈赠）为第二多肽的光 敏转录因子表达载体，先设计引物P61、P62从其cDNA上扩增得到AsLOV2基因片 段，再利用引物P63、P64从实施例3中构建的pALV-L0质粒上扩增得到LexA（1-87） 片段，利用重叠PCR技术将AsLOV2基因片段与LexA（1-87）片段相连接，得到 LexA(1-87)-AsLOV2融合基因片段，经NdeI和XhoI双酶切后与经同样双酶切的实施 例3中构建的pALV-L0质粒相连接，构建的含融合蛋白LexA(1-87)-AsLOV2质粒命 名为pALA（融合蛋白简称为LA，核酸和氨基酸序列见序列序列76和序列77）。
扩增AsLOV2基因的引物为：
上游引物(P61):5’-GCTGCCGGTGAACCGTCCTTCTTGGCTACTACACTTGAAC-3’
下游引物(P62):5’-ACGGGCTCGAGAATAAGTTCTTTTGCCGCCTC-3’
扩增LexA（1-87）基因片段的引物为：
上游引物(P63)：5’-GATTCCATATGAAAGCGTTAACGGCC-3’
下游引物(P64)：5’-ATCGGTTCACCGGCAGCCACACGACCTAC-3’
为了构建以aurochrome的LOV结构域（简写为AuLOV，其cDNA由日本滋贺 县立命馆大学Hironao Kataoka实验室慷慨馈赠）为第二多肽的光敏转录因子表达载 体，先设计引物P65、P66从其cDNA中扩增得到AuLOV基因片段，利用重叠PCR 技术将AuLOV基因片段与本实施例得到的LexA(1-87)片段相连接，得到 LexA(1-87)-AuLOV融合基因片段，经NdeI和XhoI双酶切后与经同样双酶切的实施 例3中构建的pALV-L0质粒相连接，构建的含融合蛋白LexA(1-87)-AuLOV质粒命名 为pALAu（融合蛋白简称为LAu，核酸和氨基酸序列见序列序列78和序列79）。
扩增AulOV2基因的引物为：
上游引物(P65)：5’-GCTGCCGGTGAACCGTCCTTCTTGGCTACTACACTTGAAC-3’
下游引物(P66)：5’-CTACTACACACACGAAGTTCTTTTGCCGCCTC-3’
实施例5以cI、LacI、Gal4、和TetR为第一多肽的光敏转录因子的原核细菌 表达载体的构建
为了构建以cI（1-102）为第一多肽的光诱导转录因子的大肠杆菌表达载体，采用 引物P67、P68从λ噬菌体基因组中PCR扩增cI（1-102）基因片段，经NdeI和BamHI 双酶切后与经同样双酶切的pALV-L4相连接，得到含以cI为第一多肽的重组光敏转 录因子的载体，命名为pACV，如图7，相应的重组光敏转录因子融合蛋白简称为CV， 其核苷酸和氨基酸序列分别为序列80和序列81。
用于扩增cI（1-102）的引物为：
上游引物(P67):5’-GGCGCATATGTCTACCAAGAAGAAACC-3’
下游引物(P68):5’-CCCGGATCCATATTCTGACCTCAAAGACG-3’
为了构建以LacI（1-62）为第一多肽的光诱导转录因子的大肠杆菌表达载体，利 用引物P69、P70以pCDFDuet1载体（Novagen公司）上的LacI为模板扩增其DNA 结合结构域（1-62位氨基酸）基因片段，经NdeI和BamHI双酶切后与经同样双酶切 的pALV-L4相连接，得到的中间载体命名为pALaV(wt)。再利用引物P71、P72对 pALaV(wt)载体进行PCR扩增，得到的线性化载体片段经T4PNK加磷自连后，得到 含以LacI(1-62)为第一多肽的重组光敏转录因子的载体，命名为pALaV，如图7，相应 的重组光敏转录因子融合蛋白简称为LaV，其核苷酸和氨基酸序列分别为序列82和序 列83。
用于扩增LacI(1-62)的引物为：
上游引物(P69):5’-GGCGCATATGAAACCAGTAACGTTATAC-3’
下游引物(P70):5’-CCCGGATCCCAACGACTGTTTGCCCGCC-3’
用于构建pALaV载体的引物为：
上游引物(P71):5’-CGTTTCCAACGTGGTGAACCAGGCC-3’
下游引物(P72):5’-GTCTGATGAGAGACACCGGCATACTC-3’
为了构建以Gal4(1-65)为第一多肽的光诱导转录因子的大肠杆菌表达载体，利用 引物P73、P74以pBIND质粒（Promega公司）为模板扩增Gal4(1-65)DNA结合结构 域基因片段，经NdeI和BamHI双酶切后与经同样双酶切的pALV-L4相连接，得到含 以Gal4(1-65)为第一多肽的重组光敏转录因子的载体，命名为pAGV，如图7，相应的 重组光敏转录因子融合蛋白简称为GV，其核苷酸和氨基酸序列分别为序列84和序列 85。
用于扩增Gal4(1-65)的引物为：
上游引物(P73):5’-GGCGCATATGAAGCTACTGTCTTCTATC-3’
下游引物(P74):5’-CCCGGATCCTTCCAGTCTTTCTAGCCTTG-3’
为了构建以TetR(1-63)为第一多肽的光诱导转录因子的大肠杆菌表达载体，利用 引物P75、P76PCR扩增由上海捷瑞生物有限公司全基因合成的TetR的DNA结合结 构域基因片段（1-63位氨基酸）基因片段，经NdeI和BamHI双酶切后与经同样双酶 切的pALV-L4相连接，得到含以TetR(1-63)为第一多肽的重组光敏转录因子的载体， 命名为pATV，如图7，相应的重组光敏转录因子融合蛋白简称为TV，其核苷酸和氨 基酸序列分别为序列86和序列87。
用于扩增TetR（1-63）的引物为：
上游引物(P75):5’-GGCGCATATGTCTAGGCTAGATAAGAG-3’
下游引物(P76):5’-CCCGGATCCGTGTCTATCCAGCATCTCG-3’
实施例6以ω因子和α因子为光敏转录因子第三多肽的原核细菌表达载体的构建
利用引物P77、P78从大肠杆菌BL21(DE3)基因组中扩增ω因子基因片段，采用 引物P77、P79、P80利用重叠PCR扩增得到ω-linker基因片段，利用引物P81、P82 以实施例3构建的pALV-L0质粒为模板扩增LV-L0基因片段，再利用重叠PCR技术 将ω-linker与LV-L0基因片段连接在一起得到融合蛋白基因片段ω-linker-LV-L0（简 称为ωLV,核苷酸和氨基酸序列分别为90、91），经NdeI和XhoI双酶切后与同样经 双酶切的实施例3构建的pALV-L0质粒相连接，得到的质粒命名为pAωLV。分别利 用引物P82和P83、P82和P84、P82和P85、P82和P86以实施例5构建的pACV、 pALaV、pAGV和pATV质粒为模板，扩增得到CV基因片段、LaV基因片段、GV基 因片段和TV基因片段，经SpeI和XhoI双酶切后与经同样双酶切的本实施例构建的 pAωLV质粒相连接，得到的质粒分别命名为pAωCV、pAωLaV、pAωGV和pAωTV， 如图8所示，各自所含重组转录因子分别简写为ωCV、ωLaV、ωGV和ωTV，各自核 苷酸序列分别为94、98、102、106，氨基酸序列分别为95、99、103、107。
扩增ω因子基因片片段的引物为：
上游引物1(P77)：5’-GCGGCATATGGCACGCGTAACTGTTC-3’
下游引物2(P78)：5’-TCCTTGTAGTCCGCGGCCGCACGACCTTCAGCAATAG-3’
用于扩增得到ω-linker基因片段的引物为：
上游引物（P79）：
5’-CATGGGGGGGTGTCTTGGAACCGGTCCGGAACTTGTCGTCGTCATCCTTGTAGTCCGCG-3’
下游引物（P80）：5’-CGTTAACGCTTTCATACTAGTGTGGGGGGGTGTCTTGG-3’
用于扩增LV-L0基因片段的引物为：
上游引物（P81）：5’-ATGAAAGCGTTAACGGCCAGGCAAC-3’
下游引物（P82）：5’-CCCGAATTCTCATTCCGTTTCGCACTGGAA-3’
用于扩增CV、LaV、GV和TV基因片段的引物分别为：
上游引物（P83）：5’-GGGACTAGTATGAGCACAAAAAAGAAACC-3’
上游引物（P84）：5’-GGGACTAGTATGAAACCAGTAACGTTA-3’
上游引物（P85）：5’-CCCACTAGTATGAAGCTACTGTCTTCTATC-3’
上游引物（P86）：5’-CCCACTAGTATGTCTAGGCTAGATAAGAGC-3’
为了构建含以α因子为第三多肽的光诱导转录因子的原核细菌表达载体，采用引 物P87、P88扩增实施例3构建的pALV-L0质粒，得到LV-L0基因片段，采用引物 P87、P79、P89利用重叠PCR扩增得到LV-L0-linker基因片段，采用引物P90、P91 从大肠杆菌BL21(DE3)基因组中扩增α因子基因片段，然后利用重叠PCR技术将 LV-L0-linker基因片段与α因子基因片段连接在一起，得到LV-L0-linker-α融合基因片 段（简称LVα，核苷酸和氨基酸序列分别为88、89），将此基因片段经NdeI和XhoI 双酶切后与经同样双酶切的实施3中构建pALV-L0质粒相连接，得到的质粒命名为 pALVα。分别利用引P88和P92、P88和P93、P88和P94、P88和P95以实施例5构 建的pACV、pALaV、pAGV和pATV质粒为模板，扩增得到CV基因片段、LaV基因 片段、GV基因片段和TV基因片段，经NdeI和SpeI双酶切后与经同样双酶切的本实 施例构建的pALVα质粒相连接，得到的质粒分别命名为pACVα、pALaVα、pAGVα 和pATVα，如图9所示，各自所含重组转录因子分别简写为CVα、LaVα、GVα和TVα， 各自的核苷酸序列分别为92、96、100、104，氨基酸序列分别为93、97、101和105。
用于扩增LV-L0基因片段的引物为：
上游引物1(P87)：5’-GATTCCATATGAAAGCGTTAACGGCC-3’
下游引物2(P88)：5’-CCTTGTAGTCCGCGGCCGCACTAGTTTCCGTTTCGCACTGGAA-3’
用于扩增得到LV-L0-linker基因片段的引物为：
下游引物(P89)：5’-CCTGCATGGTACCGTGGGGGGGTGTCTTGGA-3’
用于扩增得到α因子基因片段的引物为：
上游引物1(P90)：5’-CATGGTACCATGCAGGGTTCTGTGACAGAG-3’
下游引物2(P91)：5’-GCCCTCGAGTTACTCTGGTTTCTCTTCTTTC-3’
用于扩增CV基因片段、LV基因片段、GV基因片段和TV基因片段的引物分别 为：
上游引物（P92）：5’-GGGCATATGAGCACAAAAAAGAAACC-3’
上游引物（P93）：5’-GGGCATATGAAACCAGTAACGTTA-3’
上游引物（P94）：5’-CCCCATATGAAGCTACTGTCTTCTATC-3’
上游引物（P95）：5’-CCCCATATGTCTAGGCTAGATAAGAGC-3’
实施例7分别构建含有LexA、cI、LacI、Gal4和TetR相对应反应元件的靶转录 单元的原核细菌表达载体
为了检测以LexA为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对mCherry荧光蛋白和 LacZβ半乳糖苷酶基因转录的调控效果，构建了含LexA相对应反应元件和荧光蛋白 基因的靶转录单元的原核细菌表达载体。先采用以下引物P96、P97、P98、P99、P100 经重叠PCR扩增得到colE启动子片段；利用引物P101、P102从pU5-mCherry质粒上 （本实验室收藏，相关文章：Wang,X.等,Nat Methods,2012.）PCR扩增得到mCherry 基因片段；采用引物P103、P104从pBAD/His A质粒上PCR扩增得到rrnB转录终止 子片段，最后将这三个片段经重叠PCR扩增得到colE-mCherry-rrnB基因片段。利用 引物P105、P106对pRSETb载体进行扩增，得到的线性化片段经BamH和XhoI双酶 切后，与同样经双酶切的colE-mCherry-rrnB基因片段相连接，得到的中间质粒利用引 物P107、P108扩增后，得到的线性化片段经KpnI和NheI双酶切，然后与利用引物 P109、P110扩增得到的rrnB片段经同样双酶切后相连接，得到含LexA相对应反应元 件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细菌表达载体pB-colE-mCherry，靶转 录单元的核苷酸序列为117。利用引物P111、P112从大肠杆菌BL21(DE3)基因组中 扩增LacZ基因，采用引物P113、P114扩增pB-colE-mCherry质粒，得到的LacZ基因 片段和pB-colE-mCherry线性化扩增片段均使用HindIII和BglII双酶切后相连接，得 到含LexA相对应反应元件和LacZβ半乳糖苷酶基因的靶转录单元的原核细菌表达载 体pB-colE-LacZ,靶转录单元的核苷酸序列为118。利用以下引物P115和P116、P117 和P118、P119和P120从JM109(DE3)菌株的基因组中扩增得到sulA、RecA和umuDC 启动子基因片段，利用重叠PCR分别与本实施例扩增得到的mCherry片段连接得到 sulA-mCherry、RecA-mCherry和umuDC-mCherry片段，分别经BamHI和EcoRI双酶 切后与经同样双酶切的pB-colE-mCherry质粒载体相连接，得到其他三种含LexA相对 应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细菌表达载体 pB-sulA-mCherry、pB-umuDC-mCherry、pB-RecA-mCherry，如图10所示，相应的靶 转录单元的核苷酸序列分别为119、120、121。
扩增得到colE启动子片段的引物为：
上游引物1(P96)：
5’-GATCGTTTTCACAAAAATGGAAGTCCACAGTCTTGACAGGGAAAATGCAGCGGCGTAG-3’
上游引物2(P97)：5’-GGGGATCCTGTTTTTTTGATCGTTTTCACAAAAAT-3’
下游引物1(P98)：
5’-TACTGTACATATAACCACTGGTTTTATATACAGCATAAAAGCTACGCCGCTGCATT-3’
下游引物2(P99)：
5’-TATAAAATCCTCTTTGACTTTTAAAACAATAAGTTAAAAATAAATACTGTACATATAAC-3’
下游引物3(P100)：5’-CGCCCTTGCTCACCATTATAAAATCCTCTTTGAC-3’
用于扩增mCherry基因片段的引物为：
上游引物(P101)：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3’
下游引物(P102)：5’-GGGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’
用于扩增rrnB转录终止子的引物为：
上游引物(P103)：5’-CAAGTAAGAATTCCCCCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’
下游引物(P104)：5’-GGGCTCGAGCAAACAACAGATAAAACGAAAGG-3’
用于扩增pRSETb质粒的引物为：
上游引物(P105)：5’-GACCTCGAGCGCAGCCTGAATGGCGAATG-3’
下游引物(P106)：5’-CGGGATCCATTTCGCGGGATCGAGATC-3’
用于扩增中间质粒的引物为：
上游引物(P107)：5’-CCCGCTAGCGGATCCATAGGGTTGATCTT-3’
下游引物(P108)：5’-GGGGGTACCATTTCGCGGGATCGAGA-3’
用于扩增rrnB转录终止子的引物为：
上游引物(P109)：5’-CCCGGTACCCCCCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’
下游引物(P110)：5’-CCCGCTAGCGCAAACAACAGATAAAACGAAA-3’
用于扩增LacZ基因的引物为：
上游引物(P111)：5’-CCCAAGCTTATGGTCGTTTTACAACGTCGTG-3’
下游引物(P112)：5’-CCTAGATCTTTATTTTTGACACCAGACCAAC-3’
用于扩增pB-colE-mCherry载体的引物为：
上游引物（P113）：5’-CCCAGATCTCCCCTGTTTTGGCGGATGAGAGAAG-3’
下游引物（P114）：5’-CCCAAGCTTATCCTCTTTGACTTTTAAAACAAT-3’
用于扩增sulA启动子序列的引物为：
上游引物(P115)：5’-CCCGGATCCATAGGGTTGATCTTTGTTG-3’
下游引物(P116)：5’-GCCCTTGCTCACCATAATCAATCCAGCCCCTGTG-3’
用于扩增RecA启动子序列的引物为：
上游引物(P117)：5’-CCCGGATCCCAATTTCTACAAAACACTTGATACT-3’
下游引物(P118)：5’-CGCCCTTGCTCACCATTTTTACTCCTGTCATGCCGGG-3’
用于扩增umuDC启动子序列的引物为：
上游引物(P119)：5’-CCCGGATCCGCCTATGCAGCGACAAATATT-3’
下游引物(P120)：5’-CGCCCTTGCTCACCATAATAATCTGCCTGAAGTTATA-3’
为了检测以cI为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对mCherry荧光蛋白基因 转录的调控效果，构建了含cI相对应反应元件和荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细 菌表达载体。利用引物P121、P122、P123、P124、P125经重叠PCR得到PλO12启动子 片段，利用引物P126、P127从pB-colE-mCherry质粒中扩增mCherry片段，然后采用 重叠PCR将PλO12启动子基因片段和mCherry基因片段连接在一起，得到Pλo12-mCherry 基因片段经BamHI和EcoRI双酶切后与经同样双酶切的pB-colE-mCherry载体相连接， 得到含cI相对应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细菌表达载体 pB-PλO12-mCherry，如图10所示，其靶转录单元的核苷酸序列为122。
用于扩增PλO12启动子的引物为：
上游引物1(P121)：5’-TATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTG-3’
上游引物2(P122)：5’-CCCGGATCCTATCTAACACCGTGCGTG-3’
下游引物1(P123)：5’-GCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATAGT-3’
下游引物2(P124)：5’-AGTACCTCCTTAGTACATGCAACCATTATCACCG3’
下游引物3(P125)：5’-GCCCTTGCTCACCATACTAGTACCTCCTTAGTAC-3’
用于扩增mCherry基因片段的引物为：
上游引物(P126)：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3’
下游引物(P127)：5’-GGGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’
为了检测以LacI为第一多肽的本发明重组光敏转录因子对mCherry荧光蛋白基 因转录的调控效果，构建了含LacI相对应反应元件和荧光蛋白基因的靶转录单元的原 核细菌表达载体。采用引物P128、P129从pCDFDuet1载体上扩增T7启动子-lac操纵 子核酸片段，经BamHI和SpeI双酶切后与经同样双酶切的pB-PλO12-mCherry载体相 连接，得到中间载体pB-T7lacop-mCherry(wt)。再分别利用引物P130和P131、P132 和P133、P134和P135分别以pB-T7lacop-mCherry(wt)质粒为模板进行PCR扩增，得 到的线性化载体片段经T4PNK加磷自连接后得到分别含LacI、Gal4和TetR相对应 反应元件的靶转录单元的原核细菌表达载体，分别命名为pB-T7lacop-mCherry、 pB-T7galop-mCherry、pB-T7tetop-mCherry，如图10所示，相对应的靶转录单元核苷 酸序列为123、124、125。
扩增T7启动子-lac操纵子核酸片段的引物为：
上游引物（P128）：5’-CCCGGATCCGGAAATTAATACGACTCACTA-3’
下游引物（P129）：5’-GGGACTAGTTCTCCTTATTAAAGTTAAAC-3’
用于扩增得到含LacI相对应反应元件的靶转录单元载体引物为：
上游引物（P130）：5’-CTAAAAATTCCCCTGTAGAAATAATTTTGTT-3’
下游引物（P131）：5’-CGCTAAAAATTCCCCTATAGTGAGTCGTATTA-3’
用于扩增得到含Gal4相对应反应元件的靶转录单元载体引物为：
上游引物为（P132）：5’-GTCCTCCGCCCCTGTAGAAATAATTTTGT-3’
下游引物为（P133）：5’-AGTACTCCGCCCCTATAGTGAGTCGTATTAA-3’
用于扩增得到含TetR相对应反应元件的靶转录单元载体引物为：
上游引物为（P134）：5’-TGATAGAGACCCCTGTAGAAATAATTTTG-3’
下游引物为（P135）：5’-CTGATAGGGACCCCTATAGTGAGTCGTATTAA-3’
实施例8以LexA、cI、lacI、Gal4和TetR为第一多肽、以ω因子或α因子为第 三多肽的重组光敏转录因子所对应的含LexA或cI或lacI或Gal4或TetR相对应反应 元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细菌表达载体
为了构建以ω因子和α因子为第三多肽的光敏转录因子所对应的靶转录单元的原 核细菌表达载体，利用引物P136、P137、P138扩增得到lac最小启动子核酸片段，利 用引物P139、P140扩增实施例7构建的pB-colE-mCherry质粒，得到的线性化片段经 BamHI和HindIII双酶切后与经同样双酶切的lac最小启动子核酸片段相连接，得到的 中间载体命名为pB-lac-mCherry。利用引物P141和P142、P143和P144、P145和P146、 P147和P148、P149和P150扩增pB-lac-mCherry载体，得到的线性化载体片段经T4 PNK末端加磷后自连接，分别得到以LexA、cI、lacI、Gal4和TetR为第一多肽、以ω 因子或α因子为第三多肽的重组光敏转录因子所对应的含LexA或cI或lacI或Gal4 或TetR相对应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细菌表达载体， 分别命名为pB-lexAop-lac-mCherry、pB-o 12-lac-mCherry、pB-lacop-lac-mCherry、 pB-galop-lac-mCherry和pB-tetop-lac-mCherry，如图11所示，它们的靶转录单元的核 苷酸序列分别为126、127、128、129和130。
用于扩增lac最小启动子核酸片段的引物为：
上游引物1（P136）：
5’-AGGCACCCCGGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTCGACCGAGCGGAT-3’
上游引物2（P137）：5’-CCGGATCCCATTAGGCACCCCGGGCTTTACA-3’
下游引物（P138）：5’-CCAAGCTTTTCCTGTGTGAAAGTCTTATCCGCTCGGTCGAC-3’
用于扩增pB-colE-mCherry质粒的引物为：
上游引物（P139）：5’-CCCAAGCTTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’
下游引物（P140）：5’-ACAGGATCCGCTAGCGCAAACAACAGATAAAAC-3’
用于PCR扩增pB-lac-mCherry载体得到LexA所对应的原核细菌表达载体的引物：
上游引物（P141）：5’-GTTATATGTACAGTACCATTAGGCACCCCGGGCTTT-3’
下游引物（P142）：5’-CACTGGTTTTATATACAGGGATCCGCTAGCGCAAACAA-3’
用于PCR扩增pB-lac-mCherry载体得到cI所对应的原核细菌表达载体的引物为：
上游引物（P143）：5’-TATTTTACCTCTGGCGGTGATAATGCATTAGGCACCCCGGGCTTT-3’
下游引物（P144）：5’-GTCAACACGCACGGTGTTAGATAGGATCCGCTAGCGCAAACAA-3’
用于PCR扩增pB-lac-mCherry载体得到lacI所对应的原核细菌表达载体的引物 为：
上游引物（P145）：5’-GCTCACAATTCATTAGGCACCCCGGGCTTT-3’
下游引物（P146）：5’-GCTCACAATTGGATCCGCTAGCGCAAACAA-3’
用于PCR扩增pB-lac-mCherry载体得到Gal4所对应的原核细菌表达载体的引物：
上游引物（P147）：5’-CGGAGTACTGTCCTCCGCATTAGGCACCCCGGGCTTT-3’
下游引物（P148）：5’-CTCGGAGGACAGTACTCCGGGATCCGCTAGCGCAAACAA-3’
用于PCR扩增pB-lac-mCherry载体得到TetR所对应的原核细菌表达载体的引物：
上游引物（P149）：5’-CTCCCTATCAGTGATAGAGACATTAGGCACCCCGGGCTTT-3’
下游引物（P150）：5’-CTCTCTATCACTGATAGGGAGGATCCGCTAGCGCAAACAA-3’
实施例9以cI阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载体的构建
为了构建以cI阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载体，利用以下引物 P151、P152扩增实施例7中得到的rrnB-colE-mCherry基因片段，然后用引物P153、 P154扩增pRSETb质粒，得到的线性化片段经KpnI和BglII双酶切后与经同样双酶 切rrnB-colE-mCherry基因片段相连接，得到的中间质粒pB-rrnB-colE-mCherry。利用 以下引物P155、P156扩增colE启动子片段，利用以下引物P157、P158从λ噬菌体基 因组中扩增cI基因片段（核苷酸和氨基酸序列分别为131、132），经重叠PCR将colE 启动子片段与cI基因片段连接，得到的colE-cI片段经BamHI和BglII双酶切后与经 同样双酶切的pB-rrnB-colE-mCherry质粒相连接，得到中间质粒pB-rrnB-colE-cI。利 用引物P159、P160、P161、P162、P163经重叠PCR得到PλO12启动子片段，利用引 物P164、P165从pB-colE-mCherry质粒中扩增mCherry片段，利用引物P166、P167 扩增rrnB转录终止子片段，经重叠PCR扩增后得到PλO12-mCherry-rrnB基因片段。利 用引物P168、P169扩增本实施例构建的pB-rrnB-colE-mCherry质粒，得到的线性化片 段经SacI和XhoI双酶切后与经同样双酶切的PλO12-mCherry-rrnB片段相连接，得到间 接作用的质粒pB-colE-cI-PλO12-mCherry，如图12所示，靶转录单元的核苷酸序列为序 列133。
用于扩增rrnB-colE-mCherry基因片段的引物为：
上游引物(P151)：5’-CCCGGTACCCCCCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’
下游引物(P152)：5’-GGGAGATCTTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’
用于扩增pRSETb质粒的引物为：
上游引物(P153)：5’-CGAAGCTTGAAGATCTGCTTGATCCGGCTGCAAAC-3’
下游引物(P154)：5’-GGGGGTACCATTTCGCGGGATCGAGA-3’
用于扩增colE启动子的引物为：
上游引物(P155)：5’-GGGGATCCTGTTTTTTTGATCGTTTTCACAAAAAT-3’
下游引物(P156)：5’-TATAAAATCCTCTTTGACTTTTAAA-3’
用于扩增cI基因片段的引物为：
上游引物(P157)：5’-AAAGAGGATTTTATAATGAGCACAAAAAAGAAACC-3’
下游引物(P158)：5’-GGGAGATCTTTAGCCAAACGTCTCTTCAGG-3’
用于扩增PλO12启动子的引物为：
上游引物1(P159)：5’-TATCTAACACCGTGCGTGTTGACTATTTTACCTCTG-3’
上游引物2(P160)：5’-CCCGAGCTCTATCTAACACCGTGCGTG-3’
下游引物1(P161)：5’-GCAACCATTATCACCGCCAGAGGTAAAATAGT-3’
下游引物2(P162)：5’-AGTACCTCCTTAGTACATGCAACCATTATCACCG-3’
下游引物3(P163)：5’-GCCCTTGCTCACCATACTAGTACCTCCTTAGTAC-3’
用于扩增mCherry基因片段的引物为：
上游引物(P164)：5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTC-3’
下游引物(P165)：5’-GGGGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’
用于扩增rrnB转录终止子片段的引物为：
上游引物(P166)：5’-CAAGTAAGAATTCCCCCTGTTTTGGCGGATGAGAG-3’
下游引物(P167)：5’-GGGCTCGAGCAAACAACAGATAAAACGAAAGG-3’
用于扩增pB-rrnB-colE-mCherry质粒的引物为：
上游引物(P168)：5’-GACCTCGAGCGCAGCCTGAATGGCGAATG-3’
下游引物(P169)：5’-CAGGAGCTCCAACTGTTGGGAAGGGCGATC-3’
为了构建以CheZ和SRRz基因簇为报告基因的cI间接调控作用质粒，分别利用 引物P170和P171、P172和P173从JM109(DE3)基因组以及λ噬菌体基因组中扩增CheZ 基因和SRRz基因簇，扩增得到的基因片段经SpeI和EcoRI双酶切后与经同样双酶切 的本实施例构建的pB-colE-cI-PλO12-mCherry质粒连接转化，得到pB-colE-cI-PλO12-CheZ 和pB-colE-cI-PλO12-SRRz间接作用质粒，如图12所示，它们的靶转录单元的核苷酸序 列分别为134、135。
用于扩增CheZ基因片段的引物为：
上游引物(P170)：5’-CCCACTAGTATGATGCAACCATCAATCAAACCTG-3’
下游引物(P171)：5’-GGGGAATTCTCAAAATCCAAGACTATCCAA-3’
用于扩增SRRz基因簇的引物为：
上游引物(P172)：5’-CCCACTAGTATGAAGATGCCAGAAAAACATGACC-3’
下游引物(P173)：5’-CCCGAATTCTAGGCATTTATACTCCGCTGGA-3’
为了构建利用该原核细菌光诱导基因表达系统大量表达Ero1巯基氧化酶蛋白， 需要构建含Ero1为报告基因的cI间接调控作用质粒，利用引物P174和P175从BY4741 酿酒酵母菌株基因组中扩增Ero1(56-424)基因片段，经SpeI和EcoRI双酶切后与经同 样双酶切的本实施例构建的pB-colE-cI-PλO12-mCherry质粒连接转化，得到 pB-colE-cI-PλO12-Erol间接作用质粒，Ero1(56-424)蛋白的核苷酸和氨基酸序列如序列 46、47。
用于扩增Ero1(56-424)基因片段的引物为：
上游端引物（P174）：5’-CCCACTAGTATGTTCAATGAATTAAATGC-3’
下游端引物（P175）：5’-CCCGAATTCTTATAACCTTTTCCCGTAC-3’
实施例10含光敏转录因子和靶转录单元的单表达质粒系统的构建
为了构建含光敏转录因子和靶转录单元的单表达质粒系统，利用引物P176、P177 以实施例3中构建的pALV-L0质粒为模板扩增得到Amp-LV-L0核苷酸片段，然后经 SacI和EcoRI双酶切后与经同样双酶切的实施例9中构建的 pB-colE-mCherry-PλO12-mCherry质粒相连接，得到的中间质粒命名为 pB-colE-mCherry-Amp-LV-L0。利用KpnI和XohI双酶切此质粒，回收 ter-colE-mCherry-Amp-LV-L0-ter核苷酸片段，利用引物P178、P179以pCDFDuet1质 粒为模板进行PCR扩增，得到的线性化片段经KpnI和XhoI双酶切后与回收 colE-mCherry-Amp-LV-L0核苷酸片段相连接，得到的含光敏转录因子和靶转录单元的 单表达质粒命名为pD-colE-mCherry-Amp-LV，其中ter-colE-mCherry-Amp-LV-ter核苷 酸序列为序列108。
用于扩增Amp-LV-L0核苷酸片段的引物为：
上游引物(P176):5’-CCCGAGCTCGTGCGCGGAACCCCTATTTG-3’
下游引物(P177):5’-CCCGAATTCTCATTCCGTTTCGCACTGGAA-3’
用于扩增pCDFDuet1质粒的引物为：
上游引物(P178):5’-CCCCTCGAGCTGCCACCGCTGAGCAATAACT-3’
下游引物(P179):5’-GCCGGTACCGAGCGTCGAGATCCCGGACAC-3’
为了构建另一个含光敏转录因子和靶转录单元的单表达质粒，先采用引物P180、 P181P以实施例5中构建的pALaV(wt)质粒为模板扩增得到 LacI(1-62,wt)-VVD36(C71V)核苷酸片段，采用引物P182和P183扩增枯草芽孢杆菌 pHT01质粒，利用infusion技术将得到的线性化片段与LacI(1-62,wt)-VVD(C71V)核苷 酸片段连接在一起，得到中间质粒pHT01-LaV(wt)。利用引物P184和P185扩mCherry 基因片段，经BamHI和XbaI双酶切后与经同样双酶切的pHT01-LaV(wt)质粒进行连 接，得到的含光敏转录因子和靶转录单元的单表达质粒命名为 pHT01-LaV(wt)-Pgrac-mCherry，其中LaV(wt)-Pgrac-mCherry核苷酸序列为111。
用于扩增LacI-VVD36(C71V)核苷酸片段的引物为：
上游引物(P180):5’-AGGGAGACGATTTTGATGAAACCAGTAACGTTA-3’
下游引物(P181):5’-TTAATTGCGTTGCGCTCATTCCGTTTCGCACTGGAA-3’
用于扩增pHT01质粒的引物为：
上游引物(P182):5’-CAAAATCGTCTCCCTCCGTTTGAATATTTG-3’
下游引物(P183):5’-GCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAAGGCC-3’
用于扩增mCherry基因片段的引物为：
上游引物(P184):5’-CCCGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3’
下游引物(P185):5’-GGGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCAT-3’
实施例11光敏转录因子在大肠杆菌细胞中对目的基因表达的调节
将实施例中构建的多种含光敏转录因子的质粒与以mCherry为报告基因的报告质 粒共转化相应的菌株，对不同光敏转录因子在光刺激后对目的基因表达的调控效果进 行检测。
首先是检测含不同连接肽的LexA(1-87)-VVD36(C71V)光敏转录因子在光刺激 后对目的基因表达的调控，将实施例7中构建的pB-colE-mCherry与实施例2中构建 的pLV-Ln(n＝0、1、2、3、4、5、6、7)分别共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，对样 品光照前后mCherry表达量的差异。其中，与pB-colE-mCherry共转化的pCDFDuet1 是不含光敏转录因子的空载体的对照，用来观察光照对细菌生长以及蛋白质表达的影 响。结果显示，不含光敏转录因子的样品，不论黑暗还是光照，其表达量均在很高的 水平上，说明光照本身对细菌蛋白质的表达几乎没有影响。而以上含不同接头肽的的 光敏转录因子，经光诱导后细胞中mCherry的表达量大大下降，明显低于黑暗组样品 的荧光值，表明这些光敏转录因子在光的调控下可以调节大肠杆菌细胞中目的基因的 表达。具体地，pLV-L0光照组的目的基因的表达量为黑暗组的1/13,pLV-L4光照组的 目的基因的表达量为黑暗组的1/32，其他的具有不同连接肽的重组光敏转录因子也都 具有较好的光照抑制mCherry表达的效果（图13）。
为了检测将表达光敏转录因子的启动子由T7的本底表达换成Amp启动子后的效 果，将实施例3中构建的pALV-Ln(n＝0、1、2、3、4、5、6、7)与实施5中构建的 pB-colE-mCherry报告质粒共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，按照具体实施方式七 的方法对样品光照前后mCherry表达量的差异。其中，与pB-colE-mCherry共转化的 pCDFDuet1是不含光敏转录因子的空载体的对照，用来观察光照对细菌生长以及蛋白 质表达的影响。申请人的结果显示，相对于T7的本底表达，换用Amp启动子后，所 有的样品均显示出更好的光照抑制效果。具体地，pALV-L0光照组样品相对于其黑暗 组样品显示出150倍的抑制效果，pALV-L4也显示出50多倍的抑制效果（图14）。
为了检测重组光敏转录因子对LacZ基因表达的调控效果，将实施例7中构建的 pB-colE-LacZ质粒与实施例3中构建的pALV-L0共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株， 按照具体实施方式八的方法对样品光照前后LacZ表达量的差异进行检测。从申请人的 结果可以看出，相对于黑暗条件下的样品，光照之后LacZ的表达水平下降了126倍（图 15）。
为了检测其他三种含LexA相对应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单 元的原核细菌表达载体的效果，将实施例7中构建的pB-sulA-mCherry、 pB-umuDC-mCherry、pB-RecA-mCherry三种质粒分别与pALV-L0共转化 JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，以pCDFDuet1空载体作为对照，按照具体实施方式七的 方法对样品光照前后mCherry表达量的差异。从申请人的结果可以看出，相对于colE 启动子，sulA、umuDC、RecA三种启动子所对应的靶转录单元对光敏转录因子在光照 条件下的响应减弱很多，具体地说，sulA和umuDC的光抑制mCherry表达效果不到3 倍，而RecA的光抑制效果也只有5倍（图16）。
为了检测第二多肽为VVD突变体的光敏转录因子相对于之前LV-L0的光诱导基 因表达的效果如何，将实施例4中构建的pALV-L0(N56K)、pALV-L0(Y50W)、 pALV-L0(N56K C71V)、pALV-L0(I52A C71V)、pALV-L0(I52S C71V)和pALV-L0(N56R C71V)以及pALV-L0分别与实施例7中构建的pB-colE-mCherry报告质粒共转化共转 化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，按照具体实施方式七的方法对样品光照前后mCherry 表达量的差异。从申请人的结果可以看出，VVD(C71V)和VVD(N56K C71V)的效果相 对于其他的突变体来说有着更高的抑制倍数，考虑到VVD(C71V)样品的mCHerry表 达量在光照条件下更低，因此选择VVD(C71V)突变体作为后续实验的光敏转录因子的 第二多肽（图17）。
为了检测第一多肽为cI、LacI、Gal4、和TetR的光敏转录因子在光照射时对目 的基因表达的调节，将实施例5中构建的pACV、pALaV、pAGV和pATV质粒分别 与实施例7中构建的含相应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细 菌表达载体共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，以pCDFDuet1空载体作为对照，按 照具体实施方式七的方法对样品光照前后mCherry表达量的差异。从结果可以看出， 重组光敏转录因子CV会导致mCherry的的表达量在光照条件下降低到黑暗条件下的 一半，其他的三种重组光敏转录因子LaV、GV和TV会导致mCherry的表达量在光照 条件下降到黑暗条件下的60%-70%，也均是具有光可调控性的（图18）。
为了检测第二多肽为phot1-LOV2、aurochrome的LOV结构域的光敏转录因子在 光刺激后对目的基因表达的调节，将实施例4中构建的pALA和pALAu分别与实施例 7中构建的pB-colE-mCherry报告质粒共转化共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，按 照具体实施方式七的方法对样品光照前后mCherry表达量的差异。从结果可以看出， AsLOV2为第二多肽的重组光敏转录因子在黑暗条件下有着更强的抑制效果，而以 AulOV为第二多肽的重组光敏转录因子在光照条件下对mCherry的表达量显示出更高 的抑制倍数（图19）。
为了为了检测第三多肽为ω因子的光敏转录因子在光刺激后对目的基因表达的 调节，将实施例6中构建的pAωLV、pAωCV、pAωLaV、pAωGV和pAωTV质粒分别 与实施例8中构建的含相应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细 菌表达载体共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-,ω-)菌株。按照具体实施方式七的方法对样 品光照前后mCherry表达量的差异。从结果可以看出，重组光敏转录因子ωLV在光照 条件下可以激活mCherry5倍的表达量，ωCV和ωGV在光照条件下可以激活mCherry 近2倍的表达量，ωLaV和ωTV也有一定的光激活性（图20）。
为了为了检测第三多肽为α因子的光敏转录因子在光刺激后对目的基因表达的调 节，将实施例6中构建的pALVα、pACVα、pALaVα、pAGVα和pATVα质粒分别与 实施例8中构建含相应反应元件和mCherry荧光蛋白基因的靶转录单元的原核细菌表 达载体共转化BL21(sulA-,LexA-,ω-)菌株。按照具体实施方式七的方法对样品光照前后 mCherry表达量的差异。从申请人的结果可以看出，重组光敏转录因子LVα在光照条 件下可以激活mCherry4倍的表达量，CVα、LaVα和GVα在光照条件下可以激活 mCherry近2倍的表达量，TVα也有一定的光激活性（图21）。
为了检测不同培养温度对光敏转录因子调节目的基因的表达效果如何，将实施例 3中构建的pALV-L0与实施例7中构建的pB-colE-mCherry报告质粒共转化共转化 JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，分别在18℃、25℃、30℃和37℃四个温度条件下进行培 养，检测样品光照前后mCherry表达量的差异。从结果可以看出，在18℃时，无论是 光照还是黑暗条件下，重组光敏转录因子LV-L0对mCherry表达的抑制都很大，而37 ℃时的情况则是相反的，无论是光照还是黑暗条件，重组光敏转录因子LV-L0对 mCherry的表达均没有社么影响，因此，在这两种温度条件下LV-L0对mCherry的表 达是不具有光可调控性的。在25℃和30℃下，重组光敏转录因子LV-L0对mCherry 的表达具有很好的光照抑制效果，考虑到细菌的生长速度，因此以后的检测均是选择 在30℃的温度条件下进行（图22）。
为了检测光敏转录因子对以cI阻遏蛋白为间接调控作用的原核细菌表达载体中 mCherry表达量在光照前后的差异，将实施例9中构建的pB-colE-cI-Pλo12-mCherry载 体与实施例3中pALV-L0共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，以pCDFDuet1空载体 作为对照，按照具体实施方式七的方法检测样品光照前后mCherry表达量的差异，从 结果可以看出，在光照条件下，重组光敏转录因子LV-L0可以激活mCherry的表达量 50多倍，说明通过CI蛋白接到间接作用调控模式还是具有很好的光调控mCherry的 表达量的（图23）。
为了检测含光敏转录因子和靶转录单元的单表达载体在光照前后mCherry表达量 的差异，将实施例10中构建的pD-colE-mCherry-Amp-LV质粒转化 JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，以pCDFDuet1空载体作为对照，按照具体实施方式七的 方法检测样品光照前后mCherry表达量的差异，从结果可以看出，含光敏转录因子和 靶转录单元的单表达载体，载体本身就可以表达重组光敏转录因子LV-L0，并能够很 好的调控载体自身含有的靶转录单元上的mCherry的表达量，并且免去了两个质粒同 时转化的麻烦，将具有更为重要的应用前景（图24）。
为了检测含光敏转录因子和靶转录单元的枯草芽孢杆菌质粒在光照前后mCherry 表达量的差异，将实施例10中构建的pHT01-LaV(wt)-Pgrac-mCherry质粒转化枯草芽孢 杆菌WB800，以pHT01载体为空白对照。分别在光照和黑暗条件下检测mCherry的 表达量。从结果可以看出，在枯草芽孢杆菌细胞内，重组光敏转录因子LaV(wt)在光 照条件下抑制mCherry的表达，抑制倍数近3倍（图25）。
为了检测JM109(DE3,sulA-，LexA::Amp-LV-L0)菌株自身表达光敏转录因子对 mCherry表达量的调控效果，将实施例7中构建的pB-colE-mCherry质粒转化 JM109(DE3,sulA-，LexA::Amp-LV-L0)菌株，以pRSETb载体为对照，按照具体实施方 式七的方法检测样品光照前后mCherry表达量的差异。从结果可以看出，在不需要外 源导入质粒表达重组光敏转录因子的情况下，菌株自身表达光敏转录因子可以在光照 条件下抑制mCherry的表达，抑制倍数有近5倍（图26）。
实施例12光照诱导的目的基因的表达的特点
为了检测光诱导的光敏转录因子调节目的基因表达的时间动力学及是否可逆，将 实施例3中构建的pALV-L0与实施例7中构建的pB-colE-mCherry报告质粒共转化共 转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株，从转化板上挑取单克隆到48孔板中培养，总共分 为6组，每组4个孔，30度光照培养过夜。第二天按照1:100稀释到含新鲜LB的两 块48孔板中，分别标记为A板和B板。对于A板，将其置于光照下培养，分别在3h、 5h、7hh时间点取样测定mCherry的表达量，且在每次测定点时，将其中的一组样品 由光照转移到黑暗条件下（B板剩余的孔中）培养，直至最后一个时间点。对于B板， 将其置于黑暗条件培养，分别在3h、5h、7h时间点取样测定mCherry的表达量，且在 每次测定点时，将其中的一组样品由黑暗转移到光照条件下（A板剩余的孔中）培养， 直至最后一个时间点。最后对每个时间点的mCherry表达水平的平均值进行作图，申 请人的结果显示，对于一开始处于光照的样品来说，mCherry的表达是受到很大抑制 的；当将其转移到黑暗条件下时，mCherry表达的抑制效果逐渐减弱，其表达量逐渐 增加，图上的曲线则显示出缓慢的上升过程(图27)。对于一开始处于黑暗的样品来说， mCherry的表达是不受到抑制的，具有很高的表达量，但当把其转移到光照条件下时， mCherry的表达逐渐的受到抑制，图上显示本来上升的曲线，其上升的趋势逐渐放缓， 直至趋于水平（图28）。从这些结果可以看出，重组光敏转录因子对目的基因表达的 调控是一个可逆的过程。
为了检测光诱导的光敏转录因子在不同光照量的条件下对目的基因表达的调节 作用，以mCherry为例将实施例3中构建的pALV-L0与实施例7中构建的 pB-colE-mCherry报告质粒共转化共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株。从转化板上挑 取单克隆到48孔板中培养，总共分为6组，每组4个孔，30度光照培养过夜。第二 天按照1:100稀释到含新鲜LB的6块48孔板中，其中5块在光照条件下培养，光照 的强度分别为0.125mW/cm2、0.063mW/cm2、0.031mW/cm2、0.016mW/cm2、和 0.009mW/cm2（用日本和光公司光度计测定该光照强度），还有一块置于黑暗条件下 培养。18h后测定mCherry的表达水平。从结果可以看出，重组光敏转录因子对mCherry 表达的调控是受到光强依赖的，随之光强的逐渐增强，其对mCherry表达的抑制效果 越明显。同时我们也可以看到，即使是非常弱的光也能让重组光敏因子LV-L0发挥很 好的调控作用（图29）。
为了研究光敏转录因子在空间上对目的基因表达的调节，我们以mCherry为报告 基因，实施例3中构建的pALV-L0与实施例7中构建的pB-colE-mCherry报告质粒共 转化共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株。从转化板上挑取单克隆到含5ml新鲜培养基 的试管中光照培养过夜，第二天4000rpm离心收菌，利用200μl新鲜培养基重悬，测 定其OD600值。配制含1%琼脂、0.5%蛋白胨、0.25%酵母提取粉和0.5%NaCl的 固体培养基，经高温高压灭菌后待冷却至45度左右时，加入上述重悬的菌以及相应的 抗性后，保证固体培养基中菌的起始OD值为0.03，摇匀后倒直径为90mm的培养皿。 待培养基凝固后，我们以图案“Stop”为例，将Stop以背景为黑色字为白色的图案打印 出来，光度计测量发现黑色背景的透光率低于透明位置的三十分之一。我们将大小合 适的打印出的图案粘贴在培养皿的下方。光照培养24h后，用Kodak公司的活体成像 仪进行拍照（激发光波长为600nm,发射光波长为670nm），4x4binning，曝光时间为 30s。由于LV-L0光照后会使mCherry的表达量下调。从结果来看，左侧为我们设计 的图案，右侧的内侧圆圈为细胞的荧光图像，可以看出细胞的荧光图像与打印出的图 案几乎一致，我们也将此当成给细胞进行“拍照”（图30），这是一个在空间上调节目 的基因的很好的案例。
实施例13.光敏转录因子对大肠杆菌移动能力的调节
检测光敏转录因子对大肠杆菌Swimming的调节是在含一种特殊的半固体培养基 上进行的。配制含1%Trptone、0.5%NaCl和0.25%Agar的半固体培养基，经高温高 压灭菌后，待冷却到50度以下时加入相应的抗性混匀，利用90mm培养皿进行倒板， 每块板倒以上培养基10ml，室温下放置1h。将实施例3中构建的pALV-L0和实施例 9中构建的pB-colE-cI-PλO12-CheZ质粒共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-,CheZ-)菌株,从转 化板上挑取单克隆到试管中黑暗培养过夜，第二天按照1:200的比例稀释到新鲜培养 基中继续黑暗培养。待OD600为0.1-0.2时，吸取2μl的菌液滴到上述倒的半固体培 养板中，于30度中光照培养。黑暗对照的样品，利用锡箔纸包起来后于同样的环境培 养。48h后利用KODAK invivo活体成像仪对平板进行成像。从结果可以看出，在黑 暗条件下光敏转录因子LV-L0不会对CI的表达产生抑制作用，这样一来大量的CI会 紧密的抑制CheZ的表达，没有CheZ的细菌就不会发生位置上的移动，体现在不会形 成向外扩散的圈。相反的，在光照条件下，重组光敏转录因子LV-L0就会抑制CI的 表达，从而使得PλO12启动子的活性不受影响，CheZ得到表达，如此一来细菌就会发 生位置上的移动，表现为由开始的菌斑向四周扩散开去（图31）。
实施例14光敏转录因子调节大肠杆菌的裂解
为了研究光敏转录因子调节大肠杆菌的裂解，将实施例3中构建的pALV-L0和 实施例9中构建的pB-colE-cI-PλO12-SRRz质粒共转化JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株。从 转化好的平板上挑取单克隆到试管中30度黑暗培养，第二天按照1:100稀释到新鲜培 养基中继续黑暗培养。待OD达到0.4-0.6时，加入1mM IPTG黑暗条件下诱导基因 组上LacZ的表达。诱导1.5h后，将样品转移到光照条件下诱导SRRz基因簇的表达， 培养6h后4000rpm离心，分别测定上清和沉淀菌体中LacZ的活性大小，计算出上 清中LacZ活性占上清和沉淀中LacZ总活性的百分比。作为对照，黑暗样品除了一直 在黑暗条件下，其他的处理方法和光照的样品一致。从结果看出，在光照条件下，重 组光敏转录因子LV-L0就会抑制CI的表达，从而使得PλO12启动子的活性不受影响， SRRz基因簇的S、R和Rz基因高水平表达，从而介导75%的细菌发生裂解，细胞内 部的β-半乳糖苷酶（LacZ）就会释放到培养基中，而黑暗状态下只有10%的细菌发生 裂解（图32）。
实施例15利用该原核细菌光诱导基因表达系统大量表达Ero1巯基氧化酶
由于细菌繁殖快、培养成本低且能大量表达人们所需要的外源蛋白，因此，我们 选择利用该原核细菌光诱导基因表达系统大量表达Ero1巯基氧化酶。将实施例9中构 建的pB-colE-mCherry-PλO12-Ero1质粒与实施例3中构建的pALV-L0共转化 JM109(DE3,sulA-,LexA-)菌株。从转化板上挑取单克隆到含5ml新鲜LB培养基的试管 中培养过夜，第二天一早接到含100ml新鲜LB的锥形瓶中37℃二级培养。待OD为 0.8时，将其再次转接到含500ml新鲜LB的锥形瓶中培养，共9瓶，于25℃黑暗培 养。待OD为0.6时，利用蓝色LED灯光照培养，培养18h后4000rpm收菌后弃上 清，利用Buffer A(0.02M磷酸钠，10mM咪唑，0.5M氯化钠，PH为7.2)重悬菌体。 对重悬后的菌体超声破碎，破碎的条件为：功率P＝40%，超1s停4s，每个循环300s， 共5个循环。10000rpm4℃低温离心30min，取上清。利用GE HisTrap HP(5mL)预 装镍柱对离心后上清上样，上样的流程为：GE HisTrap HP→使用蠕动泵控制流速为 1mL/min，先用去离子水洗去柱子中的乙醇→用50mL Buffer A平衡柱子→上样超声离 心后的上清液约100mL，流速同样为1mL/min。使用AKTA prime进行梯度洗脱，洗 脱程序主要如下（流速为1ml/min）：
（1）先利用10mL Buffer A洗脱；
（2）接下来的50ml洗脱液中，逐渐增加Buffer B（0.02M磷酸钠，500mM咪唑， 0.5M氯化钠，PH7.2）的含量，由0%Buffer到100%Buffer B。
（3）利用20ml100%Buffer B洗去柱子上所有的蛋白；
（4）接下来的20ml洗脱液，逐渐降低Buffer B的含量，由100%Buffer到0% Buffer B；
（5）利用50ml去离子水清洗柱子；
（6）利用20ml20%乙醇清洗柱子。
在ExPASy网站上查到Ero1的等电点为4.8，利用阴离子交换柱进行离子交换层 析。先取经亲和柱纯化的Ero1蛋白溶液，利用HitrapTM QFF5mL柱子进行离子交换 纯化，实验流程为：亲和层析纯化的Ero1蛋白→利用Buffer A(20mM磷酸钠，10mM 氯化钠，PH为7.2)稀释10倍→以1mL/min的流速上样HitrapTM QFF5mL柱子→Buffer A洗杂50mL→利用AKTA purifier洗脱。洗脱程序主要如下（流速为1ml/min）：
（1）先利用10mL Buffer A洗脱；
（2）接下来的25ml洗脱液中，逐渐增加Buffer B（20mM磷酸钠，500mM氯化 钠，PH为7.2）的含量，由0%Buffer到100%Buffer B。
（3）利用20ml100%Buffer B洗去所以的蛋白；
（4）接下来的20ml洗脱液，逐渐降低Buffer B的含量，由100%Buffer到0% Buffer B；
（5）利用50ml去离子水清洗柱子；
（6）利用20ml20%乙醇清洗柱子。
AKTA purifier的离子交换柱洗脱结果如图33所示。取部分管进行12%SDS-PAGE 鉴定纯化效果（图34），选取其中纯度较高的一些管合并。对最终的合并液再次进行 12%SDS-PAGE蛋白电纯度鉴定，从结果可以看出，得到的Ero1蛋白的纯度很高，达 到96%（图35）。利用Brandford定蛋白法测定最终得到25mg。
应该理解，在实施例或实验材料方法中所显示的成分用量、反应条件等数字或是 本说明书所使用的其它参数均为近似值（除非特别注明），可根据所需要获得的结果 而加以改变。并且，这些参数并非用来限定本发明保护范围，而是应用正常的操作技 术下所得到的较佳数据。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语术语与本 领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料 及均可以应用于本发明中。文中本说明书中所述的较佳实验方法与材料仅作为示范之 用。本说明书提及的所有文献都全文引入作为参考。此外应该理解，在阅读了本发明 的上述内容后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同 样落在本申请所附权利要求书所限定的范围内。
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机译： 利用原核细菌光诱导基因表达系统和调控基因表达的方法
机译： 利用原核细菌光诱导基因表达系统和调控基因表达的方法
机译： 利用原核细菌光诱导基因表达系统和基因表达调控的方法
